一组用于检测虹彩病毒的引物及检测方法
【专利摘要】本发明涉及一组用于检测虹彩病毒的引物及检测方法，所述的引物与虹彩病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增虹彩病毒的核苷酸序列的一部分。本发明所述检测虹彩病毒的方法，采用上述引物，通过环介导等温扩增法，特异性地扩增虹彩病毒的核苷酸序列的一部分，确认是否存在有扩增产物。本发明用于检测虹彩病毒的引物灵敏度高、特异性强；本发明虹彩病毒的检测方法，采用的环介导等温扩增反应，反应时间短、操作简单，能够满足市场的需求。
【专利说明】—组用于检测虹彩病毒的引物及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及海水鱼类感染病毒检测【技术领域】，特别涉及一种虹彩病毒的快速检测方法。
【背景技术】
[0002]虹彩病毒(Iridovirus)是近年来新发现的一种最严重的鱼类传染性病毒之一，可在野生和养殖的鱼类中引起较高的发病率和死亡率，能引起鲈脾肿大症、石首鱼暴发性传染病、真鲷虹彩病毒病、牙鲆淋巴囊肿病、石斑鱼慵懒病、甲鱼“红脖子病”等近百种水生动物疾病，症状主要表现在脾脏肿大及其细胞坏死等现象，死亡率高达30% (成年鱼)-100% (鱼苗)，危害性极大。近年来，这种病毒在东亚和东南亚地区引起的鱼类疾病已呈明显上升趋势，在海水养殖鱼类中有很多报道，致使鱼类大面积的死亡，造成了严重的经济损失，因而被称为“海洋口蹄疫”。
[0003]组织培养法一直是虹彩病毒检测的“金标准”方法，虽然其特异性较强，但检测步骤复杂，耗时较长，且灵敏度偏低。
[0004]近年来，针对虹彩病毒的检测，先后建立了间接荧光抗体检测方法、酶联免疫吸附(ELISA)检测方法等。然而这些免疫学检测方法也存在缺点，比如检测时间较长，往往需要5-6小时才能出结果，而且需要制备单克隆抗体，技术成本较高。
[0005]随着分子生物学的飞速发展，对虹彩病毒的检测手段也有了快速的发展。例如采用聚合酶链式反应(PCR)和实时聚合酶链式反应(real-time PCR)检测虹彩病毒。这些方法快速简单，灵敏度高，反应时间较以前的方法短，但仍需要较长时间，而且需要使用PCR仪等贵重仪器，对使用范围有限制。
【发明内容】
[0006]有鉴于此，有必要针对上述问题，提供一组用于检测虹彩病毒的引物及其检测方法。
[0007]一组用于检测虹彩病毒的引物，所述的引物与虹彩病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增虹彩病毒的核苷酸序列的一部分。
[0008]作为本发明一组用于检测虹彩病毒的引物，为SEQ ID N0.1~6所示的寡核苷酸，或者SEQ ID N0.1~6所示的寡核苷酸的互补链。
[0009]本发明还提供一种检测虹彩病毒的方法，采用的引物可以与虹彩病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增虹彩病毒的核苷酸序列的一部分；通过环介导等温扩增法，特异性地扩增虹彩病毒的核苷酸序列的一部分，确认是否存在有扩增产物。
[0010]作为本发明检测虹彩`病毒的方法的优选实施方式，本发明检测虹彩病毒的方法，所述的方法包括如下步骤:[0011](I)准备检测样本；
[0012](2)提取样本的总DNA ；
[0013](3)对步骤(2)的DNA进行环介导的等温核酸扩增反应，反应温度为60~65°C，反应时间为10~60分钟；
[0014](4)终止反应；
[0015](5)检测所述扩增引物。
[0016]作为本发明检测虹彩病毒的方法的优选实施方式，所述的方法的步骤(5)所述的检测是通过扩增产物凝胶电泳、扩增产物浊度观测或扩增产物化学发光检测的方法进行的。
[0017]作为本发明检测虹彩病毒的方法的优选实施方式，所述的检测样本选自下列样本:
[0018](I)海水鱼类的感染组织；或者
[0019](2)海水鱼类的细胞培养物。
[0020]本发明用于检测虹彩病毒的引物灵敏度高、特异性强；本发明虹彩病毒的检测方法，采用的环介导等温扩增反应，反应时间短、操作简单，能够满足市场的需求。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1是环介导等温扩增反应产物的特征性梯状条带和酶切鉴定电泳图:泳道M:marker ;泳道1:扩增产物用限制性内切酶Mst I酶切产物，得到217bp，252bp大小的两条主带，说明是特异性扩增；泳道2:扩增原始产物，表现出特征性的梯状条带，不能通过片段的大小来鉴别是否为非特异性扩增；
[0022]图2是等温孵育不同时间的产物含量的电泳图:在20分钟时就出现了特征性扩增条带，表明20分钟即可完成反应；泳道M:marker ;泳道N:阴性对照；其他泳道为不同时间的产物，数字代表时间，单位:分钟；
[0023]图3是灵敏度实验结果的电泳图:泳道M:marker ；泳道N:阴性对照；泳道O到一6表示病毒DNA模板按5倍稀释后(标号取5的对数log5，一 I即稀释5倍)的扩增产物；图上半部分是利用F3和B3做PCR的电泳结果，产物约210bp ;图下半部分是本发明方法的结果，可得该方法比PCR灵敏25倍左右；
[0024]图4是肉眼可视观察实验结果，省略电泳所需的时间和设备:P1和P2是阳性反应，NI和N2是阴性反应；其中，N2和P2都加了 SYBR Green I荧光染料；在Pl的体系中，可以看见混浊的白色副产物，稍微离心，可见沉淀于底部；P2中的染料由N2所显示的橙黄色(染料的本色)变为绿色。
【具体实施方式】
[0025]为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。
[0026]本发明中“核酸”或“多核苷酸”是指任何长度的含嘌呤和嘧啶的聚合物，可以是多核糖核苷酸，可以是多脱氧核糖核苷酸，或是混合的多核糖-多脱氧核糖核苷酸。它包括单链和双链分子，例如DNA-DNA，DNA-RNA和RNA-RNA杂合体，以及通过与氨基酸主链共轭碱基形成的“蛋白质核酸”(PNA)。它还包括含有修饰碱基的核酸。[0027]本发明中“引物”是长度约为5个至50个核苷酸的寡核苷酸，优选长度为大约6个至25个核苷酸，特别优选长度为大约6个至18个核苷酸，它与相关的单链核酸序列形成一个双链体，并且可以用例如DNA聚合酶使互补链发生聚合反应。
[0028]本发明中核酸序列的“互补链”是指参与与原始序列沃森-克里克碱基配对的反义序列。
[0029]实施例1
[0030]一组用于检测虹彩病毒的引物，所述的引物与虹彩病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增虹彩病毒核苷酸序列的一部分。所述的引物，为SEQ ID N0.1~6所示的寡核苷酸。
[0031]表1引物序列
[0032]
【权利要求】
1.一组用于检测虹彩病毒的引物，其特征在于:所述的引物与虹彩病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增虹彩病毒的核苷酸序列的一部分。
2.根据权利要求1所述的用于检测虹彩病毒的引物，其特征在于:所述的引物为SEQID N0.1~6所不的寡核苷酸,或者SEQ ID N0.1~6所不的寡核苷酸的互补链。
3.一种应用权利要求1或2所述的引物检测虹彩病毒的方法，其特征在于:采用的引物可以与虹彩病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增虹彩病毒的核苷酸序列的一部分；通过环介导等温扩增法，特异性地扩增虹彩病毒的核苷酸序列的一部分，确认是否存在有扩增产物。
4.一种应用权利要求3所述的引物检测虹彩病毒的方法，其特征在于:所述的方法包括如下步骤: (1)准备检测样本； (2)提取样本的总DNA； (3)对步骤(2)的DNA进行环介导的等温核酸扩增反应，反应温度为60~65°C，反应时间为10~60分钟； (4)终止反应； (5)检测所述扩增引物。
5.一种应用权利 要求4所述的引物检测虹彩病毒的方法，其特征在于:所述的方法的步骤(5)所述的检测是通过扩增产物凝胶电泳、扩增产物浊度观测或扩增产物化学发光检测的方法进行的。
6.一种应用权利要求4所述的引物检测虹彩病毒的方法，其特征在于:所述的检测样本选自下列样本: (1)海水鱼类的感染组织；或者 (2)海水鱼类的细胞培养物。
【文档编号】C12Q1/68GK103667521SQ201310340361
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年8月6日 优先权日:2013年8月6日
【发明者】曹永长, 薛春宜 申请人:中山大学