一种双脱氧核苷修饰的引物方法、反应体系及其在突变检测中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种双脱氧核苷修饰的引物方法、反应体系及其在突变检测中的应用。本发明人结合3’末端封闭的引物和高保真DNA聚合酶的3’-5’外切酶校正功能，优化了一种操作简单快捷、灵敏性强、准确度高的检测方法，可广泛用于与点突变、单核苷酸多态性、插入和缺失突变检测相关的领域。
【专利说明】一种双脱氧核苷修饰的引物方法、反应体系及其在突变检 测中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于核酸检测【技术领域】，更具体地说，涉及一种双脱氧核苷修饰的引物方 法及基于该引物和高保真DNA聚合酶、非高保真DNA聚合酶的核酸扩增方法及用于点突变、 缺失、插入突变检测试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 点突变也称作单碱基替换，指由单个碱基改变发生的突变，可以分为转换和颠换 两类。转换是指嘌呤和嘌呤之间的替换或嘧啶和嘧啶之间的替换；颠换是指嘌呤和嘧啶之 间的替换。DNA分子中单碱基突变广泛存在于生物体遗传信息的编码中，是导致遗传性疾病 的重要原因之一。就人类基因组而言，在众多导致人类疾病的基因有义突变、病原体亚型以 及耐药基因的有义突变中，单碱基突变占了相当大的比例，其检测方法的探索一直是基因 诊断研究中的重要课题，特别是对已知有义突变的检测，将是临床进行基因诊断的重要手 段之一。
[0003] 单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，主要是指在染色体基 因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，而其中最少一种等位基因在群 体中的频率不小于1%。这种多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转 换或颠换所引起，也可由碱基的插入或缺失所致，但通常所说的SNP并不包括后两种情况。 SNP的检测分析，可应用于医学上疾病易感性研究，解释个体间的表型差异对疾病的易感程 度；可应用于药物基因组学及临床耐药研究，分析不同基因型个体对药物反应的差异，指导 药物开发及临床合理用药；可应用于种族遗传学和连锁不平衡性分析；还在基因组制图以 及遗传育种等方面有重大意义。
[0004] 实时荧光定量PCR (Real-Time PCR)是定量PCR的一种，指在PCR反应体系中加入 荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行 定量分析的方法。Real-Time PCR的检测方法包括：荧光染料嵌合法和荧光探针法。SYBR Green I是一种常用的荧光染料，能结合于所有dsDNA双螺旋的小沟区域。SYBR Green I与 dsDNA结合荧光信号可增强800-1000倍。在PCR反应体系中加入过量SYBR Green I荧光 染料，SYBR Green I荧光染料掺入DNA双链后，荧光信号增强，而不掺入链中的SYBR Green I染料分子荧光不变，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
[0005] 点突变、缺失和插入突变所造成的基因理化特性改变甚微，无疑使与之相 关的检测非常困难，目前对单核苷酸突变位点的检测技术主要包括：单链构象多 态性（Single-Strand Conformational Polymorphism，SSCP)技术、异源双链分析 (hereroduplex analysis，HA)技术、变性高效液相色谱法（Denaturing High Performance Liquid Chromatography， DHPLC)、变性梯度凝胶电泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)、化学错配裂解法（chemical mismatch cleavage，CMC)、焦憐酸序 列（Pyrosequencing)分析技术、质谱法（mass spectrometry)、DNA 芯片（DNA chip)技术、 限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism, RFLP)、等位 基因特异性 PCR(allele specific PCR，ASPCR)、分子信标（molecular beacons)技术等。 这些传统的检测方法大多操作复杂、费时繁琐且特异性、灵敏性及准确性较差。
[0006] 因此，本领域仍然需要开发优化的、结果稳定、重复性好的基因突变检测方法，以 应用于快速进行基因突变检测。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种基于高保真DNA聚合酶，非高保真DNA聚合酶和引物 末端封闭的核酸扩增方法及用于点突变（包括单核苷酸多态性）、缺失、插入（可为单碱基 或任意长度片段的插入、缺失）突变检测试剂盒及其应用。
[0008] 本发明的目的还在于提供在快速核酸诊断方面的试剂盒及其在病原微生物（细 菌、病毒等）的核酸检测方面的应用，以及在人类遗传性疾病、长寿衰老相关的基因、健康 风险相关的基因诊断以及药物代谢、疾病易感基因、药物基因组学研究中的应用。
[0009] 在本发明的第一方面，提供一种检测待测基因的待测突变位点上是否存在突变的 方法，所述方法包括：
[0010] ⑴以待测基因为模板，以正向引物和反向引物为引物，以高保真DNA聚合酶和非 高保真DNA聚合酶混合酶进行PCR扩增；
[0011] 所述的正向或反向引物中任一条为辨别性引物，以其3'末端碱基起算第1-8位 的任意1个或多个（1?8个，如2、3、4、5、6、7个）碱基对应待测突变位点，但与野生型序 列相应区段上碱基序列完全匹配；且，所述的辨别性引物的3'末端核苷戊糖3号C的羟基 进行双脱氧修饰；
[0012] 所述的正向或反向引物中辨别性引物以外的另一引物位于基因突变位点下游或 上游（当辨别性引物为正向引物时，该引物为反向引物，位于基因突变位点下游；当辨别性 引物为反向引物时，该引物则为正向引物，位于基因突变位点上游）且与相应区段上碱基 序列完全匹配；
[0013] (2)分析PCR扩增产物，若获得扩增产物，则表明待测基因的待测突变位点存在突 变；若未获得扩增产物，则表明待测基因的待测突变位点不存在突变。
[0014] 在本发明的另一方面，提供一种检测基因突变的方法，所述方法包括：
[0015] ⑴'以待测基因为模板，以正向引物和反向引物为引物，以高保真DNA聚合酶和 非高保真DNA聚合酶混合酶进行PCR扩增；
[0016] 其中，所述的正向或反向引物中任一条为辨别性引物，以其3'末端碱基起算第 1-8位的任意1个或多个（1?8个，如2、3、4、5、6、7个）碱基对应待测突变位点，但与突变 型序列相应区段上碱基序列完全匹配；且，所述的辨别性引物的3'末端核苷戊糖3号C的 羟基进行双脱氧修饰；
[0017] 所述的正向或反向引物中辨别性引物以外的另一引物位于基因突变位点下游或 上游（当辨别性引物为正向引物时，该引物则为反向引物，位于基因突变位点下游；当辨别 性引物为反向引物时，该引物则为正向引物，位于基因突变位点上游）且与相应区段上碱 基序列完全匹配；
[0018] (2) '分析PCR扩增产物，若获得扩增产物，则表明待测基因的待测突变位点不存 在突变；若未获得扩增产物，则表明待测基因的待测突变位点存在突变。
[0019] 在一个优选例中，所述的突变包括：点突变（包括单核苷酸多态性）、插入突变、缺 失突变（可为单碱基，也可为任一长度片段的插入或缺失突变，见原理图lb、lc)。
[0020] 在另一优选例中，正向引物长度15_30bp ;和/或正向引物长度15_30bp。
[0021] 在另一优选例中，所述的高保真DNA聚合酶是具有3' -5'外切酶活性的DNA聚合 酶；所述的非高保真DNA聚合酶是不具有3' -5'外切酶活性的DNA聚合酶。
[0022] 在另一优选例中，所述的高保真DNA聚合酶包括（但不限于）：Pfu DNA聚合酶、 PmncS?丨'ARV HS DNA聚合酶、Q5?超保真DNA聚合酶等。
[0023] 在另一优选例中，所述的非高保真DNA聚合酶包括（但不限于）：Taq DNA聚合酶、 Tth DNA聚合酶。
[0024] 在另一优选例中，所述的高保真DNA聚合酶与非高保真DNA聚合酶的比例是 (0? 05-0. 3) : 1 ;较佳地为（0? 1-0. 2) : 1 ;更佳地为（0? 14-0. 19) : 1。
[0025] 在另一优选例中，步骤（2)或（2'）中，通过电泳检测扩增产物；或通过荧光定量 方法检测扩增产物（如应用SYBR Green I检测扩增曲线）。
[0026] 在本发明的另一方面，提供一种用于检测待测基因的待测突变位点上是否存在突 变的检测试剂盒，所述试剂盒中包括：
[0027] 正向引物和反向引物，其一作为辨别性引物，以其3'末端碱基起算第1-8位的任 意1个或多个（1?8个，如2、3、4、5、6、7个）碱基对应待测突变位点，但与野生型或突变 型序列相应区段上碱基序列完全匹配；且，所述的辨别性引物的3'末端核苷戊糖3号C的 羟基进行双脱氧修饰；
[0028] 正向引物和反向引物中另一引物位于基因突变位点下游或上游（当辨别性引物 为正向引物时，该引物则为反向引物，位于基因突变位点下游；当辨别性引物为反向引物 时，该引物则为正向引物，位于基因突变位点上游）且与相应区段上碱基序列完全匹配；该 引物为正常引物，不经任何修饰；
[0029] 高保真DNA聚合酶；和
[0030] 非高保真DNA聚合酶。
[0031] 在本发明的另一方面，提供检测试剂盒的用途，用于检测待测基因（疾病相关基 因、药物代谢、药物治疗相关基因等）的待测突变位点上是否存在突变。
[0032] 在一个优选例中，所述的检测是非疾病诊断性的检测；例如，所述的检测是针对食 品、病原微生物（细菌、病毒等）的检测。
[0033] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【专利附图】
【附图说明】
[0034] 图la、高保真酶介导的3'末端封闭切除的扩增方法对点突变检测的原理图（其中 点突变位点位于正向引物3'末端最后一个碱基处）。
[0035] 图lb、高保真酶介导的3'末端封闭切除的扩增方法对插入突变检测的原理图。
[0036] 图lc、高保真酶介导的3'末端封闭切除的扩增方法对缺失突变检测的原理图。
[0037] 图2、本发明实施例1中引物3'末端不同修饰方式对PCR反应的封闭效果对比图。
[0038] 图3、本发明实施例2、3、4、5中高保真酶介导的3'末端封闭切除的扩增方法对点 突变、插入、缺失突变检测的电泳图。
[0039] 图4、本发明实施例6中高保真酶介导的3'末端封闭切除的实时定量PCR方法对 点突变检测的扩增曲线图。
[0040] 图5、本发明实施例7中高保真酶介导的3'末端封闭切除的扩增方法对点突变检 测的灵敏度分析图。
[0041] 图6、本发明实施例8中高保真酶介导的3'末端封闭切除的扩增方法对点突变检 测的特异性分析。
[0042] 图7、本发明实施例9中单用高保真DNA聚合酶与高保真和非高保真DNA聚合酶混 合酶对点突变检测效果的比较。
【具体实施方式】
[0043] 本发明人经过深入的研究，结合3'末端封闭的引物和高保真DNA聚合酶的3' -5' 外切酶校正功能，优化了一种操作简单快捷、灵敏性强、准确度高的检测方法，可广泛用于 与点突变、单核苷酸多态性、插入和缺失突变检测相关的领域。
[0044] 如本文所用，碱基的"匹配"或"配对"是指两条核苷酸序列中相应的碱基按照A与 T，G与C配对的原则形成反向互补的双链结构。本文所用"完全匹配"是指引物与模板之间 序列完全互补，不存在任何碱基错配。
[0045] 本发明中，"3号C"是指戊糖上的一个C，其编号是以戊糖上连接碱基的C为1号， 顺时针依次编号（如式（I))，位于第3位的C即称为"3号C"。
[0046]
【权利要求】
1. 一种检测待测基因的待测突变位点上是否存在突变的方法，其特征在于，所述方法 包括： (1) 以待测基因为模板，以正向引物和反向引物为引物，以高保真DNA聚合酶和非高保 真DNA聚合酶混合酶进行PCR扩增； 所述的正向或反向引物中任一条为辨别性引物，以其3'末端碱基起算第1-8位的任意 1个或多个碱基对应待测突变位点，但与野生型序列相应区段上碱基序列完全匹配；且，所 述的辨别性引物的3'末端核苷戊糖3号C的羟基进行双脱氧修饰； 所述的正向或反向引物中辨别性引物以外的另一引物位于基因突变位点下游或上游 且与相应区段上碱基序列完全匹配； (2) 分析PCR扩增产物，若获得扩增产物，则表明待测基因的待测突变位点存在突变； 若未获得扩增产物，则表明待测基因的待测突变位点不存在突变。
2. -种检测基因突变的方法，其特征在于，所述方法包括： (1) '以待测基因为模板，以正向引物和反向引物为引物，以高保真DNA聚合酶和非高 保真DNA聚合酶混合酶进行PCR扩增； 其中，所述的正向或反向引物中任一条为辨别性引物，以其3'末端碱基起算第1-8位 的任意1个或多个碱基对应待测突变位点，但与突变型序列相应区段上碱基序列完全匹 配；且，所述的辨别性引物的3'末端核苷戊糖3号C的羟基进行双脱氧修饰； 所述的正向或反向引物中辨别性引物以外的另一引物位于基因突变位点下游或上游 且与相应区段上碱基序列完全匹配； (2) '分析PCR扩增产物，若获得扩增产物，则表明待测基因的待测突变位点不存在突 变；若未获得扩增产物，则表明待测基因的待测突变位点存在突变。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的突变包括：点突变、插入突变、缺 失突变。
4. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的高保真DNA聚合酶是具有3'-5' 外切酶活性的DNA聚合酶；所述的非高保真DNA聚合酶是不具有3' -5'外切酶活性的DNA 聚合酶。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的高保真DNA聚合酶包括：PfuDNA聚 合酶、PrimeSTAR*HSDNA聚合酶、Q5?超保真DNA聚合酶等。
6. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的非高保真DNA聚合酶包括：TaqDNA 聚合酶、TthDNA聚合酶。
7. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的高保真DNA聚合酶与非高保真 DNA聚合酶的比例是（0. 05-0. 3) : 1 ;较佳地为（0. 1-0. 2) : 1 ;更佳地为（0. 14-0. 19) : 1。
8. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤⑵或（2'）中，通过电泳检测扩 增产物；或通过荧光定量方法检测扩增产物。
9. 一种用于检测待测基因的待测突变位点上是否存在突变的检测试剂盒，其特征在 于，所述试剂盒中包括： 正向引物和反向引物，其一作为辨别性引物，以其3'末端碱基起算第1-8位的任意1个 或多个碱基对应待测突变位点，但与野生型或突变型序列相应区段上碱基序列完全匹配； 且，所述的辨别性引物的3'末端核苷戊糖3号C的羟基进行双脱氧修饰； 正向引物和反向引物中另一引物位于基因突变位点下游或上游且与相应区段上碱基 序列完全匹配；该引物为正常引物，不经任何修饰； 高保真DNA聚合酶；和 非高保真DNA聚合酶。
10.权利要求9的检测试剂盒的用途，用于检测待测基因的待测突变位点上是否存在 突变。
【文档编号】C12Q1/68GK104450869SQ201310415707
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】张驰宇, 樊路娟, 蓝柯 申请人:中国科学院上海巴斯德研究所