鱼类Tc1-like活性转座子及其用途
【专利摘要】本发明涉及鱼类Tc1-like活性转座子及其用途。具体提供了具有完整左右末端反向重复序列的转座子、可以编码转座酶的转座子及其编码的转座酶、含有上述转座子和转座酶的基因载体和基因转移系统。通过在斑马鱼中进行转座活性验证，证实上述转座子具备转座活性，所述的基因转移系统能在斑马鱼中进行高效转座，因而本发明为进一步验证转座子的转座效率以及采用该转座子在脊椎动物中进行相关研究及应用奠定了基础。
【专利说明】鱼类Tcl-1 ike活性转座子及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程【技术领域】，具体地说，涉及一种鱼类7b7_like活性转座子及其用途。
【背景技术】
[0002]转座子(Transposon)是一类不依靠同源重组而能在基因组内和基因组间跳跃移动的DNA序列，也被称为跳跃基因或可移动因子，其在自然界中分布广泛。根据其转座机制分为两类:反转座子和DNA转座子。7b7-like转座子是DNA转座子家族中种类最多、分布最广的一类。自Tcl转座子在线虫中被发现以后，与Tcl具有相似结构的转座子统称Tcl-1ike转座子，其家族的结构特征是具有一个编码转座酶的基因，两端具有末端反向重复序列。7b7-like转座子因为转座活性不同又分为两类:自主转座子和非自主转座子。在脊椎动物中7b7-like转座子大部分存在缺陷而失去转座活性，主要是转座酶开放阅读框中存在突变、移码、插入、缺失或终止密码子，导致不能编码有活性的转座酶，所以多数为非自主转座子。Ivics等人从鲑科鱼类中分离出失活的7b7-like转座子，利用分子重组技术构建出脊椎动物中第一个具活性并且能在哺乳动物细胞中转座的切(,Sleeping Beauty)转座子。最近，从鲽iplouroimctes pla tessa )基因组中鉴定的PPTN {Passport),被发现具有自然编码完整转座酶的功能，在哺乳动物细胞中表现出转座活性，成为脊椎动物中第一个有自然活性的7b7-like转座子。
[0003]转座子作为一种新型高效的转基因工具，正在被广泛地研究与应用于转基因育种、生物反应器、害虫防治、基因功能研究等方面，具有广阔的前景。例如，通过转座子在体外构建编码人们期望的有疾病抗性或改变生物体生长速度基因的载体质粒，将其导入受精卵，使之在染色体上正确整合，`在组织细胞中适当表达，培养出具有期望性状表型的转基因新品系，从而在较短时期内培育出常规方法不能或需要长期培育才能育成的品种；借助一个高效的转座载体，将外源基因导入生物内，使其稳定表达并遗传，有助于人们对目的生物进行更加深入的研究，为体细胞遗传学的研究和基因表达提供了一个高效、便捷的新系统，进而能改良经济生物的生产性能。而现今面临着转基因的稳定性、安全性等问题，只有通过今后进一步深入研究转座子系统及转座机制和宿主因子对其转化效率的影响，才能更好地推广转基因技术的发展。转座子技术作为基因功能分子的重要工具，特别是对于功能基因组学研究来说，不仅要确定序列的编码区和非编码区，还要鉴定其相关的生物功能。总之，发现更多的转座子及探明其结构机理，对于基因功能研究、育种等具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种分离的核苷酸序列。
[0005]本发明的再一的目的是，提供另一种分离的核苷酸序列。
[0006]本发明的另一的目的是，提供一种基因载体。
[0007]本发明的第四个目的是，提供一种转座酶。[0008]本发明的第五个目的是，提供一种基因转移系统。
[0009]本发明的第六个目的是，提供上述分离的核苷酸序列、基因载体、转座酶、基因转移系统的用途。
[0010]为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是:
一种分离的核苷酸序列，所述的核苷酸序列含有SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所不的核苷酸序列。
[0011]为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是: 一种分离的核苷酸序列，所述的核苷酸序列含有SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.7的核苷酸序列。
[0012]为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是:
一种基因载体，所述的基因载体包含:
A)—种分离的核苷酸序列，所述的核苷酸序列含有SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列，
和/或
B)一种分离的核苷酸序列，所述的核苷酸序列含有SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.7的核苷酸序列。
[0013]作为本发明的一种实施方式，所述的基因载体是以PTgf2-Mlyz2-RFP载体为基本载体，在pTgf2-Mlyz2-RFP载体的SpeI和XhoI位点插入SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列，在PTgf2-Mlyz2-RFP载体的BglII和KpnI位点插入SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列。
[0014]作为本发明的另一种实施方式，所述的基因载体是以PCS2+载体为基本载体，在PCS2+载体的XhoI和XbaI位点插入SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.7所示的核苷酸序列。
[0015]为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是:
一种转座酶，所述的转座酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.24所示。
[0016]为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是:
一种基因转移系统，所述的基因转移系统包含:
A)—种分离的核苷酸序列，所述的核苷酸序列含有SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列，
和
B)一种分离的核苷酸序列(所述的核苷酸序列含有SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.7的核苷酸序列)或转座酶(所述的转座酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.24所示)。
[0017]为实现上述第六个目的，本发明采取的技术方案是:
如上任一所述的分离的核苷酸序列、如上任一所述的基因载体、如上所述的转座酶、如上所述的基因转移系统在介导DNA导入细胞中的应用。
[0018]本发明优点在于:
分离得到具有完整左右末端反向重复序列的转座子Thml,以及可以编码转座酶的转座子采用Thml以及Thm3构建了 Thm转座系统,并且在斑马鱼中进行了转座活性验证。结果显示:在860条转基因斑马鱼中有448条观察的到红色荧光，荧光率约为52.1% ;对发育3个月有红色荧光表达的斑马鱼进行PCR检测，RFP基因的整合率约为66.67%。以上研究结果提示本发明筛选出了有活性的新型的转座子并且证明了转座系统能在斑马鱼中进行高效转座。为进一步验证转座子的转座效率以及采用转座子在脊椎动物中进行相关研究及应用奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是在18种鱼类中进行Tcl-1ike转座子PCR扩增的电泳图。
[0020]图2是基于不同物种Tcl类转座子核苷酸序列构建的分子系统树。
[0021]图3A是7b7_like转座子三种结构模式图。
[0022]图3B是Thml与Thm3序列相似度比对。
[0023]图3C是Thml全序列及分析。灰色区域为左右末端反向重复序列(ITRs)，白色字体的碱基序列为转座酶结合位点。
[0024]图4A和图4B是Thm3所编码氨基酸序列的分析结果。其中图4A为Thm3所编码氨基酸序列与SB、FP、PPTN转座酶氨基酸序列比对结果。图4B为Thm3全序列及所编码的氨基酸序列，灰黑区域为Thm转座酶的主要结构域。
[0025]图5 是 pTgf2-Mlyz2_RFP 载体图谱。
[0026]图6是转基因供体质粒及辅助质粒示意图。A:转基因供体质粒pThm-Mlyz2-RFP结构示意图:转基因辅助质粒pCS2-ThmTP结构示意图。
[0027]图7是转基因斑马鱼似^基因的荧光表达情况。A:显微镜透射光下28h的红色斑马鱼；B:显微镜荧光下28h的红色斑马鱼；C:显微镜透射光下出膜的红色斑马鱼；D:显微镜荧光下出膜的红色斑马鱼；E:自然光下IOOd的红色斑马鱼。
[0028]图8是转基因斑马鱼RFP基因的PCR检测电泳图谱。
【具体实施方式】
[0029]下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0030]实施例1
一、鱼类7b7_like转座子的获取和分析 I实验材料的采集及处理
实验用鲤 jtXCyprinus carpi o')、鲫 jtXCarassius aura tus ) > 花 ^iMemibarbusmacula tus Bleeker)、 麦 HiPseudorasbora parva)、 白勝 iHypophthalmichthysmolitrix、、青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskiiprzewalskii )、草鱼 iCtenopharynodon idellus、、团头 _ (Megalobrama amblycephala)> 河紙 iTakifugu)、黄颡鱼iPelteobagrus /WFit/raco )、长吻脆 iLeiocassis longirostris、I 自上海青浦全杰养殖场，青海湖裸鲤przewalskii przewalskii )>M^(Salmo trutta farioLinne )采自西藏自治区亚东县鲑鱼养殖场,青鏘(Oryzias la tipes )、罗非鱼(Tilapia )、俄罗斯鲟(Xcipenser gueldens taedti )、神仙鱼 iPterophyllums carale )、金鱼(Carassiusaara tes)、丹尼须氏把deni son H )采自上海海洋大学水产与生命学院养殖中心实验室。将所获得的不同鱼类的尾鳍置于75%乙醇中，_25°C保存备用。
[0031]2实验方法
2.1鱼类基因组总DNA的提取:采用盐析法
取各种鱼类的鱼鳍(约100-200mg)，剪碎，烘干(55°C，5-6min);加入裂解液(410 y L的 STE (pH=8.10), 80 u L 的 SDS (10%, pH=8.14)和 10 y L 的蛋白酶 K (20 y g/ml));翻转摇匀，56°C水浴保温14-15个小时；加入340-400 ii L饱和氯化钠溶液混匀，轻摇3min ;加入340-400 u L氯仿，摇匀；4°C 12000rpm离心20min，将上清液移入另一干净的离心管中；加A 450-500 u L，_20°C异丙醇离心，12000rpm, 20min, 4°C ;倒去上清液，留沉淀，加入800 u L75%乙醇；4°C离心12000rpm, 5-15min ;到去乙醇，烘干沉淀，加入100-200 u L的双蒸水，再加L的RNase，_25°C保存备用。本研究所有分子实验操作参照《分子克隆实验手册》(Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T.Molecular Cloning: A Laboratory Manual.2nd ed[M].Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.X
[0032]2.2 PCR扩增与检测
根据7b7-like转座子的保守区及相关文献设计单引物序列7b7-likeA:ACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACCSEQ ID N0.1)，以上述所获鱼类DNA 为模板，进行PCR扩增，PCR 扩增混合物中含 IOmmo 1/L Tris-HCl (pH 8.4)、20mmol/L KClU0mmol/L (NH4)2SO4'
1.5mmol/L MgCl2、0.lmmol/L 每种 dNTPs、弓丨物浓度为 0.2iimol/L,约 200ng。基因组 DNA、2U Taq酶，反应总体积为50 iiL。PCR扩增程序为:94°C预变性5min后；94°C 30s、51°C30s,72°C 2min，共35个循环；最后再72°C延伸lOmin。取3 y L PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，EB染色后，在Bio-Rad凝胶成像系统中照相记录。获得的基因片段的PCR产物经电泳分离、割胶回收、PCR产物纯化等步骤后TA克隆进pMD19-T载体(购于TaKaRa公司)，分别用载体通用引物 RV-M 5’- GAGCGGATAACAATTTCACACAGG -3’ (SEQ ID N0.2)和 M13-475’-CGCCAGGGTTTTCCC AGTCACGAC-3’ (SEQ ID N0.3)以及单引物 7T7-likeA 检菌，挑选定向的双阳性克隆进行测序，引物合成及测序工作均由上海生物工程有限公司提供。
[0033]2.3所获序列的生物信息学分析· 利用表1中的软件对获得的序列进行全面的生物信息学分析:在NCBI公共数据库中分析所获序列与已知的7b7-like转座子序列的同源性，将同源性大于70%的序列与已知7b7_like序列一起构建系统进化树，以期获得这些序列在7b7_like转座子家族的分子进化中的位置。同时对同源性大于70%的序列进行左右末端反向重复序列(ITRs)以及转座酶开放阅读框分析，以期获得具有左右末端反向重复序列(ITRs)以及能够编码340个氨基酸左右的序列。获得该序列后，将此序列可编码的氨基酸序列与已知有活性的 7b7_like 转座子 SB、FP (.Frog Prince，参见 Dong Liu, Cuiping You, ShaojunLiu, Liangguo Liu, Wei Duan, Song Chen, Jinpeng Yan, Yun Liu.Characterization of aNovel Tcl-Like Transposon From Bream (Cyprinidae, Megalobrama) and Its GeneticVariation in the Polyploidy Progeny of Bream - Red Crucian Carp Crosses[J].JMol EvoI, 2009, 69:395-403)、/^7}V的转座酶所对应的氨基酸序列进行比对分析，检测其是否具有7b7-like转座酶用于转座的主要结构域，以推测其是否具有转座活性。
[0034]表1 7b7_like转座子筛选生物信息学分析项目及使用软件
【权利要求】
1.一种分离的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列含有SEQ ID N0.4和SEQ IDN0.5所示的核苷酸序列。
2.一种分离的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列含有SEQ ID N0.6或SEQ IDN0.7的核苷酸序列。
3.一种基因载体，其特征在于，所述的基因载体包含权利要求1和/或2所述的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的基因载体，其特征在于，所述的基因载体是以pTgf2-Mlyz2-RFP载体为基本载体，在pTgf2_Mlyz2-RFP载体的SpeI和XhoI位点插入SEQID N0.4所示的核苷酸序列，在pTgf2-Mlyz2-RFP载体的BglII和KpnI位点插入SEQ IDN0.5所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求3所述的基因载体，其特征在于，所述的基因载体是以PCS2+载体为基本载体，在PCS2+载体的XhoI和XbaI位点插入SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.7所示的核苷酸序列。
6.一种转座酶，其特征在于，所述的转座酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.24所示。
7.一种基因转移系统，其特征在于，所述的基因转移系统包含: a)权利要求1所述的核苷酸序列；和 b)权利要求2所述的核苷酸序列或权利要求4所述的转座酶。
8.权利要求1或2所述的核苷酸序列、权利要求3-5任一所述的基因载体、权利要求6所述的转座酶、权利要求7所述的基因转移系统在介导DNA导入细胞中的应用。
【文档编号】C12N9/00GK103589717SQ201310418982
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年9月16日 优先权日:2013年9月16日
【发明者】邹曙明, 郭秀明, 蒋霞云 申请人:上海海洋大学