稳定表达荧光素酶的人大肠癌sw480细胞系及其构建方法
【专利摘要】本发明涉及稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480-luc细胞系及其构建方法。该细胞系利用阳离子脂质体将携带荧光素酶报告基因和新霉素抗性基因的PGL4.51[luc2/CMV/neo]质粒转染入人大肠癌SW480细胞株；转染后的细胞加入G418，经过3次以上的单克隆化操作获得。该细胞系已构建成功，能稳定传代，在活体成像系统内可观察到发光情况，发光强度与细胞数量成正比，并且用细胞构建的活体（裸鼠移植瘤）模型在成像系统内亦能观察到肿瘤发光情况，使动态观察肿瘤在活体的生长转移等生物学活动具有可行性。
【专利说明】稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480细胞系及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞工程【技术领域】，涉及人大肠癌SW480细胞系的构建，尤其涉及稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480细胞系的构建方法。
【背景技术】
[0002]活体生物发光成像是一种新兴的成像技术，其原理是利用发光蛋白如荧光素酶催化光子释放的化学反应，最常用的蛋白是萤火虫荧光素酶，其机制是酶促反应，即荧光素酶在ATP和氧气存在时，催化荧光素酶底物产生氧化反应而发光，因此，这种发光现象必须在活细胞内进行。来自这种反应的光很明显，其散发光谱在400nm至620nm之间，易于被一种CXD相机记录。研究人员可通过荧光素酶标记的细胞、病毒、DNA、基因表达以及动物模型等进行科学研究。利用该成像系统可以直接快速的观察活体内肿瘤的生物学活动。
[0003]BALB/c裸鼠属于T细胞免疫功能缺陷动物，且用于活体成像时皮毛产生的自发荧光干扰较少，是建立体内异种移植瘤模型较理想的实验动物。
[0004]大肠癌包括结肠癌和直肠癌，是常见恶性肿瘤之一，在我国的发病率居高，手术是目前主要的治疗方法，而术后转移是影响患者预后的重要因素，因此研究大肠癌细胞的生物学活动对于寻找有效的大肠癌治疗方法十分重要。利用免疫缺陷动物建立人类肿瘤动物模型是研究肿瘤体内生长、转移等生物学特性的重要工具。因此对于大肠癌细胞通过荧光素酶标记，在活体成像系统内观察肿瘤发光情况，动态观察肿瘤在活体的生长转移等生物学活动，对于大肠癌的研究具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0005]本发明为了提供一种稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480细胞系及其构建方法，以实现在活体成像系统内观察肿瘤发光情况，动态观察肿瘤在活体的生长转移等生物学活动。
[0006]本发明是通过以下方案实现的:
上述的稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480-1UC细胞系，是通过以下方法获得:利用阳离子脂质体将携带有荧光素酶报告基因的质粒转染入人大肠癌SW480细胞株；转染后的细胞加入G418，经过3次以上的单克隆化操作，获得稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480-luc 细胞系。
[0007]所述的稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480-1UC细胞系，其中:利用阳离子脂质体将携带荧光素酶报告基因和新霉素抗性基因的PGL4.51质粒转染入人大肠癌SW480细胞株。
[0008]所述的稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480-1UC细胞系，其中:所述G418对SW480细胞株的最佳工作浓度为700ug/ml。
[0009]上述的稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480-luc细胞系的构建方法，具体包括以下步骤:首先，G418最佳筛选浓度的确定
SW480细胞常规培养于含有10%小牛血清的1640培养基；取对数生长期细胞，调整细胞浓度为I X 104/ml，每孔100 μ I接种于96孔板中，置于细胞培养箱常规培养；在细胞接种24h后，倍比稀释G418，建立0-lmg/mL10个梯度，加入96孔板中，每种浓度设置6个复孔；每天观察细胞生长情况，在10-14 d内使细胞全部死亡的最低G418浓度，即为筛选转染SW480细胞的工作浓度；
第二，细胞转染
取对数生长期的SW480细胞，转染前I天将细胞接种于6孔板，24 h内待细胞融合度达到70%-90%即可转染；转染按照LipofectamineTM2000试剂操作指南进行操作；转染后细胞置于培养箱常规培养；
第三，G418筛选抗性细胞及其单克隆化
质粒转染后48h，细胞1:10传代到24孔板，同时以相同的密度传代未转染的细胞作为对照；细胞贴壁后，加入G418，根据细胞死亡情况和培养基的营养状况及时换液；待对照组细胞全部死亡后，即得到初步抗性克隆。抗性克隆做荧光素酶活性检测，表达荧光素酶的克隆制备成单细胞悬液，接种于96孔板，待其增殖后转入24孔板扩大培养。重复此单克隆化过程3次，即得到稳定表达荧光素酶的SW480-1UC细胞。
[0010]所述的稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480-1UC细胞系的构建方法，还包括荧光素酶活性鉴定，具体鉴定方法为:SW480-luc细胞浓度分别为5.0X105/ml、2.5X105/ml、1.25X 105/ml,0.625X 105/ml,0.313X 105/ml 和 0.156X 105/ml，每孔 100 μ I 加入 96 孔白板中，每组设3个复孔；每孔加0.5 μ 130mg/ml的荧光素底物，37°C孵育lOmin，荧光照度计测荧光值；比较各克隆的荧光强度，并分析荧光强度与细胞数之间的相关性。所述G418对SW480细胞株的最佳工作浓度为700ug/ml。
[0011]有益效果:
本研究将稳定表达荧光素酶的SW480-1UC皮下接种裸鼠成功建立活体成像动物模型，为下一步动态观察肿瘤生长提供便利条件。SW480-lun细胞系已构建成功，能稳定传代，在活体成像系统内可观察到发光情况，发光强度与细胞数量成正比，并且用细胞构建的活体(裸鼠移植瘤)模型在成像系统内亦能观察到肿瘤发光情况，使动态观察肿瘤在活体的生长转移等生物学活动具有可行性。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为本发明实施例的活体成像步骤；
图2为本发明实施例的6个阳性克隆的发光值；
图3为本发明实施例的裸鼠体内SW480-1UC细胞发光情况。
【具体实施方式】
[0013]本发明的稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480细胞系(SW480-1UC)是通过以下方法获得:利用阳离子脂质体将携带有荧光素酶报告基因和新霉素抗性基因的质粒转染入人大肠癌SW480细胞株；转染后的细胞加入G418，经过3次以上的单克隆化操作，获得稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480-1UC细胞系。[0014]该稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480细胞系(SW480-1UC)的构建方法及鉴定，具体包括以下步骤:
首先，G418最佳筛选浓度的确定
SW480细胞常规培养于含有10%小牛血清的1640培养基；取对数生长期细胞，调整细胞浓度为I X 104/ml，每孔100 μ I接种于96孔板中，置于细胞培养箱常规培养；在细胞接种24h后，倍比稀释G418，建立0-lmg/mL10个梯度，加入96孔板中，每种浓度设置6个复孔；每天观察细胞生长情况，在10-14 d内使细胞全部死亡的最低G418浓度，即为筛选转染SW480细胞的工作浓度。
[0015]第二，细胞转染
取对数生长期的SW480细胞，转染前I天将细胞接种于6孔板，24 h内待细胞融合度达到70%-90%即可转染；转染按照LipofectamineTM2000试剂操作指南进行操作，即:500 μ IOPT1-MEM中加入500ug PGL4.51质粒，充分混匀，为溶液I ;溶液I中加入7 μ IPLUS,室温孵育5min ;再加入21 μ 1LTX,室温孵育30min后加入6孔板孔中；转染后细胞置于培养箱常规培养。
[0016]第三，G418筛选抗性细胞及其单克隆化
质粒转染后48h，细胞1:10传代到24孔板，同时以相同的密度传代未转染的细胞作为对照；细胞贴壁后，加入G418，根据细胞死亡情况和培养基的营养状况及时换液；待对照组细胞全部死亡后，即得到初步抗性克隆。抗性克隆做荧光素酶活性检测，表达荧光素酶的克隆制备成单细胞悬液，接种于96孔板，待其增殖后转入24孔板扩大培养。重复此单克隆化过程3次，即得到稳定表达荧光素酶的SW480-1UC细胞。
[0017]第四，荧光素酶活性鉴定
SW480-luc 细胞浓度分别为 5.0X 105/ml,2.5X 105/ml,1.25X 105/ml,0.625X 105/ml、0.313X 105/ml和0.156X 105/ml，每孔100 μ I加入96孔白板中，每组设3个复孔；每孔加0.5μ 130mg/ml的荧光素底物，37°C孵育lOmin，荧光照度计测荧光值；比较各克隆的荧光强度，并分析荧光强度与细胞数之间的相关性。
[0018]本研究中，我们利用阳离子脂质体将携带荧光素酶报告基因和新霉素抗性基因的PGL4.51[luc2/CMV/neo]质粒转染入人大肠癌SW480细胞株，参考图1的活体成像步骤:质粒PGL4.51图谱及观察发光的活体成像系统。因不同细胞株对G418耐受能力不同，本实验通过Ο-lmg/ml的10个浓度梯度实验筛选，确定G418对SW480细胞株的最佳工作浓度为700ug/ml。需要注意的是，转染后的细胞必须经过3次以上的单克隆化操作，才能获得遗传稳定的细胞克隆。本实验初步筛选出7个抗性克隆，测定荧光值后发现I个为假阳性克隆，6个为阳性克隆；参考图2的6个阳性克隆的发光值，图右侧为发光强度判定值，从下往上发光强度越强。荧光素酶催化底物反应属于高耗能过程，荧光素酶活性不能太高，因此，本实验选择荧光值稍低的SW480-1UC克隆I进行动物实验。BABL/c裸鼠属于T细胞免疫功能缺陷动物，且用于活体成像时皮毛产生的自发荧光干扰较少，是建立体内异种移植瘤模型较理想的实验动物。本研究将稳定表达荧光素酶的SW480-1UC皮下接种裸鼠成功建立活体成像动物模型，为下一步动态观察肿瘤生长提供便利条件，裸鼠体内SW480-1UC细胞发光情况，参考图3依序显示的分别在接种后第3天、10天、17天、24天观察到的情况。
[0019]SW480-lun细胞系已构建成功，能稳定传代，在活体成像系统内可观察到发光情况，发光强度与细胞数量成正比，并且用细胞构建的活体(裸鼠移植瘤)模型在成像系统内亦能观察到肿瘤发光情况，使动态观察肿瘤在活体的生长转移等生物学活动具有可行性。
【权利要求】
1.一种稳定表达突光素酶的人大肠癌SW480_luc细胞系，是通过以下方法获得:利用阳离子脂质体将携带有荧光素酶报告基因的质粒转染入人大肠癌SW480细胞株；转染后的细胞加入G418，经过3次以上的单克隆化操作，获得稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480-luc 细胞系。
2.如权利要求1所述的稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480-1UC细胞系，其特征在于:利用阳离子脂质体将携带荧光素酶报告基因和新霉素抗性基因的PGL4.51质粒转染入人大肠癌SW480细胞株。
3.如权利要求1所述的稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480-1UC细胞系，其特征在于:所述G418对SW480细胞株的最佳工作浓度为700ug/ml。
4.如权利要求1所述的稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480-1UC细胞系的构建方法，具体包括以下步骤: 首先，G418最佳筛选浓度的确定 SW480细胞常规培养于含有10%小牛血清的1640培养基；取对数生长期细胞，调整细胞浓度为I X104/ml，每孔100 μ I接种于96孔板中，置于细胞培养箱常规培养；在细胞接种24h后，倍比稀释G418，建立0-lmg/mL10个梯度，加入96孔板中，每种浓度设置6个复孔；每天观察细胞生长情况，在10-14 d内使细胞全部死亡的最低G418浓度，即为筛选转染SW480细胞的工作浓度； 第二，细胞转染 取对数生长期的SW480细胞，转染前I天将细胞接种于6孔板，24 h内待细胞融合度达到70%-90%即可转染；转染按照LipofectamineTM2000试剂操作指南进行操作；转染后细胞置于培养箱常规培养； 第三，G418筛选抗性细胞及其单克隆化 质粒转染后48h，细胞1:10传代到24孔板，同时以相同的密度传代未转染的细胞作为对照；细胞贴壁后，加入G418，根据细胞死亡情况和培养基的营养状况及时换液；待对照组细胞全部死亡后，即得到初步抗性克隆；抗性克隆做荧光素酶活性检测，表达荧光素酶的克隆制备成单细胞悬液，接种于96孔板，待其增殖后转入24孔板扩大培养；重复此单克隆化过程3次，即得到稳定表达荧光素酶的SW480-1UC细胞。
5.如权利要求4所述的稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480-1UC细胞系的构建方法，还包括荧光素酶活性鉴定，具体鉴定方法为:
SW480-luc 细胞浓度分别为 5.0X 105/ml,2.5X 105/ml,1.25X 105/ml,0.625X 105/ml,0.313X 105/ml和0.156 X 105/ml，每孔100 μ I加入96孔白板中，每组设3个复孔；每孔加0.5μ 130mg/ml的荧光素底物，37°C孵育lOmin，荧光照度计测荧光值；比较各克隆的荧光强度，并分析荧光强度与细胞数之间的相关性。
6.如权利要求4或5所述的稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480-1UC细胞系的构建方法，其特征在于:所述G418对SW480细胞株的最佳工作浓度为700ug/ml。
【文档编号】C12N15/85GK103468643SQ201310415831
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月13日 优先权日:2013年9月13日
【发明者】徐少勇, 王璠, 魏刚 申请人:十堰市人民医院