利用高分辨熔解曲线分析技术检测线粒体乙醛脱氢酶基因分型的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测线粒体乙醛脱氢酶基因分型的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：采用硅胶吸附法抽提被测者口腔上皮细胞/外周血细胞样本的基因组DNA，设计包含目标位点的检测引物，根据高分辨熔解曲线分析技术对PCR扩增后的基因序列进行位点分型。本发明灵敏度高、特异性好，检测速度快，可用于评估硝酸甘油类药物对治疗个体心绞痛的有效性。
【专利说明】利用高分辨熔解曲线分析技术检测线粒体乙醛脱氢酶基因分型的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种线粒体乙醛脱氢酶基因分型的检测方法，属于分子生物学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]舌下含服硝酸甘油是处理急性心绞痛的标准治疗方法。其药理机制是硝酸甘油经过代谢后产生1，2- 二硝酸甘油，同时释放出有扩张血管活性的物质一氧化氮，一氧化氮通过增加细胞内环磷酸鸟苷(cGMP)的含量而松弛血管平滑肌，缓解心肌缺血，降低心脏前后负荷，从而缓解心绞痛症状。
[0003]线粒体乙醛脱氢酶(ALDH2)定位于12q24.2，全长43.4kb，含13个外显子，编码518个氨基酸。其主要功能是在肝脏内将乙醇代谢产物乙醛进一步脱氢成为乙酸，进入外周组织的三羧酸循环，分解产生C02和水。近来研究发现，ALDH2在硝酸甘油的生物转化过程中起重要作用，是使硝酸甘油活化并释放一氧化氮的关键酶，具有酯酶活性，能特异性代谢硝酸甘油产生1，2- 二硝酸甘油、亚硝酸盐和一氧化氮，实现血管扩张。研究显示硝酸甘油介导的血管扩张是cGMP依赖的，在体内外均能够被ALDH2抑制剂阻滞，而非cGMP依赖的血管扩张并不被影响；在受到硝酸甘油抑制的组织中，ALDH2的酶活性明显下降甚至完全失活，提示硝酸甘油耐受可能与线粒体乙醛脱氢酶功能缺失有关。
[0004]ALDH2第12外显 子存在一个G/A单核苷酸多态，直接导致第504位谷氨酸被赖氨酸替代(Glu504Lys)，突变的蛋白基本丧失了酶活性。这个单核苷酸多态在包括中国人群的亚洲人群中的等位基因频率最高，约30%，等位基因G的纯合子(标记为ADLH2*1 /ALDH2*I)所编码的蛋白具有正常的酶活性，而杂合子(标记为ALDH2*1 /ALDH2*2)和等位基因A的纯合子(标记为ALDH2*2 /ALDH2*2)所编码的蛋白酶活性异常。在舌下含服硝酸甘油治疗心绞痛临床疗效与个体线粒体乙醛脱氢酶基因型的关联分析研究中发现80人中有59人对硝酸甘油有效(73.7%)，其中等位基因G纯合子的个体有效率(47人中有40人，85.1%)要比至少携带一个等位基因A的个体有效率(33人中有19人，57.6%)高，比数比为4.21 (99%可信区间，1.5ril.7)。结果显示舌下含服硝酸甘油治疗心绞痛与线粒体乙醛脱氢酶基因型显著相关(X 2=7.59，p=Q.006)，经过性别、年龄和疾病严重程度等因素校正之后仍然显著相关。且在硝酸甘油药物代谢过程中杂合子和纯合子突变型ALDH2相较于野生型ALDH2而言，Km值升高，Vmax值显著降低，ALDH2 Glu504酶的催化效率比Lys504高出10倍，提示这个Lys504多态能够影响ALDH2的酶活性，降低硝酸甘油的生物转化能力。由此可见，线粒体乙醛脱氢酶Glu504Lys能够影响硝酸甘油生物活性的转化，通过对个体ALDH2基因Glu504LyS位点的基因型进行检测，可以用于评估硝酸甘油类药物对治疗个体心绞痛的有效性。
[0005]目前普遍应用的基因分型检测方法为Taqman探针法和DNA直接测序法。Taqman荧光探针两端分别标记报告基团和淬灭基团，探针在未与目标序列结合保持完整时，荧光报告基团和淬灭基团没有分离，荧光信号被淬灭基团吸收，不能受激发出荧光；PCR扩增时，完全互补配对后由Taq酶所具有的5’_3’外切酶活性将探针酶切降解，荧光报告基团和淬灭基团分离，荧光检测系统可以接到荧光信号，实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。如果探针与目标序列存在错配碱基，就会大大减少探针与目标序列结合的紧密度及Taq酶5’端外切酶的活性，影响探针的荧光释放量，使带有不同碱基的DNA序列得以鉴定。这种方法步骤少，不易污染，便于对大样本进行分型；但对引物设计有一定的限制，对于SNP附近的序列有一定要求，受突变碱基位点与类型局限。DNA直接测序法能直接提供准确的碱基信息，被当成突变检测的金标准，但存在费时费力，成本较昂贵，不适用于对大量样本进行检测等缺点。
[0006]本发明应用一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法——高分辨熔解曲线(High resolution melting, HRM)分析技术。其原理是根据DNA序列的长度、GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，饱和性荧光染料高浓度占据双链DNA所有碱基对，当双链DNA局部解链时，荧光染料释放，荧光强度的降低精准可靠地反映出DNA分子的解链情况。HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，采用新型饱和染料更易于检测单碱基突变、小片段插入或缺失。该方法与其他遗传分型技术相比，操作简单，具有灵敏度高、特异性好、成本低、快速、高通量检测等优点，结果准确，且实现了真正的闭管操作。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种简单易行的线粒体乙醛脱氢酶基因分型的检测方法。
[0008]为了达到上述目的，本发明提供一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测线粒体乙醛脱氢酶基因分型的方法，其特征在于，具体步骤为:
第一步:采用硅胶吸附法抽提被测者口腔上皮细胞/外周血细胞样本的基因组DNA，采用电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，待测样本浓度标化到lOng/ul ;已知ALDH2 Glu504Lys位点基因型为GG的样本DNA为阴性对照，基因型为AA的样本DNA为阳性对照1，基因型为AG的为阳性对照2。
[0009]第二步:用无菌水配制浓度为lOumol/L的ALDH2基因正向引物溶液以及浓度为lOumol/L的ALDH2基因反向引物溶液；ALDH2基因正向引物的序列为:5 ' - GATGTGTTTGGAGCCCAGTC -3 '，ALDH2 基因反向引物的序列为:5 '-CAGGTCCCACACTCACAGTTT -3'。
[0010]第三步:在每一个PCR反应孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul和第二步所得的ALDH2基因正向引物溶液0.5ul、ALDH2基因反向引物溶液0.5ul，然后在不同的PCR反应孔中分别加入第一步得到的检测样品、阴性对照品及阳性对照品各2ul，用灭菌重蒸馏水补足15ul ;在Rotor-Gene Q上进行反应，PCR反应条件为92_97°C变性5_15分钟，92-97°C变性 10-30 秒，57-65°C退火 10-30 秒，70-75°C 延伸 10-30 秒，30-50 个循环；HRM 反应条件:92-97°C变性I分钟，40°C复性I分钟，初始熔解温度60-65°C开始程序升温熔解至95 0C，过程中实时监测荧光信号，30-50次每秒。
[0011]第四步:应用Rotor-Gene Q软件分析HRM结果,通过标准曲线基于曲线偏移(纯合子)和曲线形状变化(杂合子)展现不同的基因型。定义已知样本基因型后，软件会自动调出所有检测样本的基因型。
[0012]本发明对ALDH2基因Glu504Lys位点的基因型进行检测，可用于评估硝酸甘油类药物对治疗个体心绞痛的有效性。
[0013]本发明基于HRM分析技术，无需序列特异性探针，采用新型饱和染料，操作简单，不仅具有灵敏度高、特异性好、成本低、检测速度快、高通量等优点，而且分辨率高，全部反应在封闭的反应管中完成，有效避免了交叉污染。
[0014]
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为本发明实施例PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为本发明实施例样本阴性对照的测序图；
图3为本发明实施例样本阳性对照I的测序图；
图4为本发明实施例样本阳性对照2的测序图；
图5为本发明实施例大样本的HRM标准曲线图；
图6为本发明实施例大样本的HRM差异曲线图。
【具体实施方式】
[0016]以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例
[0017]1、采用硅胶吸附法抽提被测者口腔上皮细胞基因组DNA，电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，待测样本浓度标化到lOng/ul ；
阴性对照DNA符合以下条件时视为合格:0D值A260/A280在1.8-2.0之间；电泳条带清晰；测序鉴定ALDH2 Glu504Lys位点基因型为GG，测序结果如图2所示；
阳性对照I DNA符合以下条件时视为合格:0D值A260/A280在1.8-2.0之间；电泳条带清晰；测序鉴定ALDH2 Glu504Lys位点基因型为AA，测序结果如图3所示；
阳性对照2 DNA符合以下条件时视为合格:0D值A260/A280在1.8-2.0之间；电泳条带清晰；测序鉴定ALDH2 Glu504Lys位点基因型为AG，测序结果如图4所示。
[0018]2、根据ALDH2基因的保守区域，采用在线软件Primer 3设计引物，确定最佳引物为18-24bp大小，PCR产物长度70-150bp，目标位点周边位置避免其他SNP位点(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。用无菌水配制浓度为lOumol/L的ALDH2基因正向引物溶液以及浓度为lOumol/L的ALDH2基因反向引物溶液；ALDH2基因正向引物的序列为:5 ' - GATGTGTTTGGAGCCCAGTC -3 '，ALDH2基因反向引物的序列为:5 '-CAGGTCCCACACTCACAGTTT -3'。
[0019]3、在每一个PCR反应孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul (QIAGEN公司生产，包括2 X HRM PCR Master ]\^1、10\?0?缓冲液、0-801111:;[0114￥36代611 Dye、HotStarTaqDNA聚合酶)和步骤2所得的ALDH2基因正向引物溶液0.5ul、ALDH2基因反向引物溶液
0.5ul，然后在不同的PCR反应孔中分别加入步骤I得到的检测样品、阴性对照品及阳性对照品各2ul，用灭菌重蒸馏水补足15ul ;在1?於01-66116 Q上进行反应，PCR反应条件为95°C变性10分钟，95 °C变性10秒，57 °C退火10秒，72 °C延伸10秒，40个循环；HRM反应条件:95°C变性I分钟，40°C复性I分钟，初始熔解温度65°C开始程序升温熔解至95°C，过程中实时监测荧光信号，40次每秒。 [0020]4、应用Rotor-Gene Q软件分析HRM结果，如图5所示，在10例口腔粘膜上皮细胞提取的DNA检测中，有6例ALDH2 Glu504Lys位点基因型为GG，3例基因型为AG，I例基因型为AA。
【权利要求】
1.在一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测线粒体乙醛脱氢酶基因分型的方法，其特征在于，具体步骤为: 第一步:采用硅胶吸附法抽提被测者口腔上皮细胞/外周血细胞样本的基因组DNA，电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，待测样本浓度标化到10ng/ul ;已知ALDH2Glu504Lys位点基因型为GG的样本DNA为阴性对照，基因型为AA的样本DNA为阳性对照1，基因型为AG的为阳性对照2; 第二步:用无菌水配制浓度为lOumol/L的ALDH2基因正向引物溶液以及浓度为lOumol/L的ALDH2基因反向引物溶液；ALDH2基因正向引物的序列为:5 ' - GATGTGTTTGGAGCCCAGTC -3 '，ALDH2 基因反向引物的序列为:5 '-CAGGTCCCACACTCACAGTTT -3'; 第三步:在每一个PCR反应孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul和第二步所得的ALDH2基因正向引物溶液0.5ul、ALDH2基因反向引物溶液0.5ul，然后在不同的PCR反应孔中分别加入第一步得到的检测样品、阴性对照品及阳性对照品各2ul，用灭菌重蒸馏水补足15ul ;在Rotor-Gene Q上进行反应，PCR反应条件为92_97°C变性5-15分钟，92_97°C变性10-30秒，57-65 °C退火10-30秒，70-75 °C延伸10-30秒，30-50个循环；HRM反应条件:92-97°C变性I分钟，40°C复性I分钟，初始熔解温度60-65°C开始程序升温熔解至95°C，过程中实时监测荧光信号，30-50次每秒； 第四步:应用Rotor-Gene Q软件分析HRM结果，通过标准曲线基于曲线偏移(纯合子)和曲线形状变化(杂合子)展现不同的基因型；定义已知样本基因型后，软件会自动调出所有检测样本的基因型。`
【文档编号】C12Q1/68GK103525904SQ201310288926
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年7月11日 优先权日:2013年7月11日
【发明者】傅咏南, 张奕, 王校, 毛丹丹 申请人:上海中优医药高科技有限公司