生产d-乳酸的重组大肠杆菌及其应用的制作方法

生产d-乳酸的重组大肠杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及通过大肠杆菌发酵生产D-乳酸的领域。具体而言，本发明提供了一种含有突变的ldhA基因的大肠杆菌。本发明还涉及使用所述经工程化的重组大肠杆菌用于生产D-乳酸的用途，及使用所述经工程化的重组大肠杆菌生产D-乳酸的方法。在本发明生产D-乳酸的方法中，可以在高温下(42-50℃)进行发酵。在本发明生产D-乳酸的方法中，可以在发酵过程中使用氨水或者氢氧化钠作为中和剂。CGMCC No76782013.06.04CGMCC No76792013.06.04CGMCC No78712013.07.03
【专利说明】生产D-乳酸的重组大肠杆菌及其应用 发明领域
[0001] 本发明涉及通过大肠杆菌发酵生产D-乳酸的领域。具体而言，本发明提供了一种 用于生产D-乳酸的经工程化的重组大肠杆菌。本发明还涉及使用所述经工程化的重组大 肠杆菌用于生产D-乳酸的用途，及使用所述经工程化的重组大肠杆菌生产D-乳酸的方法。
[0002] 发明背景
[0003] D-乳酸为手性小分子，是合成多种手性物质的前体，在医药、农药、化工等方面的 应用十分广泛。以D-乳酸为原料合成的D-聚乳酸，具有生物可降解性，是理想的绿色高分 子材料：可代替由聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯等材料生产新型环保包装材料；可代替硅橡 胶、硅油等传统的医用材料制作骨内固定物和医用手术缝合线等医用材料；用于纺织行业， 制成手感好、滑爽性强并富有光泽的内衣；以D-乳酸为原料合成乳酸酯类用于香料、树脂 涂料、胶黏剂及印刷油墨等的生产；用于制造优良除草剂：骠马（Puma Super)、威霸（Whip Super ;德国 Hoechst 公司）、DuplosanR (德国 BASF 公司）。
[0004] D-乳酸的制备方法主要有手性拆分法、酶转化法和直接发酵法。由于手性拆分法 和酶转化法存在污染环境，成本昂贵等问题，目前D-乳酸的大规模化生产大多采用微生物 发酵法。微生物发酵法生产D-乳酸，以其生产成本低，产品安全性高，成为大规模生产D-乳 酸的主要方法。生产高光学纯度的D-乳酸是微生物发酵法的主要制约因素。
[0005] 目前乳酸发酵菌株主要有两大类。第一类是天然产乳酸菌，主要是乳酸芽孢杆菌 (Lactobacillus)，由于具有耐酸性强，遗传改造后能生产高光学纯度的D-乳酸，因此是重 要的商业化菌株（Demirici et al. 1992, J Indust Microbiol Biotechnolll:23_28;0kano K et al 2009, Appl Environ Microbiol 75:462-467)。该生产菌的缺点是发酵过程需要 丰富培养基，不能利用五碳糖，提高了生产成本和下游分离纯化的成本。该类菌通常使用氢 氧化钙或碳酸钙作为中和剂来控制发酵PH，最终的发酵产物是乳酸钙。然而，乳酸钙在分离 提取的过程中通常需要加入硫酸，会产生大量的硫酸钙废物，难以处理。更重要的是，该类 菌生产的D-乳酸手性纯度通常都在98%以下，达不到聚乳酸生产的要求。
[0006] 另一类是通过代谢工程改造的工程菌，有酵母菌（Saccharomyces)，芽孢杆菌 (Bacillus),克氏菌（Kluyveromyces)和大肠杆菌（Escherichia)。这些改造的菌株都在某 些方面提高了乳酸生产的性能如扩大了底物利用的范围，减少了营养需求，或减少了质粒 或抗生素的使用等（Bianchi et al.2001, Appl Environ Microbiol67:5621_5625;Grabar et al. 2006, Biotechnol Lett 28:1527-153; Stewart et al. 2013, Yeast 30:81-91)。在微 生物发酵生产中，大肠杆菌（E.coli)由于其遗传背景清楚、易操作、易调控、易培养、生长 迅速、能够利用多种碳源及能以简单的无机盐培养基培养等优点，被广泛用于研究以获得 高产菌株。大肠杆菌在缺氧条件下，通常消耗糖或其衍生物，并发酵产生甲酸、乙酸、乳酸、 丁二酸、乙醇等产物。野生型大肠杆菌生产乳酸等的产率通常较低。近年来的研究表明，对 大肠杆菌的代谢途径进行遗传改造，可以获得乳酸高产菌株。同时改造大肠杆菌细胞使其 能够生产高光学纯度的D-乳酸是目前研究的重点和热点。
[0007] Zhou 等（Zhou et al. 2003, Applied Environ Microbiol 69:399-407)通过在大 肠杆菌W3110中敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因 pflB，富马酸还原酶基因 frdABCD，醇脱氢酶 基因 adhE和乙酸激酶基因 ackA，得到了重组大肠杆菌菌株SZ63能够在无机盐培养基中利 用5%的葡萄糖在168小时合成了 48g/L的D-乳酸，糖酸转化率接近2m〇l/m〇l，手性纯度 达到99%。Zhou等使用相同的策略，在大肠杆菌B菌株中构建了重组菌SZ186,并通过进化 代谢获得了 SZ194菌株。在无机盐培养基中利用12%的葡萄糖在72小时合成了 lllg/L的 D-乳酸，糖酸转化率接近2mol/mol，手性纯度达到95%(Zhou et al. 2005, Biotechnol Iett 27:1891-1896;Zhou et al. 2006,Biotechnol Lett 28:663-670)。
[0008] Grabar 等（Grabar et al. 2006, Biotechnol Lett 28:1527-1535)继续对 SZ194 菌株进行了改造，敲除了甲基乙二醛合成酶基因 mgsA得到了重组菌TG112,进一步进化代 谢获得TG114,在无机盐培养基中利用12%的葡萄糖在48小时合成了 118g/L的D-乳酸，光 学纯度达到99. 9%，葡萄糖转化率为0. 98g/g。
[0009] 上述这些工程化的大肠杆菌都是使用氢氧化钾作为中和剂。氢氧化钾在工业生产 时的成本较高，而氨水和氢氧化钠的成本要便宜很多。因此，需要发酵过程中需要使用氨水 或氢氧化钠作为中和剂来调节PH值的大肠杆菌。
[0010] 为了提高大肠杆菌生产D-乳酸的产量和/或转化率，需要进一步对大肠杆菌的代 谢途径进行改造。另外，为了在工业上减少细菌污染的可能，需要进一步对大肠杆菌的生理 性能进行优化，提高大肠杆菌生产D-乳酸的发酵温度。
[0011] 发明概述
[0012] 一方面，本发明提供了 一种用于生产D-乳酸的重组大肠杆菌。
[0013] 在一个实施方案中，本发明提供了一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌含有突 变的IdhA基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No. :1所示氨基酸序列中的R282的位置 上含有修饰，对应的位置是通过与SEQ ID No. :1进行序列比对而确定的。在一个优选的实 施方案中，所述大肠杆菌中所述突变的IdhA基因的表达增强、和/或所述突变的IdhA所编 码的蛋白质的活性增强。在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下的修饰：PflB 基因表达的抑制、和/或PflB基因所编码的蛋白质活性的抑制；frdAB⑶基因簇表达的抑 制、和/或frdABCD基因簇所编码的蛋白质活性的抑制。
[0014] 在一个实施方案中，本发明提供了一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌含有突 变的IdhA基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No. : 1所示氨基酸序列中的R282的位置 上含有修饰，其中在对应于R282的位置上的修饰是用C置换R，对应的位置是通过与SEQ ID No. :1进行序列比对而确定的。
[0015] 在一个实施方案中，本发明提供了一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌含有突 变的IdhA基因，其中所述突变的IdhA基因在对应于SEQ ID No. :2所示核苷酸序列中的 C844的位置上含有突变，对应的位置是通过与SEQ ID No. : 2进行序列比对而确定的。在一 个优选的实施方案中，所述大肠杆菌中所述突变的IdhA基因的表达增强、和/或所述突变 的IdhA基因所编码的蛋白质的活性增强。
[0016] 在一个实施方案中，本发明提供了一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌含有突 变的IdhA基因，其中所述突变的IdhA基因在对应于SEQ ID No. :2所示核苷酸序列中的 C844的位置上含有突变，并且其中所述突变是用T置换C，对应的位置是通过与SEQ ID No. :2进行序列比对而确定的。
[0017] 在另一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下的修饰：mgsA基因表达的抑 制、和/或mgsA基因所编码的蛋白质活性的抑制。
[0018] 在一个实施方案中，本发明提供了一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌含有突 变的IdhA基因，其中所述突变的IdhA基因位于质粒或染色体中。
[0019] 在第二方面，本发明提供了一种生产D-乳酸的方法，其中包括培养本发明的大肠 杆菌的步骤。
[0020] 在第三方面，本发明涉及本发明的大肠杆菌在生产D-乳酸中的用途。
[0021] 附图简述
[0022] 图1 :改造大肠杆菌获得重组菌株Dlac-006的示意图。X代表基因敲除，包括敲除 pflB、frd、mgsA 基因。
[0023] 图2 :菌株Dlac-002，Dlac-004，Dlac-006发酵生产D-乳酸的光学纯度。图2A为 D-乳酸标准品，图2B为L-乳酸标准品，图2C为乳酸混合物（D-乳酸光学纯度为99. 5%)， 图 2D 为 Dlac-002,图 2E 为 Dlac-004,图 2F 为 Dlac-006。
[0024] 图3 :Dlac-006经过520代进化获得菌株Dlac-012。
[0025] 图4 :Dlac-012在500mL发酵罐水平发酵生产D-乳酸的光学纯度。
[0026] 图5 :Dlac-012在5L发酵罐水平发酵生产D-乳酸。图5A为细胞生长、葡萄糖消 耗和D-乳酸生产情况。图5B为发酵所产D-乳酸的光学纯度。
[0027] 图6 :图6A示出了野生型IdhA基因以及突变的IdhA基因（IdhA*)的核苷酸序列 比对；图6B示出了野生型以及突变的IdhA基因（IdhA*)所编码的多肽的氨基酸序列比对。
[0028] 图7 :Dlac_014在500mL发酵罐水平发酵生产D-乳酸的光学纯度。
[0029] 图8 :Dlac-012经过360代进化获得菌株Dlac-206。
[0030] 图9 :Dlac-206在500ml发酵罐水平发酵生产D-乳酸。发酵温度为42度。图9A 为细胞生长、葡萄糖消耗和D-乳酸生产情况。图9B为发酵所产D-乳酸的光学纯度。
[0031] 发明详述
[0032] 除非另有说明，所有技术和科学术语都具有本领域所知的常见含义。所有专利、专 利申请、公开出版物、序列、以及其他公开材料均援引加入本文，除非另有说明。
[0033] -方面，本发明提供了一种重组大肠杆菌，其中含有突变的IdhA基因。
[0034] 如本文所用，术语"经工程化改造的重组大肠杆菌"、"工程化的大肠杆菌"和"重 组大肠杆菌"可互换使用，均是指经过修饰的大肠杆菌，其中所述的修饰可以是，例如，基因 表达的增强、基因表达的抑制、引入新的基因、引入突变的基因或者对基因进行突变等，其 中可以通过本领域常规的技术手段实现基因表达的增强或基因表达的抑制，例如基因的敲 除、改变基因的拷贝数、引入质粒、改变基因的启动子（例如使用强启动子或弱启动子）等。
[0035] 在一个实施方案中，本发明提供了一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌含有突 变的IdhA基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No. : 1所示氨基酸序列中的R282的位置 上含有修饰，对应的位置是通过与SEQ ID No. :1进行序列比对而确定的。在一个优选的实 施方案中，所述大肠杆菌中所述突变的IdhA基因的表达增强、和/或所述突变的IdhA所编 码的蛋白质的活性增强。
[0036] 如本文所用，术语"突变"具有本领域内常用的含义，是指在核苷酸序列中插入、添 力口、缺失、或者取代一或多个核苷酸，或者是指在多肽序列中插入、添加、缺失、或者取代一 或多个氨基酸。
[0037] 在一个实施方案中，本发明提供了一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌含有突 变的IdhA基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No. : 1所示氨基酸序列中的R282的位 置上含有修饰，其中在对应于R282的位置上的修饰是用C置换R，对应的位置是通过与SEQ ID No. :1进行序列比对而确定的。
[0038] 在一个实施方案中，本发明提供了一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌含有突 变的IdhA基因，其中所述突变的IdhA基因在对应于SEQ ID No. :2所示核苷酸序列中的 C844的位置上含有突变，对应的位置是通过与SEQ ID No. : 2进行序列比对而确定的。在一 个优选的实施方案中，所述大肠杆菌中所述突变的IdhA基因的表达增强、和/或所述突变 的IdhA基因所编码的蛋白质的活性增强。
[0039] IdhA 基因 （GenBank No:ACA77176. 1)编码 D-乳酸脱氢酶（D-Iactate dehydrogenase) (EC No: I. 1. 1.28)的基因。在本发明的一个实施方案中，所使用的初始大 肠杆菌菌株中的野生型IdhA基因的核苷酸序列如SEQ ID No. :2所示，其所编码的多肽的 氨基酸序列如SEQ ID No. :1所示。在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中所包含的突变 的IdhA基因含有对应于如下突变：C844T(参见图6A)，所述突变的基因含有SEQ ID No. : 4 所示的序列；而所述突变的IdhA基因所编码的多肽具有对应于如下突变的氨基酸置换： R282C(参见图6B)，所述突变的多肽含有SEQ ID No. :3所示的序列。
[0040] 本领域技术人员会意识到不同大肠杆菌菌株的IdhA基因序列可能与SEQ ID No. :2所示IdhA基因序列不完全等同，以及不同大肠杆菌菌株的IdhA基因所编码的多肽序 列可能与SEQ ID No. :1所示的多肽序列不完全等同。在本发明的某些实施方案中，所述突 变的IdhA基因中的突变位于对应于SEQ ID No. : 2的第844位的位置上。在本发明的某些 实施方案中，所述突变的IdhA基因所编码的多肽中的置换位于对应于SEQ ID No. :1的第 282位的位置上。
[0041] 在本发明中，"对应于" SEQ ID No. :1或SEQ ID No. : 2中某一特定位置的位置可 以通过序列比对而确定，包括如使用人工排列对比及通过使用众多可利用的排列对比程序 (例如BLASTP)以及本领域技术人员已知的其它方法。通过对比多肽或核苷酸序列，本领域 技术人员可以在适当的位置引入相应的突变，从而实现本发明的技术效果。另外，本领域技 术人员也可以使用保守和类似的氨基酸残基来置换相应位置上的氨基酸残基，或者在IdhA 基因序列中引入同义突变，而实现本发明的技术效果。
[0042] 在一个优选的实施方案中，所述大肠杆菌中所述突变的IdhA基因的表达增强、和 /或所述突变的IdhA基因所编码的蛋白质的活性增强。
[0043] 如本文所用，术语"基因表达增强"，其具有本领域内熟知的含义，是指基因表达强 度的增强，并导致基因转录后产生的mRNA数量的增加。基因表达增强可以通过如下方式 实现，例如但不限于：在基因前引入强启动子、增加基因的拷贝数、或者增强mRNA的稳定性 等。如本文所用，术语"基因所编码的蛋白活性增强"具有本领域内熟知的含义，是指基因 转录翻译后产生的蛋白活性的增加。其可以例如通过基因表达强度的增强、增加酶在细胞 中的含量、氨基酸位点的突变来实现。实现"基因的表达增强"以及"基因所编码的蛋白质 的活性增强"的各种技术手段是本领域技术人员熟知的。
[0044] 在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中含有突变的IdhA基因，并且所述突变的 IdhA基因位于质粒中。
[0045] 如本文所用，术语"质粒"具有本领域熟知的定义，其是以附加体形式存在于细 胞中的非染色体DNA并且能够自主复制的DNA分子。本发明中可以使用的质粒例如有： pEASY-Blunt、pEASY_Blunt Simple 和 pKD46 等。
[0046] 在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中含有突变的IdhA基因，并且所述突变的 IdhA基因位于染色体中。
[0047] 如本文所用，术语"染色体"具有本领域熟知的定义。在一些实施方案中，本发明所 涉及的经修饰的基因位于染色体中。将经修饰的基因整合至染色体的技术是本领域技术人 员熟知的，例如可以参见 Michael R. Green 和 Joseph Sambrook 的〃Molecular Cloning:A Laboratory Manual"（Fourth Edition)。
[0048] 在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含选自如下一或多种修饰：pflB基因表 达的抑制、和/或PflB基因所编码的蛋白质活性的抑制；frdABCD基因簇表达的抑制、和/ 或frdABCD基因簇所编码的蛋白质活性的抑制。
[0049] 在另一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含选自如下的修饰：mgsA基因表达的 抑制、和/或mgsA基因所编码的蛋白质活性的抑制。
[0050] 在本发明中，pf IB基因 （GenBank No: ACA78322. 1)编码丙酮酸甲酸裂解酶 (EC No:2. 3. 1.54)。frdABCD基因簇编码富马酸还原酶（EC No: 1.3. 5.4)，包括frdA基 因 （GenBank N〇:ACA79460.1)编码富马酸还原酶黄素蛋白亚基、frdB基因 （GenBank No:ACA79461. 1)编码富马酸还原酶黄素蛋白亚基、frdC基因 （GenBank No:ACA79462. 1)编 码富马酸还原酶C亚基、和frdD基因 （GenBank No:ACA79463. 1)编码富马酸还原酶D亚基。 mgsA 基因 （GenBank No:ACA78263. 1)编码甲基乙二醛合成酶（EC Νο:4· 2. 3. 3)。
[0051] 如本文所用，术语"基因表达的抑制"具有本领域内熟知的含义，是指基因表达强 度的降低，从而导致基因转录后产生的mRNA数量的减少。基因表达的抑制可以通过如下方 式实现，例如但不限于：基因的敲除、减少基因的拷贝数、改变基因的启动子（例如使用弱 启动子）等。如本文所用，术语"基因所编码的蛋白质的活性抑制"具有本领域内熟知的含 义，是指基因转录翻译后产生的蛋白活性的降低。其可以例如通过基因表达强度的降低、基 因中核苷酸的插入或缺失、氨基酸位点的突变来实现。实现"基因表达的抑制"以及"基因 所编码的蛋白质的活性抑制"的各种技术手段是本领域技术人员熟知的。
[0052] 在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌是以保藏号CGMCC7678保藏于CGMCC的菌 株。
[0053] 在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌是以保藏号CGMCC7679保藏于CGMCC的菌 株。
[0054] 在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌是以保藏号CGMCC7871保藏于CGMCC的菌 株。
[0055] 在一些实施方案中，本发明提供的大肠杆菌是用于生产D-乳酸的大肠杆菌。
[0056] 用于生产D-乳酸的大肠杆菌是指具有生产D-乳酸所必需的常规遗传背景的大肠 杆菌，用于生产D-乳酸所必需的遗传背景是本领域技术人员所熟知的。
[0057] 在第二方面，本发明提供了一种生产乳酸的方法，其中包括培养本发明的大肠杆 菌的步骤。
[0058] 在一个实施方案中，本发明生产乳酸的方法包括培养本发明的大肠杆菌，以及任 选的收集或者纯化乳酸。
[0059] 在一个实施方案中，本发明所述的"培养"包括种子培养和发酵培养。
[0060] 如本文所用，术语"种子培养"是指将用于发酵的菌种在固体培养基上活化后，再 经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。
[0061] 如本文所用，术语"发酵培养"是指利用微生物菌种，在适宜的条件下，将培养基组 分经过特定的代谢途径转化为某些特定产物的过程。在一个实施方案中，本发明的生产乳 酸的方法包括在高温下（42-50°C )进行发酵培养的步骤，例如42-43°C、43-44°C、44-45°C、 45-46 °C、46-47 °C、47-48 °C、48-49 °C、或 49-50 °C。
[0062] 在一个实施方案中，本发明的方法中包括将本发明的大肠杆菌厌氧发酵。
[0063] 如本文所用，术语"厌氧发酵"是指利用厌氧发酵菌株，在隔绝空气的条件下，经特 定代谢途径将培养基组分转化为某些特定产物的过程。
[0064] 在一个实施方案中，本发明的方法中的培养过程不进行任何通气步骤。
[0065] 在一个实施方案中，本发明中对大肠杆菌进行培养的方法包括以下步骤：
[0066] (1)将本发明的重组大肠杆菌接种于种子培养基，在适宜大肠杆菌生长的条件下 培养一段时间得到种子液；
[0067] (2)将种子液接种于发酵培养基，在厌氧条件下发酵。
[0068] 在一个实施方案中，本发明生产乳酸的方法包括在发酵培养过程中调节pH值的 步骤。在一个实施方案中，本发明生产乳酸的方法包括在发酵培养过程中调节PH的步骤， 其中将pH值调节至：6. 0-8. 0,例如6. 0-6. 5、6. 5-7. 0、7. 0-7. 5和7. 5-8. 0。在一个实施方 案中，本发明生产乳酸的方法包括在发酵培养过程中使用氨水或氢氧化钠作为中和剂来 调节pH值的步骤。
[0069] 在一个实施方案中，本发明中对大肠杆菌进行培养的方法包括以下步骤：
[0070] (1)将本发明的重组大肠杆菌接种于种子培养基，在适宜大肠杆菌生长的条件下 培养一段时间得到种子液；
[0071] (2)将种子液接种于发酵培养基，在厌氧条件下培养，并在发酵过程中使用氨水或 氢氧化钠作为中和剂来调节pH值。
[0072] 在一个实施方案中，本发明中对大肠杆菌进行培养的方法包括以下步骤：
[0073] (1)将本发明的重组大肠杆菌接种于种子培养基，在适宜大肠杆菌生长的条件下 培养一段时间得到种子液；
[0074] (2)将种子液接种于发酵培养基，在厌氧条件下进行发酵，并在发酵过程中使用氨 水或氢氧化钠作为中和剂来将pH值调节至6. 0-8. 0。
[0075] 本发明的方法中可以使用本领域中常规用于培养大肠杆菌的各种培养条件，例如 培养基、培养温度、培养时间和是否摇动以及摇动速度等。本领域技术人员根据需要可以选 择适当的培养条件。本发明的方法中所使用的培养条件以及发酵条件是本领域技术人员熟 知的（诸葛健等，1994,工业微生物实验技术手册，中国轻工业出版社）。
[0076] 在一个实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于：温度为30_50°C，例如 30-31 °C、31-32 °C、32-33 °C、33-34 °C、34-35 °C、35-36 °C、36-37 °C、37-38 °C、38-39 °C、 39-40 °C、40-41 °C、41-42 °C、42-43 °C、43-44 °C、44-45 °C、45-46 °C、46-47 °C、47-48 °C、 48-49 °C、或 49-50 °C。
[0077] 在一个实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于：种子培养的时间为6-16小 时,例如6-7小时、7-8小时、8-9小时、9-10小时、10-11小时、11-12小时、12-13小时、13-14 小时、14-15小时、或15-16小时。
[0078] 在一个实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于：发酵培养的时间为1-5天， 例如1天、2天、3天、4天、或5天。
[0079] 在一个实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于：将本发明的重组大肠杆菌 按照0. 1-10%(V/V)的接种量接种于种子培养基，例如0. 1%、0. 5%、1%、2. 5%、5%、或10%。
[0080] 在一实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于：将种子液按照终浓度 OD55tl=O. 01-0. 5 的接种量接种于发酵培养基，例如 OD55tl 为 0· 01-0. 05、0· 05-0. 1、0· 1-0. 2、 0· 2_0· 3、0· 3_0· 4 或 0· 4_0· 5。
[0081] 在一实施方案中，可以使用常用于大肠杆菌的培养基。用于本发明的大肠杆菌的 培养基可以包括合适的氮源，例如有机含氮化合物或无机含氮化合物或其混合物。在一实 施方案中，所述有机含氮化合物例如选自豆饼粉、花生饼粉、牛肉膏、鱼粉、酵母膏、蛋白 胨、玉米浆中的一种或任意几种的混合物，所述无机含氮化合物选自硝酸盐（如硝酸钠、硝 酸钾、硝酸钙），铵盐（如磷酸铵、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵）中的一种或任意几种的混合物。 在一实施方案中，用于本发明的大肠杆菌的培养基可以包括合适的碳源，例如选自葡萄糖、 淀粉、淀粉水解糖、果糖、糊精、乳糖、半乳糖、木糖、蔗糖、甘油、麦芽糖、脂肪酸、乙酸、丙酮 酸、和富马酸中的一种或任意几种的混合物。
[0082] 在一个实施方案中，本发明的方法中所使用的种子培养基和发酵培养基由以下成 分组成（溶剂为水） ：
[0083] 大量元素：葡萄糖、NH4H2P04、（NH4) 2HP04、MgSO4 · 7H20、和甜菜碱-HCl ;
[0084] 微量元素：FeCl3 · 6H20、CoCl2 · 6H20、CuCl2 · 2H20、ZnCl2、Na2MoO4 · 2H20、 MnCl2 · 4H202、和 H3BO3。
[0085] 在一个实施方案中，本发明的培养基由以下成分组成（溶剂为水）：
[0086] 大量元素：葡萄糖 20-140g/L，NH4H2PO4O. 5-1. 5g/L、（NH4) 2HP042-5g/L、 MgSO4 · 7Η200· 1-0. 3g/L、以及甜菜碱-HC10. 1-lg/L ;
[0087] 微量元素：FeCl3 · 6Η201-5 μ g/L、CoCl2 · 6Η200· 05-1 μ g/L、CuCl2 · 2Η200· 05-1 μ g/ L、ZnCl2O. 05-1 μ g/L、Na2MoO4 · 2Η200· 05-1 μ g/L、MnCl2 · 4Η2020· H μ g/ L, H3BO3O. 01-0. 5 μ g/L〇
[0088] 在一个实施方案中，本发明中对大肠杆菌进行培养的具体方法如下：
[0089] 将菌株厌氧发酵，包括以下步骤：
[0090] (1)种子培养：将1/3-1/2体积的种子培养基置于三角瓶中，高温高压灭菌。冷 却后将本发明的重组大肠杆菌按照〇. 1-10%(V/V)的接种量接种于种子培养基，在37°C或 42°C以及摇动的条件下培养6-16小时得到种子液，用于发酵培养基接种；
[0091] (2)发酵培养：将1/3-1/2体积的发酵培养基体积置于厌氧发酵罐中，将种子液按 照终浓度OD 55tl=O. 01-0. 5的接种量接种于发酵培养基，37°C或42°C培养1-5天，得到发酵 液。
[0092] 在一个实施方案中，本发明生产乳酸的方法中还包括从发酵液中提取和/或纯化 乳酸的步骤。
[0093] 在一个实施方案中，本发明的方法包括如下步骤：
[0094] (1)发酵培养本发明的大肠杆菌；和
[0095] (2)收获产生的D-乳酸；任选地分离或纯化所述D-乳酸。
[0096] 在第三方面，本发明涉及本发明的大肠杆菌在生产乳酸中的用途。 实施例
[0097] 本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发 明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领 域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本 发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改 变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。
[0098] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所 用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0099] 本发明包括如下实施例：
[0100] 实施例1、重纟目大肠杆菌Dlac-006的构律
[0101] 重组大肠杆菌Dlac-006的构建（表1)，分为以下3个步骤：
[0102] (1)丙酮酸甲酸裂解酶编码基因 PflB的敲除
[0103] (1-1):首先构建质粒pXZ-CS，用于基因敲除、基因表达调控和外源基因整合。
[0104] 质粒构建操作步骤共四步：
[0105] 第一步，以 pACYC184 质粒 DNA (Mok et al.，1991，Nucleic Acids Resl9:2321-2323)为模板，使用引物 184-cat-up(SEQ ID No. :5)和 184-cat-down(SEQ ID No. :6)，扩增得到氯霉素抗性基因，基因片段大小为994bp，包含有氯霉素基因启动子序列， 称为片段I。
[0106] 扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion5X 缓冲液 10 μ 1、dNTP (每种 dNTP 各 IOmM) 1 μ 1、DNA 模板 20ng、引物（ΙΟμΜ)各 2μ1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶 (2. 5U/μ 1)0. 5 μ 1、蒸馏水 33. 5 μ 1，总体积为 50 μ 1。
[0107] 扩增条件为98°C预变性2分钟（1个循环）；98°C变性10秒、56°C退火10秒、72°C 延伸30秒（30个循环）；72 °C延伸5分钟（1个循环）。
[0108] 第二步，以芽抱杆菌Bacillus subtilis sp subtilisl68的染色体DNA(该菌购 自中国普通微生物菌种保藏中心，CGMCC No. 1. 1390)为模板，使用引物Bs-sacB-up(SEQ ID No. :7)和Bs-sacB_down(SEQ ID No. :8)进行PCR扩增果聚糖鹿糖转移酶基因（sacB)，基 因片段大小为1618bp，含有sacB基因启动子序列，称为片段II。扩增体系和扩增条件参见 上文第一步。
[0109] 第三步，将第一步得到的片段I和第二步得到的片段II分别用限制性内切酶 SacKNEB公司）在37°C酶切30分钟；PCR纯化试剂盒清洗（Gel/PCR Extration Kit，购 自BioMIGA生物技术有限公司）；各取20ng片段I和片段II，加入1 μ 110XT4连接缓冲液 (ΝΕΒ公司）、1 μ I T4-DNA连接酶（ΝΕΒ公司），补充蒸馏水至10 μ 1，25°C反应5分钟；以酶 连片段为底物，取1 μ 1，用引物184-cat-up和Bs-sacB-down进行PCR扩增，扩增体系和扩 增条件参见上文第一步，得到含有cat-sacB的连接片段III。
[0110] 第四步，将经所述PCR所获得的片段III取1μ 1，加入1μ I pEASY-blunt simple 载体（试剂盒，北京全式金生物技术有限公司），25°C反应15分钟；氯化钙转化法：加入 50 μ I TranslO感受态细胞（购自北京全式金生物技术有限公司）中进行，冰浴30分钟。 42°C热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250μ I LB培养基，200rpm，37°C孵育1小时。 取200 μ 1菌液涂在含有氨苄霉素（终浓度为100 μ g/ml)和氯霉素（终浓度为34 μ g/ml) 的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，进行菌落PCR验证，引物为M13-F(SEQ ID No. :9)/M13-R(SEQ ID No. :10)。送样测序分析，结果正确的为阳性克隆，得到质粒 pXZ-CS (表 3)。
[0111] (1-2):从大肠杆菌ATCC8739 (Gunsalus et al.，1941，J Biol ChemHl: 853-858) 出发，采用两步同源重组的方法敲除PflB基因，获得重组大肠杆菌Dlac-002,包括以下六 1 K 少：
[0112] 第一步，以大肠杆菌ATCC8739基因组DNA为模板，使用引物XZ-pflB-up(SEQ ID No. :11)和 XZ-pflB-down(SEQ ID No. :12)进行 PCR 扩增，PCR 产物为 2260bp，该 PCR 产物 包含大肠杆菌ATCC8739的丙酮酸甲酸裂解酶编码基因 pflB(GenBank No:ACA78322. 1)及 其上下游各大约400个碱基。扩增体系和扩增条件参考实施例上文U二11中的第一步。
[0113] 将扩增得到的2260bp PCR产物克隆到pEASY-Blunt克隆载体（购自北京全式金 生物技术有限公司）上。克隆体系及氯化钙转化法参见上文(1-1)中质粒ρΧΖ-CS构建方 法中的第四步。取200 μ 1菌液涂在含有卡那霉素（终浓度为50 μ g/ml)的LB平板上，过 夜培养后，挑选5个阳性单菌落，进行菌落PCR验证，引物为M13-F/M13-R。送样测序分析， 结果正确的为阳性克隆，将得到的重组质粒命名为pXZO 14。
[0114] 第二步，以 pXZ014 质粒 DNA 为模板，使用引物 XZ-pflB-l(SEQ ID No. : 13)和 XZ-pflB-2(SEQ ID No. : 14)进行PCR扩增，得到4828bp的PCR产物，该PCR产物包含 pEASY-Blunt载体和丙酮酸甲酸裂解酶编码基因上下游各约400个碱基。扩增体系和扩增 条件参考实施例上文（1二11中的第一步。
[0115] 第三步，将含有氯霉素基因（cat)和果聚糖蔗糖转移酶基因（sacB)DNA片段 cat-sacB连接至第二步的PCR扩增产物，具体如下：
[0116] 以 pXZ-CS 为模板，使用引物 cat-sacB-up (SEQ ID No. : 15)和 cat-sacB-down (SEQ ID No. :16)进行PCR扩增，得到2618bp的PCR产物，即为含有氯霉素基因（cat)和果聚糖 蔗糖转移酶基因（sacB)的DNA片段。
[0117] 连接体系为：10ng的第二步4828bp的PCR产物、30ng的cat-sacB DNA片段， 2 μ IlOXT4连接缓冲液（NEB 公司），1μ1 T4 连接酶（NEB 公司，400,000 cohesive end units/ml)，补充蒸馈水至20 μ 1。室温连接2小时。取IOul用氯化I丐转化法转入TranslO， 过程参见上文（1二11中质粒pXZ-CS构建方法中的第四步。取200 μ 1菌液涂在含有氯霉素 (终浓度为34ug/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体 培养，提取阳性克隆质粒（将cat-sacB DNA片段克隆到pXZ014中的质粒）进行测序验证， 测序结果在上述第二步的PCR扩增产物上连接了 cat-sacB DNA片段，证明质粒构建正确， 将得到的重组质粒命名为PXZ015C。
[0118] 第四步，以PXZ015C质粒DNA为模板，使用引物XZ-pf ΙΒ-up/XZ-pf IB-down扩增出 3515bp DNA片段I。扩增体系和扩增条件参见上文(1_1)中质粒dXZ-CS构津步骤中的第 一步。DNA片段I包含丙酮酸甲酸裂解酶编码基因 pflB上游约400个碱基、cat-sacB DNA 片段、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因 PflB下游约400个碱基。
[0119] 将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒（Datsenko and Wanner 2000，Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645;质粒购买于美国耶鲁大学CGSC大肠杆菌保 藏中心，CGSC#7739)通过氯化钙转化法转化至大肠杆菌ATCC8739,然后将DNA片段I电转 至带有PKD46的大肠杆菌ATCC8739。
[0120] 电转条件为：首先准备带有pKD46质粒的大肠杆菌ATCC8739的电转化感受态 细胞（Dower et al.，1988，Nucleic Acids Resl6:6127-6145);将 50μ1 感受态细胞置 于冰上，加入50ng DNA片段I，冰上放置2分钟，转移至0. 2cm的Bio-Rad电击杯。使用 MicroPulser (Bio-Rad公司）电穿孔仪，电击参数为电压2. 5kv。电击后迅速将Iml LB培 养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30°C孵育2小时。取200 μ 1菌液 涂在含有氯霉素（终浓度为34ug/ml)的LB平板上，37°C过夜培养后，挑选5个单菌落进行 PCR验证，使用引物XZ-pf ΙΒ-up/XZ-pf IB-down进行验证，挑选一个正确的单菌落，命名为 Dlac-001。
[0121] 第五步，将第二步得到的4828bp的PCR产物进行磷酸化处理，自连接得到的质粒 用于第二次同源重组；具体步骤如下：将第二步的4818bp的PCR产物首先用PCR纯化试剂 盒清洗（Gel/PCR Extration Kit，购自BioMIGA生物技术有限公司）；取30ng纯化后的PCR 扩增产物，加入2 μ 110XT4连接缓冲液（NEB公司）、1 μ I T4多核苷酸激酶（NEB公司），补 充蒸馏水至20μ 1，37°C反应30分钟；加入1μ I Τ4连接酶（ΝΕΒ公司，400,000粘附末端单 位/ml)，室温反应2小时得到连接产物。酶连产物取IOul用氯化钙转化法转入TranslO， 过程参见上文(1-1)中质粒PXZ-CS构建步骤中的第四步。取200 μ 1菌液涂在含有卡那霉 素（终浓度为50ug/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行 液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果上述第二步的PCR扩增产物进行了 自连，证明质粒构建正确，得到质粒PXZO16。
[0122] 第六步，以pXZ016质粒DNA为模板，用引物XZ-pflB-up/XZ-pflB-down扩增出 897bp DNA片段II。DNA片段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Dlac-001。
[0123] 电转条件为：首先准备带有pKD46质粒的DlaclOl的电转化感受态细胞（制备方 法参见Dower et al.，1988);将50 μ 1感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段II，冰上 放置2分钟，转移至0. 2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司）电穿孔 仪，电击参数为电压2. 5kv。电击后迅速将Iml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移 至试管中，75转，30°C孵育4小时。将菌液转移至含有10%蔗糖的没有氯化钠的LB液体培 养基（250ml烧瓶中装50ml培养基），培养24小时后在含有6%蔗糖的没有氯化钠的LB固 体培养基上划线培养。经过PCR验证，所用引物为XZ-pflB-up/XZ-pflB-down，正确的菌落 扩增产物为897bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为Dlac-002(表1)。
[0124] 敲除pf IB基因所构建的质粒见表3,使用的引物序列见表2。
[0125] (2)富马酸还原酶编码基因 frdAB⑶的敲除
[0126] 从重组大肠杆菌Dlac-002出发，使用和实施例1(1-2)相同的方法敲除富马酸还 原酶编码基因 frdABCD(frdA GenBank N〇:ACA79460. l，frdB GenBank No:ACA79461. l，frdC GenBank No:ACA79462. l，frdD GenBank No:ACA79463. I)，得到重组大肠杆菌Dlac-004。构 建的质粒见表3,使用的引物序列见表2。其中引物的命名对应于敲除pflB基因过程中所 使用的引物的名称，仅分别将PflB替换为frdB或frdC。
[0127] (3)甲基乙二醛合成酶基因 mgsA的敲除
[0128] 从重组大肠杆菌Dlac-004出发，使用和实施例1(1-2)相同的方法敲除甲基乙二 醛合成酶mgsA基因 （GenBank No:ACA78263. 1)，得到重组大肠杆菌Dlac-006。构建的质粒 见表3,使用的引物序列见表2。其中引物的命名对应于敲除pflB基因过程中所使用的引 物的名称，仅分别将PflB替换为mgsA。
[0129] 表1、生产乳酸的重组大肠杆菌
[0130]
【权利要求】
1. 一种重组大肠杆菌，其含有如下修饰： pflB基因表达的抑制、和/或pflB基因所编码的蛋白质活性的抑制；和 frdABCD基因簇表达的抑制、和/或frdABCD基因簇所编码的蛋白质活性的抑制， 其中所述大肠杆菌还含有突变的ldhA基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No. :1 所示氨基酸序列中的R282的位置上含有修饰，任选地，所述大肠杆菌中所述突变的ldhA基 因的表达增强、和/或所述突变的ldhA基因所编码的蛋白质的活性增强。
2. 权利要求1的大肠杆菌，其中在对应于R282的位置上的修饰是用C置换R。
3. 权利要求1的大肠杆菌，其中所述突变的ldhA基因在对应于SEQ ID No. : 2所示核 苷酸序列中的C844的位置上含有突变。
4. 权利要求3的大肠杆菌，其中所述突变是用T置换C。
5. 权利要求1-4任一项的大肠杆菌，其中所述突变的ldhA基因位于质粒或染色体中。
6. 权利要求5的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌以保藏号CGMCC7871保藏于CGMCC。
7. 权利要求5的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌中还含有如下修饰： mgsA基因表达的抑制、和/或mgsA基因所编码的蛋白质活性的抑制。
8. 权利要求7的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌以保藏号CGMCC7678保藏于CGMCC。
9. 权利要求7的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌以保藏号CGMCC7679保藏于CGMCC。
10. 权利要求1-9任一项的大肠杆菌，其用于生产D-乳酸。
11. 生产D-乳酸的方法，所述方法包括： (1) 发酵培养权利要求1-10任一项的大肠杆菌；和 (2) 收获产生的D-乳酸；任选地分离或纯化所述D-乳酸。
12. 权利要求11的方法，其中在步骤⑴中包括使用中和剂调节pH值，所述中和剂选 自氨水和氢氧化钠。
13. 权利要求11的方法，其中在步骤（1)中的发酵过程于高温下进行，所述高温是指 42-50。。。
14. 权利要求1-10任一项的大肠杆菌在生产D-乳酸中的用途。
【文档编号】C12R1/19GK104278003SQ201310293659
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年7月12日 优先权日:2013年7月12日
【发明者】马延和, 张学礼, 徐洪涛, 朱欣娜, 刘萍萍, 唐金磊 申请人:中国科学院天津工业生物技术研究所