一种检测罕见遗传病戈谢病相关风险基因的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测罕见遗传病戈谢病相关风险基因的试剂盒。该试剂盒包括同时检测GBA基因上rs131678号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、用于荧光定量PCR检测的常规组件等。本发明的试剂盒通过检测与戈谢病密切相关的GBA的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体罹患戈谢病的风险性。
【专利说明】
—种检测罕见遗传病戈谢病相关风险基因的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测罕见遗传病戈谢病相关风险基因的试剂盒，通过同时检测与戈谢病关联的β-葡萄糖苷脂酶(β-glucosidase)-葡萄糖脑苷脂酶基因(glucerebrosidase gene,GBA)的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体罹患戈谢病的风险性。
【背景技术】
[0002]戈谢病(Gaucher disease,⑶)是溶酶体忙积病中最常见的一种，为常染色体隐性遗传。Brady等在1964年发现葡萄糖脑苷脂的贮积是由于β-葡萄糖苷脂酶(β -glucosidase)-葡萄糖脑苷脂酶(glucerebrosidase,GBA)缺乏所致。β -葡萄糖脑苷脂酶可以将葡萄糖脑苷脂降解成葡萄糖和神经酰胺。该酶缺乏可导致葡萄糖脑苷脂在体内单核吞噬细胞系统中聚集，主要聚集在脾脏、淋巴结和骨髓组织细胞，肝脏星形细胞、中枢神经系统小胶质细胞、骨破骨细胞、肺泡巨噬细胞等。戈谢病主要临床表现为:骨鲠死、骨骼畸形、肝脾肿大、贫血、血小板减少症。少数病例表现为神经系统受累的症状和体征。临床上，戈谢病根据神经系统受累程度划分为三型:I型:非神经病变型，最常见的类型，约占95%。成年期发病，缓慢进展，临床表现复杂，从无症状到严重的器官受累均可表现，少数病例可表现为帕金森综合症；II型:急性神经病变型，婴儿期发病，有严重神经系统受累，都与围生期或出生I年内死亡；111型:亚急性或慢性神经病变型，儿童期发病，至少有一种神经系统表现，比如小脑性共济失调、肌阵挛、癫痫发作或痴呆，预后不良，通常于儿童或青春期死亡。
[0003]戈谢病呈常染色体隐性遗传，由葡萄糖脑苷脂酶基因(glucerebrosidase gene,GBA)突变所引起。GBA基因位于染色体lq21上，有11个外显子。目前已报道的GBA基因突变有 200 多种，其中常见的有 N370S(c.1226 A > G)，84GG(c.84_85insG)，L444P (c.1448T> O和IVS2+1G — A。研究发现在犹太民族戈谢病人中N370S突变占到78%，而在非犹太民族戈谢病患者中最常见的突变则是L444P (36%)，其次是N370S (29%)。中国戈谢病患者GBA基因突变分析显示最常见的突变依次是:L444P、F2131、R353W，而N370S突变在中国戈谢病患者中很罕见。
【发明内容】
[0004]基于葡萄糖脑苷脂酶基因(glucerebrosidase gene,GBA)上的I个SNP位点多态性可用来评估个体罹患戈谢病风险性的基础上，本发明提供一种检测罕见遗传病戈谢病相关风险基因的试剂盒
试剂盒包括:
检测GBA基因上rsl31678号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、去离子水
O
[0005]本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对GBA基因上rsl31678号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含这I个SNP位点的DNA片段的引物对。设计这类引物对是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO:1和2所示序列的引物对。特异性引物对可用常规的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限于这一对引物。
[0006]本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是指针对GBA基因上rsl31678号SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这一个SNP位点基因型的Taqman探针对。设计这类探针是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO:3和4所示序列的Taqman探针对。特异性荧光探针对可用常规的探针合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的特异性荧光Taqman探针对不限于这一对探针，所有可用于荧光定量PCR法检测本发明中所述用来评估个体罹患戈谢病风险性的一个SNP位点的探针均在本发明范围内。
[0007]本发明试剂盒的组分和含量包括:
5μ1 10 X荧光定量PCR反应缓冲液，
0.5μ1 25mM dNTP 混合液，
3μ1 25mM MgCl2 溶液，
0.125μ1 (5unitsM) Taq DNA 聚合酶，
20μΜ特异性引物对每条引物各0.225μ1，
ΙΟμΜ特异性荧光探针对每条探针各0.25μ1，
去尚子水26.625Μ-1 ο
[0008]本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为_20°C。
[0009]
【具体实施方式】:
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
[0010]
实施例1.检测试剂盒的使用步骤1:DNA模板的提取
用真空采血管采集人体外周血，提取血液中的基因组DNA。
[0011]步骤2:荧光定量PCR反应
使用可检测戈谢病相关风险基因的荧光定量PCR检测试剂盒，其中，包含下列引物对和荧光探针对:
有义引物 1:5，- GTCTACTAAAAATACA - 3’ (SEQ ID NO:1)
反义引物 1:5，- GATTACAGGTGCCCAC - 3，(SEQ ID NO:2)
带 VIC 荧光基团探针 1:5’ - TTAGCCaGGCTAG -3’ (SEQ ID NO:3)
带 FAM 荧光基团探针 1:5’ - TTAGCCgGGCTAG -3’ (SEQ ID NO:4)
有义引物1，反义引物1、带VIC荧光基团探针1、带FAM荧光基团探针I特异地针对检测GBA基因上的rsl31678号SNP位点多态性；
I个SNP位点分别进行2次独立的荧光定量PCR反应’每个反应的体系为总体积10μ1,包含浓度为20ng/^l的DNA模板2μ1、?μ1 10 X荧光定量PCR反应缓冲液、0.?μ? 25mMdNTP 混合液、0.6μ1 25mM MgCl2 溶液、0.025μ1 (5unitsM) Taq DNA 聚合酶、20μΜ 的有义弓I物和反义引物各0.225μ1、ΙΟμΜ的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0.25μ1，去离子水
5.325Μ-1 ο
[0012]在ΑΒΙ9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，进行60个循环的95°C、30秒，60°C、I分钟。反应结束后在ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品突光量。
[0013]步骤3 =SNP基因型分析
熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。
[0014]
实施例2.对患者进行戈谢病相关风险基因检测的服务步骤1:DNA提取
由医院检验科医师对被检者进行外周血的采集，采用真空采血管采集外周血，并提取出其中的基因组DNA。
[0015]步骤2:基因分型检测
使用本发明提供的试剂盒，对被检者基因组DNA的GBA基因上的rsl31678号SNP位点分别进行荧光定量PCR检测，确定这一个SNP位点的基因型。
[0016]步骤3:个体罹患戈谢病风险性的分析
通过对被检测者SNP基因型的分析，出具罹患戈谢病风险性的分析报告单。报告中详细说明了被检测者罹患戈谢病风险性的高低，并由医师向被检测者详细说明和解读罹患戈谢病风险性的分析报告单。
【权利要求】
1.一种检测罕见遗传病戈谢病相关风险基因的试剂盒，其特征在于:包括检测GBA基因上rs 131678号SNP位点的特异性弓I物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述的特异性引物对是指针对GBA基因上rsl31678号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含这I个SNP位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述的特异性荧光探针对是指针对GBA基因上rsl31678号SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这I个SNP位点基因型的Taqman探针对。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所含的特异性引物对选自具有SEQIDNO:1和2所示序列的引物对。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所含的特异性荧光探针选自具有SEQID NO:3和4所示序列的Taqman探针对。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:试剂盒的组分和含量包括10X荧光定量 PCR 反应缓冲液、0.5μ1 25mM dNTP 混合液、3μ1 25mM MgCl2 溶液、0.125μ1 (5unitsM)Taq DNA聚合酶、20μΜ特异性引物对每条引物各0.225μ1、ΙΟμΜ特异性荧光探针对每条探针各0.25μ1、去离子水26.625μ1，本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为_20°C。
【文档编号】C12Q1/68GK104293885SQ201310297184
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年7月16日 优先权日:2013年7月16日
【发明者】任峻, 张华忠 申请人:浙江爱易生物医学科技有限公司