可区分hbv b型和非b型的双探针实时定量pcr法
【专利摘要】本发明涉及一种双探针实时荧光定量PCR方法，更具体涉及一种可区分HBVB型和非B型的双探针实时定量PCR法。本发明建立了一种基于型特异性碱基设计的双探针实时定量PCR法，适用于B、C基因型流行的亚洲和太平洋地区HBV感染者HBV核酸定量的同时进行粗略基因分型，并且避免了其他少见基因型的漏检。该方法包括以下步骤：（1）设计保守引物，及针对B型和非B型的Taqman探针；（2）提取血清样本中HBVDNA；（3）双探针实时荧光定量PCR,同时对HBVDNA进行分型和定量。本发明建立的双探针实时定量PCR法准确、灵敏、特异、重复性好，可以同时进行HBVDNA的定量检测和基因分型，适合于临床推广。
【专利说明】可区分HBV B型和非B型的双探针实时定量PCR法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种双探针实时荧光定量PCR方法，更具体涉及一种可区分HBV B型和非B型的双探针实时定量PCR法。
[0002]
【背景技术】
[0003]乙型肝炎病毒感染严重威胁着人类的健康，可引起急慢性乙型肝炎、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌等肝脏疾病。目前全球有超过3.5亿的慢性HBV感染者，每年死于HBV感染所致的终末期肝病和肝癌的人数超过100万人，快速、准确地诊断乙型肝炎对于其治疗及
预后有着重要意义。
【发明内容】
[0004]外周血HBVDNA的存在是诊断HBV感染最直接可靠的指标，也是慢性乙型肝炎诊断和治疗过程中重要的监测项目。当前，HBV依据其基因组异质性≥8%至少可以分为A~
I9个基因型，不同的基因型呈显著的地域性分布，在HBV高度流行的亚洲和太平洋地区以B基因型和C基因型为主，兼有少量的其他基因型(例如D型)。近年来，研究表明不同的基因型和疾病的进展、抗病毒治疗的效果及临床预后有一定的相关性，B基因型感染者比C基因型感染者较早出现HBeAg血清学转换，较少进展为肝硬化和肝癌，而且对干扰素治疗的应答率较高。因此，在亚太地区，将B基因型和非B基因型区分开来对于HBV感染后疾病进展的风险预测和治疗方案的选择具有重要意义。更重要的是，在进行抗病毒治疗的患者中发现了 “基因型漂移”的现象，可能与机体的免疫状况和药物抗病毒压力有关。因此，在监测患者体内HBV DNA的量的变化的同时有必要实时监测HBV基因型，这样可以更好地动态地指导抗病毒治疗，及时调整治疗方案，也可以更好地预测预后及转归。
[0005]目前，HBV DNA定量主要有实时PCR、分子杂交定量等方法，HBV基因分型主要有测序法、PCR-RFLP等方法。其中测序法是基因分型的“金标准”，但其价格较贵，对混合型的检出能力较差，限制了其在临床上的广泛应用；此外，如果分别进行HBV DNA定量检测和基因分型，既费时、费力，又增加患者负担。鉴于此，本发明建立了一种基于型特异性碱基设计的双探针实时定量PCR法，适用于B、C基因型流行的亚洲和太平洋地区HBV感染者HBV核酸定量的同时进行粗略基因分型，并且避免了其他少见基因型的漏检。
[0006]
【发明内容】
基于上述目的，本发明建立了一种可区分HBV B型和非B型的双探针实时定量PCR法。
[0007]本发明采取的技术方案如下:
一种可区分HBV B型和非B型的双探针实时定量PCR法，包括以下步骤:(I)通过对已明确基因型的HBV全基因组序列进行比对，选择保守区设计保守引物，即上游引物F和下游引物R，同时选择型特异性碱基聚集区设计针对B型和非B型的Taqman探针，其中B型探针5'端标记Hex荧光基团，非B型探针5'端标记FAM荧光基团，两者3'端均标记猝灭基团；(2)提取血清样本中HBV DNA ; (3)双探针实时荧光定量PCR:保守引物能扩增所有基因型HBV DNA，而B型探针只能结合B基因型HBV DNA，非B型探针能结合余下所有基因型HBVDNA,然后在PCR反应进行时，Taqman探针被Taq酶水解而发出荧光，通过监测扩增曲线，并记录荧光阈值，同时对HBV DNA进行分型和定量。
[0008]所述双探针实时荧光定量PCR的反应体系:2XPremix Ex Taq 10μ l,20ymol/L 上游引物 F 0.2 μ 1，20 μ mol/L 下游引物 R 0.2 μ 1，20 μ mol/L B 型探针 0.3 μ 1，20μ mol/L 非 B 型探针 0.3 μ 1，50XR0X 0.4 μ 1，模板 2μ 1，ddH20 6.6 μ 1，总体积 20μ I ;反应条件:95°C 30s — 95°C 5s, 60°C 30s 40个循环，在60°C选择Hex和FAM通道采集荧光信号，分别代表B基因型和非B基因型扩增，结果用ABI StepOne plus软件确定各样品的循环阈值。
[0009]上述涉及的引物如下:
上游引物F
CTAGACTCGTGGTGGACTTCTC, 下游引物R
ATGAGGCATAGCAGCAGGAT，
B型探针 非B型探针
以B基因型质粒作为B型扩增的标准品，C基因型质粒作为非B型扩增的标准品，分别绘制B基因型和非B基因型标准曲线，通过标准曲线对未知样品定量；同时对HBV DNA进行分型，若仅在Hex通道检出红色扩增曲线为B基因型，若仅在FAM通道检出绿色扩增曲线为非B基因型；若同时在Hex和FAM通道检出扩增曲线为混合基因型。
[0010]为了测试本发明的实用性，本 申请人:做了一系列有益的试验如下:
1.双探针实时荧光定量PCR法的建立
选择保守区设计引物，选择型特异性碱基聚集区设计针对B基因型和非B基因型的Taqman探针，建立能在I个反应体系能够对HBV DNA进行定量并区分B基因型和非B基因型的方法。
[0011]2.双探针实时荧光定量PCR法的方法学评价
评价双探针实时荧光定量PCR法的线性范围、检测下限、灵敏度、特异性、重复性等指标。
[0012]3.双探针实时荧光定量PCR法检测效能评价及其初步临床应用
以凯杰公司HBV DNA核酸定量检测试剂盒作为HBV DNA定量参照方法，申友公司HBV基因分型试剂盒为HBV基因分型参照方法，同双探针实时荧光定量PCR法平行检测539例HBV感染者血清标本，评价本发明方法定量和分型的准确性。
[0013]其结果如下:
1.成功建立双探针实时荧光定量PCR法
本发明的双探针实时荧光定量PCR法能够对HBV DNA进行定量并且能够区分B基因型和非B基因型HBV。在Hex通道检出典型扩增曲线为B基因型；在FAM通道检出典型扩增曲线为非B基因型；同时在Hex和FAM通道检出典型扩增曲线为混合基因型。
[0014]2.双探针实时荧光定量PCR法方法学评价双探针实时荧光定量PCR法检测B、非B基因型的灵敏度均为500kIU/L ;线性范围均为IO3~IO9 IU/ml ;混合基因型达到10%时就能检测出来；批内和批间CT在0.84%~2.80%之间；对其他病毒感染者和健康志愿者血清检测结果均为阴性。
[0015]3.双探针实时荧光定量PCR法检测效能评价及其初步临床应用
509例HBV DNA阳性检测结果，基因分型结果与HBV测序分型试剂盒总符合率为93.5%(476/509，Aappa=0.876，P<0.05) ；DNA定量结果与凯杰HBV核酸定量测定试剂盒定量结果有很好的相关性(f=0.94，P<0.05)，且经Bland-Altman分析，95.7% (487/509)的值在95% —致性界限以内，两种方法HBV DNA定量一致性较好。
[0016]509例HBV DNA阳性结果中，检出B基因型275例(54.03%)、C基因型201例(39.49%)、B/C 混合基因型 33 例(6.48%), DNA 载量分别为 5.51 (4.23 ~6.74),5.94(4.52~7.58),5.33 (4.25~6.31) IU/ml, C基因型感染者DNA水平高于B基因型和B/C混合基因型感染者Gd均< 0.05) ；B基因型的血清HBeAg阳性率(54.91%)低于C基因型(64.18%)和B/C混合基因型(78.13%) Gd均< 0.05)，C基因型与B/C混合型HBeAg阳性率无统计学差异Gd=0.194);乙型肝炎携带组、慢性乙型肝炎组、肝硬化组、肝癌组、表面抗原携带组 DNA 载量分别为 7.92 (7.56 ~8.36),6.27 (5.15 ~6.96),4.71 (4.18 ~5.65)、3.41 (3.04~4.51),3.54 (3.09~4.35)IU/ml,乙型肝炎携带组DNA水平显著高于其他4组0°均< 0.001);慢性乙型肝炎组DNA水平与肝硬化组、肝癌组、表面抗原携带组差异均有统计学意义0°均< 0.001);肝硬化组DNA水平与肝癌组和表面抗原携带组差异也有统计学意义0°均< 0.05);而肝癌组DNA水平与表面抗原携带组的差异无统计学意义(TM).556)。
[0017]本发明的显著优点:本发明建立的双探针实时定量PCR法准确、灵敏、特异、重复性好，可以同时进行HBV DNA的定量检测和基因分型，适合于临床推广。
【专利附图】
【附图说明】
`[0018]图1为普通PCR扩增目的片段电泳图，其中:目的片段为182bp，Cl~C6泳道为C基因型标本，B6~BI泳道为B基因型标本。
[0019]图2为双探针实时荧光定量PCR典型扩增曲线图，左侧为Hex通道(B基因型)典型扩增曲线，右侧为FAM通道(非B基因型)典型扩增曲线。
[0020]图3为双探针实时荧光定量PCR标准曲线图，左侧为B基因型标准曲线，右侧为非B基因型标准曲线。
[0021]图4为双探针实时荧光定量PCR检测不同浓度标准品的扩增曲线图，左图为B基因型质粒标准品扩增曲线，右图为C基因型质粒标准品扩增曲线；两图中从左到右扩增曲线的标准品浓度分别为KTlO3 IU/ml。
[0022]图5中A表示定量分型双探针实时PCR法灵敏度:B、C基因型质粒能稳定检测的最低浓度均为500 IU/ml ;图5中B表示108IU/ml不同比例混合型质粒标准品扩增曲线:图5中B上图为C基因型质粒占优势时，不同比例B基因型质粒扩增曲线；图5中B下图为B基因型质粒占优势时，不同比例C基因型质粒扩增曲线。
[0023]图6为双探针实时荧光定量PCR与凯杰核酸定量试剂盒测定DNA结果的相关性。
[0024]图7为本发明与凯杰核酸定量试剂测定DNA结果一致性评价，其中:±1.96 SD:差值均数±1.96倍差值的标准差。【具体实施方式】
[0025]材料与方法 一、实验材料
1.对象
2012年2月至2012年12月福建医科大学附属第一医院住院和门诊HBV感染者539例，经血清学检测均为HBsAg、HBeAg或者HBeAb阳性，并排除甲、丙、戊型肝炎病毒感染和其他肝脏病变；男395例，年龄(37±13)岁，女144例，年龄(36±13)岁；均符合2010慢性乙型肝炎防治指南及第五届全国传染病和寄生虫病学术会议制定的病毒性肝炎防治方案诊断标准。此外，选取HBsAg阴性的丙型肝炎病毒感染、单纯疱疹病毒感染、人类乳头瘤病毒感染者各5例，其相应核酸检测均为阳性；另选择肝功能正常的健康志愿者5名。所有待检者均取静脉血5 ml,静置15 min，13 000 X ^离心10 min后，取血清-80°C保存待测。
[0026]2.主要试剂
病毒基因组核酸提取试剂盒上海捷瑞生物工程有限公司
DNA Marker天根生化(北京)有限公司
TaKaRa Taq ?宝生物工程(大连)有限公司
2X Premix Ex Taq?宝生物工程(大连)有限公司
琼脂糖(Agarose)上海生工生物工程公司
大肠埃希菌DH5a感受态细胞宝生物工程(大连)有限公司
高纯质粒小量制备试剂盒天根生化(北京)有限公司
HBV DNA核酸定量检测试剂盒深圳凯杰生物工程公司
HBV DNA荧光定量PCR检测试剂盒湖南圣湘生物科技有限公司 HBV测序分型试剂盒上海申友公司
HBV DNA国家标准品GBW (E) 090031 卫生部临检中心。
[0027]3.主要实验仪器
StepOne plus型荧光定量PCR仪美国ABI公司
LightCycler 480实时荧光定时PCR仪瑞士罗氏公司 WD-9413B凝胶成像分析仪北京六一仪器厂
DYY-7C型电泳仪北京六一仪器厂
Sff-CJ-ZF型医用超净工作台苏州净化设备有限公司生产
DK-8D型电热恒温水槽上海精宏实验设备有限公司
HDYD-2004B水平摇床北京六一仪器厂
超低温冰箱青岛海尔股份有限公司
微量移液枪德国Eppendorf公司
漩涡混合器上海医大仪器厂
台式高速离心机德国Eppendorf公司
AU2700全自动生化分析仪日本OLYMPUS公司
ARCHITECHi2000全自动免疫分析仪美国雅培公司。
[0028]二.实验方法1.引物和探针的设计
从GenBank数据库中查找提交的已明确基因型的HBV全基因组序列(A~I型)，用DNAman软件比对，找型特异性碱基聚集区，设计针对B基因型和非B基因型的Tqaman探针(B基因型探针Y端标记Hex荧光基团，非B基因型探针Y端标记FAM荧光基团，两者Y端均标记猝灭基团)；之后选取保守区，设计针对A~I基因型的保守引物，保守区能扩增所有基因型模板，而型特异性探针与对应的基因型扩增产物结合后，在PCR反应进行时，被Taq酶水解而发出荧光。扩增片段长度为182bp，所有引物和探针均经BLAST验证。
[0029]2.HBV基因组DNA的提取
抽提HBV DNA采用上海捷瑞生物工程有限公司的病毒基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)，按试剂说明书操作如下:
2.1.将冻存于_80°C的上述研究对象的血清取出，置于室温完全融化，旋窝振荡器混匀，瞬时离心，甩去管壁残留液体。
[0030]2.2在1.5 ml离心管中加入200 μ I上述血清，加入400 μ I DVI Buffer，混匀；加入 3 μ I Proteinase K,混匀，55°C保温 5 min。
[0031]2.3加入260 μ I无水乙醇，混匀，然后用I ml Tip头将样品全部转移到GENCLEAN 柱，柱子放入 2.0 ml Collection Tube。
[0032]2.4用台式离心机，10，000 rpm,室温离心I min。
[0033]2.5取下GENCLEAN柱，弃去离心管中的废液。将柱子放回同一根离心管中，加入500 μ I Wash solution, 10, 000 rpm,室温离心 I min。
[0034]2.6重复步骤5—次。
[0035]2.7取下GENCLEAN柱，弃去离心管中的全部废液。将柱子放回同一根离心管中，10,000 rpm,室温离心I min,以除去残留的Wash solution。
[0036]2.8将柱子放入新的无菌的1.5 ml离心管中，在柱子中央加入30 μ I ElutionBuffer,室温放置2 min。
[0037]2.9 10, 000 rpm，室温离心lmin。离心管中的液体即为病毒DNA。用紫外分光光度计测定抽提DNA纯度和浓度，-20°C保存。-20 °C保存备用。
[0038]3.常规 PCR
3.1.1反应体系
表1常规PCR反应体系
【权利要求】
1.一种可区分HBV B型和非B型的双探针实时定量PCR法，其特征在于:包括以下步骤:(I)通过对已明确基因型的HBV全基因组序列进行比对，选择保守区设计保守引物，即上游引物F和下游引物R，同时选择型特异性碱基聚集区设计针对B型和非B型的Taqman探针，其中B型探针5'端标记Hex荧光基团，非B型探针5'端标记FAM荧光基团，两者3'端均标记猝灭基团；(2)提取血清样本中HBV DNA ;(3)双探针实时荧光定量PCR:保守引物能扩增所有基因型HBV DNA，而B型探针只能结合B基因型HBV DNA，非B型探针能结合余下所有基因型HBV DNA，然后在PCR反应进行时，Taqman探针被Taq酶水解而发出荧光，通过监测扩增曲线，并记录荧光阈值，同时对HBV DNA进行分型和定量。
2.根据权利要求1所述的双探针实时荧光定量PCR方法，其特征在于:双探针实时荧光定量PCR的反应体系:2 X Premix Ex Taq 10 μ 1，20 μ mol/L上游引物F 0.2μ I,20ymol/L 下游引物 R 0.2μ 1，20 μ mol/L B 型探针 0.3 μ 1，20 ymol/L 非 B 型探针0.3μ 1,50XR0X 0.4μ 1，模板 2μ 1，ddH20 6.6 μ 1，总体积 20 μ I ;反应条件:95°C 30s，95°C 5s,60°C 30s 40个循环，在60°C选择Hex和FAM通道采集荧光信号，分别代表B基因型和非B基因型扩增，结果用ABI StepOne plus软件确定各样品的循环阈值。
3.根据权利要求1所述的可区分HBV B型和非B型的双探针实时定量PCR法，其特征在于:涉及的引物如下: 上游引物F
CTAGACTCGTGGTGGACTTCTC, 下游引物R
ATGAGGCATAGCAGCAGGAT， B型探针
TCGCAGTCCCAAATCTCCAGTCACTC, 非B型探针
TCGCAGTCCCCAACCTCCAATCA。
4.根据权利要求1所述的可区分HBVB型和非B型的双探针实时定量PCR法，其特征在于:以B基因型质粒作为B型扩增的标准品，C基因型质粒作为非B型扩增的标准品，分别绘制B基因型和非B基因型标准曲线，通过标准曲线对未知样品定量；同时对HBV DNA进行分型，若仅在Hex通道检出红色扩增曲线为B基因型，若仅在FAM通道检出绿色扩增曲线为非B基因型；若同时在Hex和FAM通道检出扩增曲线为混合基因型。
【文档编号】C12Q1/68GK103667439SQ201310332853
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年8月2日 优先权日:2013年8月2日
【发明者】欧启水, 王炜, 曾勇彬 申请人:福建医科大学附属第一医院