一种热稳定性提高的淀粉酶突变体及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种热稳定性提高的淀粉酶突变体及其制备方法和应用，属于酶工程领域。本发明利用分子生物学技术进行多轮定点突变获得了热稳定性提高的淀粉酶突变体，所得淀粉酶在60℃的半衰期由对照（突变前）例的3.2min提高到23.9min。利用此策略可以显著提高淀粉酶的热稳定性，为其工业化生产提供了基础。此策略对其它酶的性质改造具有重要的指导意义。
【专利说明】一种热稳定性提高的淀粉酶突变体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种热稳定性提高的淀粉酶突变体及其制备方法，属于酶工程领域。【背景技术】
[0002]α -淀粉酶(EC3.2.1.1)能够水解淀粉分子内部α -1, 4_葡萄糖苷键，水解产物为糊精、麦芽寡糖、麦芽糖和葡萄糖，在食品、纺织、医药和饲料等工业领域广泛应用。碱性淀粉酶在强碱性条件下水解淀粉的潜力，使其可以应用于淀粉加工、纺织退浆以及用于自动洗衣机的洗涤剂添加等工业领域。碱性淀粉酶退浆主要应用α-淀粉酶催化淀粉大分子链水解，生成分子质量较小、黏度较低和溶解度较高的低分子化合物，再经水洗即可去除。这种方法可以节省大量时间、降低环境污染，同时将对纺织物本身造成的损坏降至最低程度，因而受到印染工作者的重视。为了满足印染行业连续化生产的要求，需要淀粉酶能够在高温下使用，但是目前大多数淀粉酶在高温下的稳定性较差。
[0003]定点突变和定向进化是提高工业用酶热稳定性的两种主要手段。定向进化虽然不需要准确的酶分子结构信息，但是需要建立一种能够从大量的突变株中快速简便的筛选到优势菌株的方法。而定点突变，与定向进化相比，是一种更迅速、直接且节约成本的提高酶热稳定性的方法。本发明基于已得到的碱性淀粉酶在大肠中的表达平台，利用定点突变技术，对碱性淀粉酶进行分子改造，以期得到更适合工业应用的热稳定性提高的碱性淀粉酶。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的第一个问题是提供一种热稳定性提高的淀粉酶突变体，其相对亲本淀粉酶具有一个或多个氨基酸发生突变。
[0005]所述淀粉酶亲本的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0006]所述发生突变的氨基酸 位于淀粉酶蛋白结构的外表面(溶剂可接触面积大于100)或内表面(溶剂可接触面积小于5)，所述突变可以增强蛋白表面的静电相互作用或增强蛋白内部疏水相互作用。
[0007]所述一个氨基酸发生突变是淀粉酶第66位丝氨酸替换成缬氨酸、第98位赖氨酸替换成精氨酸、第166位天冬酰胺替换成精氨酸、第192位赖氨酸替换成精氨酸、第258位丝氨酸替换成精氨酸、第275位天冬酰胺替换成精氨酸、第317位谷氨酰胺替换成精氨酸、第349位谷氨酰胺替换成缬氨酸或第438位丝氨酸替换为缬氨酸，所得单突变体分别命名为 S66V、K98R、N166R、K192R、S258R、N275R、Q317R、Q349V、S438V。
[0008]所述多个氨基酸发生突变包括:
[0009](I)第98位赖氨酸替换成精氨酸、第166位天冬酰胺替换成精氨酸、第192位赖氨酸替换成精氨酸、第258位丝氨酸替换成精氨酸、第275位天冬酰胺替换成精氨酸及第317位谷氨酰胺替换成精氨酸，所得6重突变体命名为K98R/N166R/K192R/S258R/N275R/Q317R ；
[0010](2)第66位丝氨酸替换成缬氨酸、第349位谷氨酰胺替换成缬氨酸及第438位丝氨酸替换为缬氨酸，所得三重突变体命名为S66V/Q349V/S438V ；
[0011](3)将(I)、(2)中所述的9个位点同时进行突变，所得9重突变体命名为S66V/K98R/N166R/K192R/S258R/N275R/Q317R/Q349V/S438V。
[0012]本发明还提供一种所述淀粉酶突变体的制备方法，具体步骤如下:
[0013]I)根据SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，采用化学全合成的方法全合成基因后克隆到质粒pET-22b (+)中，构建重组质粒pAmyQ ；
[0014]2)利用Swiss-model软件对源自嗜碱芽孢杆菌淀粉酶(SEQ ID N0.1)进行模拟，获得淀粉酶空间结构，确定在淀粉酶催化结构域内进行氨基酸替换的位点；
[0015]3)设计突变引物，通过PCR对淀粉酶基因序列进行定点突变，获得含有突变淀粉酶序列的重组载体；
[0016]4)将突变后重组载体转化大肠杆菌BL21，诱导表达，离心收集发酵上清，获得淀粉酶突变体。
[0017]本发明提供的碱性淀粉酶单突变体或多重突变体热稳定性均显著提高，其中，9个位点同时突变的突变体在60°C的半衰期由对照(突变前)的3.2min的提高到23.9min。相对于采用筛菌或诱变等手段，缩短了酶学性质改造时间。将该碱性淀粉酶突变体应用于纺织、洗涤剂、制革等领域，可以在耐温耐碱环境下高效降解淀粉，具有广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1:pAmyQ的质粒图谱。
`[0019]图2:淀粉酶3D空间结构。
【具体实施方式】
[0020]实施例1淀粉酶突变位点的确定及突变体的获得
[0021 ] 通过Swiss-model软件对源自嗜碱芽孢杆菌的淀粉酶(SEQ ID N0.1)进行模拟，以获得的淀粉酶空间结构模型为基础，利用Macrodox软件计算出酶蛋白分子内所有氨基酸的溶剂可接触面积。一方面，选取位于蛋白表面的(溶剂可接触面积大于100)赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸，将它们替换成精氨酸，增强蛋白表面的静电相互作用，同时分析相应位点的氨基酸突变对酶分子内部形成氢键、盐桥的影响，确定进行以下位置处的氨基酸替换:Lys98Arg、Asnl66Arg> Lysl92Arg> Ser258Arg> Asn275Arg 和 Gln317Arg。另一方面，选取位于蛋白内部的(溶剂可接触面积小于5)天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸，将它们替换成缬氨酸，增强蛋白内部疏水相互作用；同时分析相应位点的氨基酸突变对酶分子内部疏水相互作用的影响，确定进行以下位置处的氨基酸替换:Ser66Val、Gln349Val和Ser438Val。基于以上分析，最终确定在如下位置处进行氨基酸替换:Ser66Val、Lys98Arg、Asnl66Arg、Lysl92Arg、Ser258Arg、Asn275Arg、Gln317Arg、Gln349Val 和 Ser438Val。
[0022]根据SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，采用化学全合成的方法全合成相应基因后，克隆到质粒pET-22b (+)中，构建重组质粒pAmyQ。
[0023]针对不同位点的定点突变，设计相对应的定点突变引物(表1)。以重组质粒pAmyQ为模版，利用定点突变引物对淀粉酶进行定点突变。采用PCR酶，利用突变引物对重组质粒PAmyQ进行扩增。将扩增后片段利用胶回收试剂盒进行回收纯化。将获得的纯化后片段，采用磷酸化试剂盒对片段两端进行磷酸化。将磷酸化后的片段，利用连接酶进行连接，获得单点突变后的重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌宿主BL21，进行诱导表达，获得单点突变后的重组淀粉酶。以单点突变后获得的重组质粒为模板进行下一轮的突变，最终获得多个位点突变后的重组淀粉酶。
[0024]表1淀粉酶突变引物序列
[0025]
【权利要求】
1.一种热稳定性提高的淀粉酶突变体，其特征在于，相对于具有SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的淀粉酶，在一个或多个氨基酸位点发生突变。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述发生突变的氨基酸位于淀粉酶蛋白结构的外表面或内表面。
3.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述发生突变的氨基酸是第66位丝氨酸、第98位赖氨酸、第166位天冬酰胺、第192位赖氨酸、第258位丝氨酸、第275位天冬酰胺、第317位谷氨酰胺、第349位谷氨酰胺或第438位丝氨酸。
4.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述I个氨基酸发生突变是淀粉酶第66位丝氨酸替换成缬氨酸、第98位赖氨酸替换成精氨酸、第166位天冬酰胺替换成精氨酸、第192位赖氨酸替换成精氨酸、第258位丝氨酸替换成精氨酸、第275位天冬酰胺替换成精氨酸、第317位谷氨酰胺替换成精氨酸、第349位谷氨酰胺替换成缬氨酸或第438位丝氨酸替换为缬氨酸，所得单突变体分别命名为S66V、K98R、N166R、K192R、S258R、N275R、Q317R、Q349V、S438V。
5.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述多个氨基酸位点发生突变是第98位赖氨酸替换成精氨酸、第166位天冬酰胺替换成精氨酸、第192位赖氨酸替换成精氨酸、第258位丝氨酸替换成精氨酸、第275位天冬酰胺替换成精氨酸及第317位谷氨酰胺替换成精氨酸，所得6重突变体命名为K98R/N166R/K192R/S258R/N275R/Q317R。
6.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述多个氨基酸位点发生突变是第66位丝氨酸替换成缬氨酸、第349位谷氨酰胺替换成缬氨酸及第438位丝氨酸替换为缬氨酸，所得三重突变体命名为S66V/Q349V/S438V。
7.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述多个氨基酸位点发生突变是将权利要求3中所述的9个位点同时进行突变，所得9重突变体命名为S66V/K98R/N166R/K192R/S258R/N275R/Q317R/Q349V/S438V。
8.—种权利要求1-7所述任一淀粉酶突变体的制备方法，其特征在于，具体步骤如下: 1)根据SEQ ID N0.1所示氨基酸序列，采用化学全合成的方法全合成基因后克隆到质粒pET-22b (+)中，构建重组质粒pAmyQ ； 2)利用Swiss-model软件对氨基酸序列如SEQID N0.1所示的酶的结构进行模拟，获得淀粉酶空间结构，确定在淀粉酶催化结构域内进行氨基酸替换的位点； 3)设计突变引物，通过PCR对淀粉酶基因序列进行定点突变，获得含有突变淀粉酶序列的重组载体； 4)将突变后重组载体转化大肠杆菌BL21，诱导表达，离心收集发酵上清，获得淀粉酶突变体。
9.权利要求1-7所述任一淀粉酶突变体在纺织、洗涤剂、制革、造纸、医药、食品领域的应用。
【文档编号】C12N9/28GK103484441SQ201310422992
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】陈坚, 刘龙, 邓壮梅, 堵国成, 杨海泉 申请人:江南大学