构建能分泌表达细胞因子的转基因饲养层细胞的方法
【专利摘要】本发明提供了一种构建能分泌表达细胞因子的转基因饲养层细胞的方法，其是将编码至少一种特定细胞因子的基因整合至哺乳动物饲养层细胞的基因组中，随饲养层细胞进行分泌表达。该方法建立的饲养层细胞可以替代培养基中添加的细胞因子，一方面可以大大降低目前干细胞培养中因添加细胞因子造成的高成本，另外可针对不同物种干细胞的特性有针对性地建立表达特定细胞因子的饲养层细胞。本发明提供的方法操作简单，费用低廉，实用性强，可推广应用到各个物种不同类型干细胞的培养。
【专利说明】构建能分泌表达细胞因子的转基因饲养层细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域和干细胞领域，具体地说，涉及一种构建能分泌表达细 胞因子的转基因饲养层细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 胚胎干细胞（ES细胞，embryonic stem cells)是由早期胚胎内细胞团细胞（ICM 细胞，Inner cell Mass)或原始生殖细胞（PGC细胞，Primordial germ cells)经体外分 离、抑制分化培养获得的多潜能细胞，其具有与胚胎细胞相似的形态特征及分化潜能。在 体外抑制分化培养条件下可以对其进行各种遗传操作，通过胚胎嵌合和细胞核移植参与各 种组织的发育，形成克隆动物。通过对体外ES的操作，除了克隆动物之外，ES细胞在生产转 基因动物，药物筛选甚至在人类疾病治疗上都有不可比拟的用处。2006年，日本Yamanaka 率先利用0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc四个转录因子实现成纤维细胞向干细胞的转变。诱导 多能干细胞（iPS细胞，induced pluripotent stem cells)具有和ES -样的干细胞特性。 周琪课题组于2009年成功利用四倍体补偿技术证明了 iPS细胞的全能性。
[0003] 尽管应用前景广阔，但是ES细胞和iPS细胞的培养条件也相对苛刻。一方面 要保证不断增殖，同时又要求不能分化。目前为止，无论是ES细胞系还在近年来兴起的 iPS细胞，在体外培养过程中饲养层细胞和小分子例如白血病抑制因子（LIF，leukemia inhibitory factor)、成纤维细胞生长因子（FGF，Fibroblast growth factors)发挥了举 足轻重的作用。
[0004] 有关饲养层的不断探索发现，不同的饲养层在维持干细胞特性上存在差异，而且， MEF (小鼠胚胎成纤维细胞，Mouse Embryonic Fibroblast)作为国际上公认的最常用的饲 养层细胞也有自身无法回避的缺点，例如，生命期有限，不能在体外长期传代，而且其产生 促生长因子和抑制分化因子的能力也会随着传代时间的延长而逐渐减弱甚至丧失。再如， 在人ES细胞培养过程中可能造成的交叉污染问题。无饲养层的培养体系虽然也有报道，但 其对维持干细胞生长的稳定性还有待研究。
[0005] LIF是在干细胞培养中最常用的添加物。在干细胞体外培养过程中发挥着至关重 要的作用。但是，LIF价格不菲。而且有相关的研究表明，小鼠和大鼠的LIF在序列上的同 源性高达90%，但是，在大鼠 ES的培养中发现，大鼠 LIF要优于小鼠 LIF。也就是说尽管不 同物种的LIF同源性很高，但是差异依然存在。目前已经商品化的LIF仅有鼠源、人源和大 鼠的，远远不能满足不同物种的需求。
[0006] 基于上述原因，亟待建立一种能快速建立高效表达细胞因子饲养层细胞的方法。 该方法使得饲养层和细胞因子都不再受物种来源的限制。一方面在研究中可用于优化体外 培养体系，也可以建立同时表达多个细胞因子的饲养层细胞。另外，在实际应用中降低实验 成本。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种快速构建能高效分泌表达细胞因子的转基因饲养层细 胞的方法。
[0008] 为了实现本发明目的，本发明的一种构建能分泌表达细胞因子的转基因饲养层细 胞的方法，其是将编码至少一种特定细胞因子的基因整合至哺乳动物饲养层细胞的基因组 中，随饲养层细胞进行分泌表达。
[0009] 前述方法中，所述特定细胞因子包含白血病抑制因子（LIF)、成纤维细胞生长因子 (FGF)等。其中，LIF来源于哺乳动物，如小鼠、大鼠、猪、人等。
[0010] 前述方法中，所述哺乳动物饲养层细胞为小鼠胚胎成纤维细胞、猪胚胎成纤维细 胞等。
[0011] 前述方法中，将含有编码至少一种特定细胞因子的基因的质粒转化(优选电转化） 到哺乳动物的饲养层细胞中，获得的转基因饲养层细胞可分泌表达特定细胞因子。
[0012] 前述方法中，构建含有编码至少一种特定细胞因子的基因的表达载体，将构建的 表达载体通过PB (PiggyBac)转座系统整合至哺乳动物饲养层细胞的基因组中，随饲养层 细胞进行分泌表达。
[0013] 前述方法中，所述表达载体中含有启动子EF-la (Human elongation factor-1 alpha)或CAG (巨细胞病毒CMV的增强子和鸡β -actin启动子的组合体)。
[0014] 前述方法中，所述表达载体中还含有药物筛选标记，如新霉素（neomycin)的抗药 基因 Neo等。
[0015] 本发明的高效表达细胞因子的饲养层细胞的构建方法，通过建立表达细胞因子的 转基因饲养层细胞，并通过饲养层细胞表达细胞因子的方式来替代细胞培养过程中培养基 中添加的细胞因子。具体包括以下步骤：
[0016] 1)构建PB转座系统的表达载体；
[0017] 2)采用电转化的方式，将构建的表达载体整合至哺乳动物饲养层细胞的基因组 中；
[0018] 3)药物筛选得到阳性细胞；
[0019] 4)阳性细胞扩繁，经Co-60照射细胞不再增殖，即得可分泌表达特定细胞因子的 饲养层细胞。
[0020] 由前述方法获得的可分泌表达特定细胞因子的饲养层细胞。
[0021] 由前述方法获得的可分泌表达特定细胞因子的饲养层细胞在干细胞体外培养和 分离中的应用。
[0022] 本发明进一步提供用于检测权利要求8所述可分泌表达特定细胞因子的饲养层 细胞的通用反向引物，所述引物为R:5' -GGGAGGTGTGGGAGGTTTT-3'。
[0023] 具体地，本发明提供一种快速建立在猪成纤维细胞中分别表达小鼠、人和猪等物 种LIF的方法。包括以下步骤：
[0024] 1、构建表达不同物种LIF蛋白的表达载体。这些表达载体通过PB转座系统整合 到基因组中表达。
[0025] 2、转基因细胞的筛选。通过电转的方式将表达载体导入猪胚胎成纤维细胞中，通 过氨基糖苷类抗生素（G418)筛选获得阳性转基因细胞群。
[0026] 3、将转基因细胞制作成饲养层细胞。利用射线照射的方式处理细胞。
[0027] 4、用制备的饲养层细胞培养细胞，观察培养的iPS细胞形态多能性等指标，以检 测特制饲养层细胞的效果。
[0028] 经过药物筛选后得到的细胞是成功转入外源表达载体的细胞。通过反转录聚合酶 链式反应（RT-PCR)和蛋白质印迹法（western blots)可以从RNA水平和蛋白两个层面确认 细胞因子的表达。阳性细胞用作饲养层细胞可以取代培养基中添加的细胞因子。
[0029] 前述方法中，构建表达载体时，细胞因子的基因是合成序列，通过酶切连接的方式 连入表达载体上。
[0030] 前述方法中，建立转基因细胞的方法优选采用电转化的方式，电转使用Lonza公 司（德国）电转仪，程序设置为A024。
[0031] 前述方法中，每次电转使用的细胞数目为2X106个，电击液用量为200μ 1。
[0032] 前述方法中，电转时，表达载体和ΡΒ酶表达载体的重量比为3:1。每次电转用 2 X 106个细胞，相应使用6 μ g的表达载体和2 μ g的ΡΒ酶表达载体。
[0033] 前述方法中，采用的表达系统是利用PB转座系统将外源表达载体整合到基因组 中。
[0034] 前述方法中，转基因饲养层细胞建系所用的培养基是普通小鼠胚胎成纤维细胞培 养基，培养基中不添加 LIF。
[0035] 前述方法中，进行G418药物筛选，从而得到阳性细胞。
[0036] 得到的阳性细胞在液氮中保存，待后续试验需要，可按需解冻扩繁使用。
[0037] 前述方法中，将阳性细胞制备成饲养层细胞是通过Co-60射线照射的方式。
[0038] 本发明提供了一种快速高效地建立能稳定表达特定细胞因子的饲养层细胞的方 法，即将表达特定细胞因子的质粒电转到细胞中，通过药物筛选得到阳性细胞。该方法建立 的饲养层细胞可以替代培养基中添加的细胞因子，一方面可以大大降低目前干细胞培养中 因添加细胞因子造成的高成本，另外可针对不同物种干细胞的特性有针对性地建立表达特 定细胞因子的饲养层细胞。本发明提供的方法操作简单，费用低廉，实用性强，可推广应用 到各个物种不同类型干细胞的培养。
[0039] 本发明的优点在于：
[0040] (一）本发明提供了一种高效、简便快速的方法，利用来源方便的细胞系制备表达 所需的细胞因子的饲养层细胞，为干细胞的体外培养和大动物ES细胞的分离研究提供了 一种优化的体外培养体系。有利于促进体外大动物ES细胞的分离研究，创建大动物ES细 胞培养的最优条件。
[0041] (二）本发明的检测方法操作简单，费用低廉，实用性强，可广泛应用于不同物种各 种类型干细胞的培养。
[0042] (三)可根据本发明的方法开发出相应的表达不同细胞因子的PB表达载体，按需表 达所需的细胞因子。
[0043](四）根据本发明的方法开发出的表达载体，其细胞因子的表达量显著高于普通商 品化细胞中同种细胞因子的表达量，满足了干细胞培养基中对于特定细胞因子量的需求。
[0044] (五）可根据本发明的方法开发出相应的表达不同细胞因子的细胞系，为以后科研 工作提供便利。
[0045] (六）本发明为体外干细胞培养体系的不断优化奠定了基础。
[0046] (七）通过设计合适的表达载体，还可以制备同时表达多个细胞因子的细胞系。
[0047] (八）本发明可以通过选用不同的启动子实现细胞因子表达量的调节。
【专利附图】
【附图说明】
[0048] 图1为本发明实施例1中从RNA转录水平和蛋白表达水平检测LIF的表达量；其 中，A为本发明的饲养层细胞与商品化细胞ST0和BRL中LIF的蛋白表达量对比以及使用 不同启动子的PB载体LIF表达量与商品化饲养层细胞LIF表达量对比，B为本发明中饲养 层细胞与商品化细胞ST0和BRL中LIF的转录水平对比。
[0049] 图2为本发明实施例2中使用本发明的饲养层细胞培养iPS细胞结果；其中，a为 阳性对照，猪iPS克隆63312在添加 LIF的2i中培养，使用普通饲养层细胞；b为阴性对 照，猪iPS克隆63312在不添加 LIF的2i培养基中培养，使用普通饲养层细胞；c为阴性对 照，猪iPS克隆63312在2i不加 LIF中培养，使用普通PEF (猪胚胎成纤维细胞）作为饲养 层细胞；d为猪iPS克隆63312在2i不加 LIF培养基中培养，使用PEF-mouse-LIF (过表达 鼠源LIF的PEF)的饲养层细胞；e为猪iPS克隆63312在2i不加 LIF培养基中培养，使用 PEF-human-LIF (过表达人源LIF的PEF)的饲养层细胞；f为猪iPS克隆63312在2i不加 LIF培养基中培养，使用PEF-pig-LIF (过表达猪源LIF的PEF)的饲养层细胞。
[0050] 图3为本发明实施例3中使用本发明的饲养层细胞收集的条件培养基培养iPS细 胞；其中，a为阳性对照，猪iPS克隆63312在添加 LIF的2i培养基中培养；b为阴性对照， 猪iPS克隆63312在未加 LIF的2i培养基中培养；c为阴性对照，使用PEF (猪胚胎成纤维 细胞)饲养层细胞收集的条件培养基(其中没有人工添加 LIF)，培养猪iPS克隆63312 ;d为 使用PEF-小鼠-LIF饲养层细胞收集的条件培养基(其中没有人工添加 LIF)，培养猪iPS克 隆63312 ;e为使用PEF-人-LIF饲养层细胞收集的条件培养基(其中没有人工添加 LIF)， 培养猪iPS克隆63312 ;f为使用PEF-猪-LIF饲养层细胞收集的条件培养基(其中没有人 工添加 LIF)，培养猪iPS克隆63312。
【具体实施方式】
[0051] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0052] 以下实施例中涉及的培养基配方如下：
[0053] MEF培养基配方
[0054]
【权利要求】
1. 一种构建能分泌表达细胞因子的转基因饲养层细胞的方法，其特征在于，将编码至 少一种特定细胞因子的基因整合至哺乳动物饲养层细胞的基因组中，随饲养层细胞进行分 泌表达。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特定细胞因子包含白血病抑制因子 或成纤维细胞生长因子。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物饲养层细胞为小鼠胚胎成 纤维细胞、猪胚胎成纤维细胞。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，构建含有编码至少一种特定细胞因子的 基因的表达载体，将构建的表达载体通过PB转座系统整合至哺乳动物饲养层细胞的基因 组中，随饲养层细胞进行分泌表达。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述表达载体中含有启动子EF-la或 CAG。
6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述表达载体中还含有药物筛选标记。
7. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 构建PB转座系统的表达载体； 2) 采用电转化的方式，将构建的表达载体整合至哺乳动物饲养层细胞的基因组中； 3) 药物筛选得到阳性细胞； 4) 阳性细胞扩繁，经Co-60照射细胞不再增殖，即得可分泌表达特定细胞因子的饲养 层细胞。
8. 由权利要求1-7任一项所述方法获得的可分泌表达特定细胞因子的饲养层细胞。
9. 权利要求8所述可分泌表达特定细胞因子的饲养层细胞在干细胞体外培养和分离 中的应用。
10. 用于检测权利要求8所述可分泌表达特定细胞因子的饲养层细胞的通用反向引 物，其特征在于，所述引物为-GGGAGGTGTGGGAGGTTTT-3'。
【文档编号】C12Q1/68GK104099369SQ201310306415
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年7月19日 优先权日:2013年4月9日
【发明者】胡晓湘, 李书萍, 赵茜, 李宁 申请人:中国农业大学