番茄环纹斑点病毒rt-lamp检测方法、引物组及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种番茄环纹斑点病毒RT-LAMP检测方法、引物组及其应用，发明人采用环介导等温扩增（LAMP）技术，并根据番茄环纹斑点病毒L片段的基因序列设计了相应的RT-LAMP检测引物组，包括外侧引物对F3和B3、内侧引物对FIP和BIP，由此发明了用于检测番茄环纹斑点病毒的RT-LAMP检测方法及试剂盒。应用本发明的检测方法及试剂盒，仅需通过对烟草、辣椒、番茄及杂草等疑似感染植株样品进行总RNA提取并进行环介导等温扩增，即可快速检测出是否感染番茄环纹斑点病毒，方便基层快速、准确、简便地进行病害鉴定，进而采取适当的防治措施，减少病害带来的损失。
【专利说明】番茄环纹斑点病毒RT-LAMP检测方法、引物组及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于番茄环纹斑点病毒检测【技术领域】，尤其涉及一种番茄环纹斑点病毒RT-LAMP检测方法、弓I物组及其应用。
【背景技术】
[0002]番爺环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus, TZSV)属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)番爺斑萎病毒属(Tospovirus)，是中国于2008年首次报道的Tospovirus的一个新种，该病毒可以通过汁液进行传播，也可由烟蓟马和西花蓟马进行传播。TZSV自然条件下可侵染番茄、辣椒、马铃薯和烟草等24种作物及杂草。TZSV在番茄、烟草的整个生长发育期均可侵染为害，苗龄愈小，环境温度愈高，发病愈重。2009年在广西靖西县的调查显示，TZSV发病率达10%以上的烟草面积约有2000亩，严重的地块发病率达41%，许多烟苗病死，烟田呈现严重的缺苗现象；德保县发病率达10%-30%以上的面积约1500亩，2010年病情依然较为严峻，病株率达10.17%。另据报道，该病害在云南昆明、玉溪、红河等多地均有发生，给当地的番茄、辣椒及烟叶生产造成严重的损失。2011年，由番茄环纹斑点病毒TZSV引起的病害在滇南、滇中烟区广泛发生，部分烟区大田发病率在3%?5%之间，重病田块达到20%左右。2012年，云南红河州泸西县由于TZSV侵染番茄造成5333.3hm2的番茄绝收，给当地的番茄生产造成了极大的损失。
[0003]目前针对番茄环纹斑点病毒的检测主要有电镜观察法、分子生物学方法、血清学方法，它们都需要昂贵的仪器(PCR仪、电镜等)，且较为费时。环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是一种先进的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在等温条件(65°C左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应，通过突光染色的方法在数分钟内即可 观察结果。该法不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。LAMP是一种崭新的DNA扩增技术，具有简便、快速、特异性强等特点，目前已广泛应用于人类或动植物的各种病毒、细菌等引起的疾病或病害的快速检测和快速诊断。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种简便、快速、特异性强的番茄环纹斑点病毒RT-LAMP检测方法、弓I物组及其应用。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:番茄环纹斑点病毒RT-LAMP检测弓I物组，包括外侧弓I物对F3和B3、内侧弓丨物对FIP和BIP，它们分别具有序列表SEQ.1D.N0.1 至 SEQ.1D.N0.4 的碱基序列。
[0006]番茄环纹斑点病毒RT-LAMP检测试剂盒，该试剂盒包括A试液，A试液为LAMP反应体系，含有 RT-LAMP Mix (2X )、AMV-Bst 混合液、RNase-Free Water、RT-LAMP 检测引物组。[0007]该试剂盒每剂A 试液含 RT-LAMP Mix (2X ) 12.5 μ 1、AMV-Bst 混合液 L 5 μ 1、RNase-Free Water2.8 μ 1、RT-LAMP 检测引物组 6.2 μ 1，其中 FIP 和 BIP 引物各 2.5μ 1，终浓度均为I μ M ;F3和B3引物各0.6 μ 1，终浓度均为0.25 μ M ;引物F3、B3、FIP和BIP分别具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的喊基序列。
[0008]该试剂盒还包括B试液和C试液；B试液含番茄环纹斑点病毒RNA，作为阳性对照；C试液为去离子水，作为阴性对照。
[0009]番茄环纹斑点病毒RT-LAMP检测方法，利用RT-LAMP检测引物组，在60_63°C恒温反应条件下，进行环介导恒温扩增反应30-120min，扩增完成后80°C再反应lOmin，然后利用琼脂糖凝胶电泳或荧光染色，鉴定植株样品是否感染番茄环纹斑点病毒；RT-LAMP检测弓I物组包括外侧弓I物对F3和B3、内侧弓I物对FIP和BIP，它们分别具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的喊基序列。
[0010]夕卜侧引物对与内侧引物对的浓度比例为1:4。
[0011]外侧引物对与内侧引物对的浓度分别为0.25μΜ和ΙμΜ。
[0012]上述番茄环纹斑点病毒RT-LAMP检测方法在烟草、辣椒、番茄或杂草上的应用。
[0013]本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术，并根据番茄环纹斑点病毒L片段的基因序列设计了相应的RT-LAMP检测引物组，包括外侧弓I物对F3和B3、内侧弓I物对FIP和BIP，由此发明了用于检测番茄环纹斑点病毒的RT-LAMP检测方法及试剂盒。应用本发明的检测方法及试剂盒，仅需通过对烟草、辣椒、番茄及杂草等疑似感染植株样品进行RNA提取并进行环介导等温扩增，即可快速检测出是否感染番茄环纹斑点病毒，方便基层快速、准确、简便地进行病害诊治，进而采取适当的防治措施，减少病害带来的损失。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1是不同反应温度条件下RT-LAMP扩增结果的电泳图，图中:M、DM2000标准分子量，1、健康烟草植株对照，2、601:，3、611:，4、621:，5、631:，6、641:，7、651:。
[0015]图2是RT-LAMP灵敏性实验电泳图。
[0016]图3是RT-PCR灵敏性实验电泳图。
[0017]图4是绿如蓝荧光染料检测RT-LAMP扩增产物紫外灯下照射结果图。
[0018]图2至图4中:M、DM2000标准分子量；1、健康烟草植株对照，2、1665ng/μ I，3U665X 10_1ng/y I, 4、1665 X 10_2ng/μ 1, 5、1665 X 10_3ng/μ 1, 6、1665 X 10_4ng/μ 1,7、1665Xl(T5ng/y 1，8、1665X l(T6ng/y 1，9、1665X l(T7ng/μ I。
[0019]图5是不同反应时间RT-LAMP扩增结果的电泳图，图中:M、DM2000标准分子量，1、健康烟草植株对照，2、30min, 3、40min, 4、60min, 5、80min, 6、IOOmin, 7、120min。【具体实施方式】
[0020]实施例1番茄环纹斑点病毒RT-LAMP弓I物设计
[0021]根据NCBI上已报道的番茄环纹斑点病毒L片段的基因序列(EF552435，NC020026)，结合对番茄环纹斑点病毒的测序结果，利用VECTOR NTI alignX进行比对分析，选取基因序列保守区域5080-6000nt,利用在线引物设计软件Primer Explorer V4设计引物，最后选取以下RT-LAMP检测引物组:
[0022]外侧引物对F3和B3，[0023]上游引物F3:CTCGGTTATTTTGTTAAACTCTTTG (见序列表 SEQ.1D.N0.1),
[0024]下游引物B3:TGAAATGGAGAATTTAGAAGTAGAC (见序列表 SEQ.1D.N0.2)。
[0025]内侧引物对FIP和BIP，
[0026]上游引物FIP:ACCTTCATGAAAATCAGGTATGGAA-TTCACTGACTTTCTTAGATTTAAGC (见序列表 SEQ.1D.N0.3),
[0027]下游引物BIP:CAACTGTTAAAGGGTGGCTGTTA-CTTGATGATGTCCGGAGAC (见序列表 SEQ.1D.N0.4)。
[0028]实施例2番茄环纹斑点病毒RT-LAMP反应体系的建立
[0029]通过设置不同终浓度的外侧(B3/F3)、内侧(BIP/FIP)引物配比，确定最优组合为 0.25“]?:14]\1;温度(601:、611:、621:、631:、641:、651:，结果见图 1)，反应时间(30min、40min、60min、80min、100min、120min,结果见图5),优化获得最佳的反应参数,从而建立番茄环纹斑点病毒的检测体系。优化的反应体系(25μ I)见表I。
[0030]表I优化的番茄环纹斑点病毒RT-LAMP反应体系
【权利要求】
1.番茄环纹斑点病毒RT-LAMP检测引物组，其特征在于包括外侧引物对F3和B3、内侧引物对FIP和BIP,它们分别具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的碱基序列。
2.一种番茄环纹斑点病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括A试液，A试液为 LAMP 反应体系，含有 RT-LAMP Mix( 2 X ),AMV-Bst 混合液、RNase-Free Water,RT-LAMP检测引物组。
3.根据权利要求2所述的番茄环纹斑点病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于该试剂盒每剂 A 试液含 RT-LAMP Mix (2X ) 12.5 μ 1、AMV-Bst 混合液 1.5 μ 1、RNase-FreeWater2.8 μ 1、RT-LAMP检测引物组6.2 μ I，其中FIP和BIP引物各2.5 μ I，终浓度均为I μ M ；F3和B3弓丨物各0.6 μ 1，终浓度均为0.25 μ M ;所述引物F3、Β3、FIP和BIP分别具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的喊基序列。
4.根据权利要求3所述的番茄环纹斑点病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括B试液和C试液；Β试液含番茄环纹斑点病毒RNA，作为阳性对照；C试液为去离子水，作为阴性对照。
5.一种番茄环纹斑点病毒RT-LAMP检测方法，其特征在于:利用RT-LAMP检测引物组，在60-63°C恒温反应条件下，进行环介导恒温扩增反应30-120min，扩增完成后80°C再反应lOmin，然后利用琼脂糖凝胶电泳或荧光染色，鉴定植株样品是否感染番茄环纹斑点病毒；所述RT-LAMP检测引物组包括外侧引物对F3和B3、内侧引物对FIP和BIP，它们分别具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的喊基序列。
6.根据权利要求4所述的番茄环纹斑点病毒RT-LAMP检测方法，其特征在于:所述外侧弓I物对与内侧引物对的浓度比例为1:4。
7.根据权利要求5所述的番茄环纹斑点病毒RT-LAMP检测方法，其特征在于:所述外侧引物对与内侧引物对的浓度分别为0.25 μ M和I μ M。
8.根据权利要求4所述番茄环纹斑点病毒RT-LAMP检测方法在烟草、辣椒、番茄或杂草上的应用。
【文档编号】C12Q1/70GK103436636SQ201310351007
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月13日 优先权日:2013年8月13日
【发明者】李战彪, 秦碧霞, 蔡健和, 徐鹏超, 韦学平, 周文亮, 林北森 申请人:广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所