一种五氯酚降解菌及其生产方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物技术，具体为一种五氯酚降解菌及其生产方法和应用，利用微生物降解五氯酚污染物，适用于五氯酚污染或氯酚类化合物复合污染水体的生物修复。该降解菌为柠檬酸杆菌(Citrobacter)，于2013年6月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC保藏，保藏编号：CGMCC?No.7817，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。当五氯酚为唯一碳源时，该菌能很好的对五氯酚进行降解，72h对100mg/L的五氯酚的降解率可达90%。与其它菌株相比，该菌株具有高效的PCP降解能力、很好的环境适应能力及多种氯酚的耐受性能。该菌在五氯酚污染或氯酚类化合物复合污染水体的生物修复中具有很好的应用前景。
【专利说明】一种五氯酚降解菌及其生产方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术，具体为一种五氯酚降解菌及其生产方法和应用，利用微生物降解五氯酚污染物，适用于五氯酚污染或氯酚类化合物复合污染水体的生物修复。
【背景技术】
[0002]五氯酚(PCP)是典型的致畸、致癌、致突变的“三致”污染物，是世界上公认的优先污染物质。它属于持久性有机污染物，是当今环境治理的主要研究对象之一。五氯酚在环境中存在的浓度超过一定程度后，对人类和动植物都将产生严重的、具有潜伏性的危害。
[0003]在工作场所，空气、食物、土壤与饮用水可能暴露在低浓度的五氯酚中，人们可能因为这些而接触到五氯酚；此外，可能由于接触到五氯酚防腐的木材而接触到五氯酚。在有害废弃物弃置场附近，意外地泄漏会污染附近的土壤、水和空气，这种情况下，五氯酚的浓度一般会比较高。当人们吸入、食入或通过皮肤接触五氯酚时，五氯酚很容易的能进入到人的体内，最常见的方式是通过呼吸吸入和皮肤接触。经过短时间暴露后，五氯酚很快就排出体外。研究显示:五氯酚在人体内的半衰期约为33小时。在体内的五氯酚似乎不会积蓄很多，虽然大部分不会分解，但会通过泌尿系统排出体外，很少的一部分由粪便和呼吸系统排出。五氯酚对人体健康的危害，大部分与不纯的混合物有关，因工作或误用而在短时间暴露在高浓度五氯酚的环境中，会引起肝、肾、血液、肺、神经系统、免疫系统以及肠胃系统的损害。接触五氯酚(尤其是热蒸汽状态)会刺激皮肤、眼睛和嘴。若是人体摄入量太多，产生的热会使体温升高，甚至高到很危险的程度，引起不同组织器官的伤害，甚至引起死亡。因为没有足够可靠的有关影响人类健康的暴露浓度，所以在这方面，须通过对动物的实验获得，由动物实验结果显示，短时间暴露在高浓度五氯酚的环境中，会危害肝、肾、血液、肺、神经系统、免疫系统以及肠胃系统；长期低浓度暴露，主要危害的器官或系统是肝、肾、神经系统和免疫系统等，暴露浓度越高，其危害越大。美国联邦政府已经制定了取缔标准和指导要领，以保护人们免受空 气中的五氯酚污染而影响健康。空气中五氯酚的暴露浓度，平均一天暴露8小时，一周暴露40小时的容许浓度为5ppb (0.005mg/L)。
[0004]美国环保署规定饮用水中五氯酚的含量不能高于0.001mg/L，至于短期的暴露则是一天不能超过1.0mg/Lo美国环保署也估计,一个平均体重的成人一天暴露0.03mg/d,会引起属于癌症方面的危害。
[0005]目前，处理PCP的技术有物理化学降解(包括光催化氧化降解法、电化学降解法、超声波诱导降解法)和生物降解(包括氧化脱氯降解、还原脱氯降解、高效菌种法)。相比物理化学方法，生物法具有成本低、效率高、无二次污染、不破坏植物生长所需的土壤环境及易操作等特点，它在将来的PCP污染治理中将会有较广阔的前景，但生物法也有处理速度慢的缺点。因此，分离筛选高效的PCP降解菌种，对其降解能力进行分析。对照目前已知的PCP降解途径，分析所获取降解菌可能的降解途径，对其关键基因进行分析，以期构建高效工程菌株，应用于相关废水的处理当中。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种五氯酚降解菌及其生产方法和应用，获得能够高效快速降解五氯酚的菌株，解决五氯酚环境污染的问题，提高生物法处理速度。
[0007]本发明的技术方案是:
[0008]一种五氯酹降解菌，该降解菌为朽1檬酸杆菌Citrobacter sp.,于2013年6月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC保藏，保藏编号=CGMCCN0.7817，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0009]所述的五氯酚降解菌，该降解菌代号为0C9，菌落呈浅黄色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，显微镜观察为杆状，革兰氏染色阴性。
[0010]所述的五氯酚降解菌，该降解菌的菌株16SrDNA的GenBank登陆号为:KF657722。
[0011]所述的五氯酚降解菌的生产方法，具体步骤如下:
[0012](I)取I-2g化工厂污水池的污泥样品，用100-200mL无菌水稀释；
[0013](2)取0.5-ImL稀释液加入20-50mL液体LB培养基中，28-30°C，130-150rpm振荡培养20-24h，形成富集培养菌液；
[0014]液体LB培养基中，IL培养基的成分:NaC110g，酵母膏5g，蛋白胨10g，余量为水，pH=7.0 -7.5 ;
[0015](3)在无菌操作件下，将获得的富集培养菌液梯度稀释，稀释倍数为KT1-10_8，根据需要取稀释浓度的培养液10-100 μ 1，用`涂布棒均匀涂布在五氯酚浓度为50-IOOmg/L的无机盐培养基平板上，28-30°C倒置培养24h-48h，获得能够利用五氯酚生长的菌株;
[0016]无机盐培养基中，IL培养基的成分:NaC10.5-1.0g, K2HPO4L 5-2.0g,MgSO40.5 -1.0g, KH2PO40.5 -1.5g, NH4Cl0.5 -1.5g, NH4NO3L O -2.0g,酵母膏 0.05 -
0.lg，余量为水，ρΗ=6.5 -7.5。
[0017]所述的五氯酚降解菌的生产方法，对获得的菌株进行五氯酚耐受性测试，将其分别点种在五氯酚浓度为50-250mg/L的固体选择性平板上，挑取各平板上的优势菌落，继续划线至单菌落；将单菌落在相同条件下液体培养24h后，取ImL所得菌液加入30-50wt%的无菌甘油，-20--70°C保存。
[0018]所述的五氯酚降解菌的应用，五氯酚降解菌应用在氯酚类化合物污染水体生物修复中。
[0019]所述的五氯酚降解菌的应用，氯酚类化合物为五氯酚。
[0020]所述的五氯酚降解菌的应用，五氯酚降解菌对五氯酚的降解，合适降解条件为30°C>pH7.4。
[0021]所述的五氯酚降解菌的应用，将降解菌菌种活化后转入五氯酚初始浓度为50-100mg/L的无机盐培养基中，28-30°C，130-150rpm振荡培养4-5d，取菌液5mL，转入含有100-200mg/L五氯酚的无机盐培养基中，同样条件下培养至菌株生长；重复上述操作，至培养基中五氯酚的终浓度达200-400mg/L ；
[0022]所述的无机盐培养基中，IL培养基的成分:NaC10.5-1.0g, K2HPO4L 5-2.0g,MgSO40.5 -1.0g, KH2PO40.5 -1.5g, NH4Cl0.5 -1.5g, NH4NO3L O -2.0g,酵母膏 0.05 -
0.lg，余量为水，ρΗ=6.5 -7.5。[0023]所述的五氯酚降解菌的应用，当培养液中五氯酚终浓度为100mg/L，培养温度300C，培养液pH=7.4的条件下，降解菌菌株在24h到达对数生长期，96h到达稳定期，最高菌液浓度为OD6tltl=0.4 ;伴随细菌的生长，五氯酚的降解率逐步提高，至72h五氯酚的降解率达90%，然后随着细菌生长状态的稳定和新老交替，降解率缓慢提升，至测定终点168h，降解率达 93%。
[0024]本发明的优点及有益效果是:
[0025]本发明所提供的高效降解菌(0C9)来源于烟台化工厂废水池，经富集、驯化、分离、培养获得，其实施步骤为菌种的筛选与分离纯化、驯化、PCP降解能力测定及最适降解条件探索。本发明可以有效处理工业废水，在五氯酚污染或氯酚类化合物复合污染水体的生物修复中具有很好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为0C9的生长情况及PCP降解率的关系。其中，PCP终浓度为100mg/L，培养温度30°C，培养液pH=7.4。
[0027]图2为PCP浓度 对0C9生长及PCP降解率的影响。其中，培养温度30°C，培养液pH=7.4，培养时间96h。
[0028]图3为环境pH对0C9生长与PCP降解率的影响。其中，PCP终浓度为100mg/L，培养温度30°C，培养时间96h (小时)。
【具体实施方式】
[0029]实施例1:菌种分离与纯化
[0030]取I-2g来源于烟台化工厂污水池的污泥样品，用100-200mL无菌水稀释。取
0.5-ImL稀释液加入20-50mL液体LB培养基中(IL培养基的成分:NaC110g，酵母膏5g，蛋白胨10g，余量为水，pH=7.0-7.5)，28-30°C，130-150rpm (转/分钟)振荡培养20-24h。在无菌操作条件下，将获得的富集培养菌液梯度稀释(稀释倍数为KT1-10_8)，取合适稀释浓度的培养液10-100 μ I，用涂布棒均匀涂布在PCP浓度为50-100mg/L的无机盐培养基(IL 培养基的成分=NaCl0.5g，K2HPO4L 5g, MgSO40.5g, KH2PO40.5g, NH4Cl0.5g，NH4NO3L 0g，酵母膏0.05g，余量为水，pH=7.4)平板上，28-30°C倒置培养24h-48h。从而，获得能够利用PCP生长(降解五氯酚)的菌株。
[0031]对获得的菌株进行PCP耐受性测试。将其分别点种在PCP浓度为50，80，120，150，200，250mg/L的固体选择性培养基(IL培养基的成分=NaCl0.5，K2HPO4L 5g, MgSO40.5g, KH2PO40.5g, NH4Cl0.5g, NH4NO3L 0g，酵母膏 0.05g, PCP50 -250mg,余量为水，pH=7.0)平板上，挑取各平板上的优势菌落，继续划线至单菌落。将单菌落在相同条件下液体培养24h后，取ImL所得菌液加入30-50wt%的无菌甘油，-20-_70°C保存。对获得的菌株进行16SrDNA序列测定，采用细菌通用引物27F和1492R进行PCR扩增，反应总体系为，取PCR产物2-5 μ I进行lwt%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外检测.用琼脂糖凝胶纯化试剂盒(购自大连宝生物公司)切胶回收约1.5kb大小的PCR产物进行测序分析。菌株的16SrDNA序列测序结果登录GenBank,并用BLAST与GenBank中的16SrDNA序列进行同源性比较，将得到的相似菌株的16SrDNA，利用MEGA4.0软件，构建系统发育树，分析各分离菌株的进化地位。经鉴定:该降解菌的菌株16SrDNA的GenBank登陆号为KF657722，初步鉴定为柠檬酸杆菌。
[0032]该降解菌于2013年6月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC保藏，保藏编号:CGMCC N0.7817，其分类命名为柠檬酸杆菌Citrobacter sp.。
[0033]实施例2:0C9降解PCP的能力分析
[0034]将_80°C保存的0C9菌种接种至含有100mg/L PCP的无机盐培养基(见实施例1)中，培养12-24h，至0D600达到0.2-0.5，转入100mg/L PCP的无机盐培养基(见实施例1)中，28-30°C，130-150rpm振荡培养4-5d (天)，取菌液5mL，转入含有100mg/L PCP的无机盐培养基(见实施例1)中，同样条件下培养至菌株生长。重复上述操作，至培养基中PCP的终浓度达200mg/L。
[0035]将上述活化后的菌液，按照I-2wt%的接种量，接种于PCP浓度为100mg/L的无机盐培养基(见实施例1)中，28-30°C，130-150rpm振荡培养。分别于接种后第0，24，48，72，96，120，144，168h，取菌液测定菌体的浓度(600nm吸光值)。分别取上述时间点的培养基8-10ml，10000-13000rpm室温离心3-5min，上清液用0.22 μ m的滤膜过滤后，加入丙酮和二氯甲烷的混合液(体积比:丙酮/ 二氯甲烷=1/2-3)萃取三次。每次加入混合液的量分别为上清液体积I倍，0.5倍，0.5倍。将萃取液混合，避光，氮吹干燥。用无水甲醇溶解，定容至2mL。高效液相色谱法(HPLC)测定PCP残留量(HPLC条件:cl8柱子，柱温25°C，进样量5μ 1，流速lml/min，紫外检测波长为219nm，流动相甲醇:2g/L乙酸铵=7:3)。其PCP降解率与菌株的生长量关系。当培养液中PCP终浓度为100mg/L，培养温度30°C，培养液pH=7.4的条件下，0C9菌株在24h到达对数生长期，96h到达稳定期，最高菌液浓度为0D_=0.4。伴随细菌的生长，PCP的降解率逐步提高，至72h PCP的降解率达90%，然后随着细菌生长状态的稳定和新老交替，降解率缓慢提升，至测定终点168h，降解率达 93% (图1)。`
[0036]实施例3:降解条件测定
[0037]按照实施例2中菌株0C9的培养方法，将0C9驯化后，改变培养基中PCP的终浓度为100，300，400mg/L，测定菌体生长情况及PCP降解率。在培养温度为30°C，培养液pH=7.4的条件下，培养96h时，在PCP浓度100-300mg/L范围内，环境中PCP浓度的增加使得0C9的细菌浓度略有上升，但不明显。而当浓度超过300mg/L时，0C9的生长明显受到抑制。说明PCP对于其降解菌具有较强的抑制生长的效果。伴随PCP浓度的增加，0C9对于PCP的单位时间的降解能力显著下降。说明对于低浓度的PCP，该菌具有较好的降解效果(图2)。
[0038]将0C9接入含有100mg/L PCP的无机盐培养基(见实施例1)中，培养温度分别设置为30°C，改变培养基的pH分别为6.4,7.4,8.4，测定0C9的生长情况及PCP降解率，显示在中性条件下，0C9的生长和降解能力最好(图3)。
[0039]实施例结果表明，当五氯酚为唯一碳源时，该菌能很好的对五氯酚进行降解，72h对100mg/L的五氯酚的降解率可达90%。与其它菌株相比，该菌株具有高效的PCP降解能力、很好的环境适应能力及多种氯酚的耐受性能。该菌在五氯酚污染或氯酚类化合物复合污染水体的生物修复中具有很好的应用前景。
【权利要求】
1.一种五氯酚降解菌，其特征在于:该降解菌为柠檬酸杆菌Citrobacter sp.，于2013年6月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC保藏，保藏编号:CGMCC N0.7817，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
2.按照权利要求1所述的五氯酚降解菌，其特征在于:该降解菌代号为0C9，菌落呈浅黄色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，显微镜观察为杆状，革兰氏染色阴性。
3.按照权利要求1所述的五氯酚降解菌，其特征在于:该降解菌的菌株16SrDNA的GenBank 登陆号为:KF657722。
4.一种权利要求1所述的五氯酚降解菌的生产方法，其特征在于，具体步骤如下: (1)取I-2g化工厂污水池的污泥样品，用100-200mL无菌水稀释； (2)取0.5-ImL稀释液加入20-50mL液体LB培养基中，28-30°C，130-150rpm振荡培养20-24h，形成富集培养菌液； 液体LB培养基中，IL培养基的成分:NaC110g，酵母膏5g，蛋白胨10g，余量为水，pH=7.0 -7.5 ; (3)在无菌操作件下，将获得的富集培养菌液梯度稀释，稀释倍数为10—1-10_8，根据需要取稀释浓度的培养液10-100 μ 1，用涂布棒均匀涂布在五氯酚浓度为50-100mg/L的无机盐培养基平 板上，28-30°C倒置培养24h-48h，获得能够利用五氯酚生长的菌株； 无机盐培养基中，IL培养基的成分=NaCl0.5-1.0g, K2HPO4L 5-2.0g, MgSO40.5-1.0g，KH2PO40.5 -1.5g, NH4Cl0.5 -1.5g，NH4NO3L O -2.0g，酵母膏 0.05 -0.lg，余量为水，pH=6.5 -7.5。
5.按照权利要求4所述的五氯酚降解菌的生产方法，其特征在于，对获得的菌株进行五氯酚耐受性测试，将其分别点种在五氯酚浓度为50-250mg/L的固体选择性平板上，挑取各平板上的优势菌落，继续划线至单菌落；将单菌落在相同条件下液体培养24h后，取ImL所得菌液加入30-50wt%的无菌甘油，-20-_70°C保存。
6.一种按照权利要求1所述的五氯酚降解菌的应用，其特征在于:所述五氯酚降解菌应用在氯酚类化合物污染水体生物修复中。
7.按照权利要求6所述的五氯酚降解菌的应用，其特征在于:所述氯酚类化合物为五氯酚。
8.按照权利要求6所述的五氯酚降解菌的应用，其特征在于:五氯酚降解菌对五氯酚的降解，合适降解条件为30°C、pH7.4。
9.按照权利要求6所述的五氯酚降解菌的应用，其特征在于:将降解菌菌种活化后转入五氯酚初始浓度为50-100mg/L的无机盐培养基中，28-30°C，130-150rpm振荡培养4-5d,取菌液5mL,转入含有100-200mg/L五氯酹的无机盐培养基中，同样条件下培养至菌株生长；重复上述操作，至培养基中五氯酚的终浓度达200-400mg/L ； 所述的无机盐培养基中，IL培养基的成分:NaC10.5-1.0g, K2HPO4L 5-2.0g,MgSO40.5 -1.0g, KH2PO40.5 -1.5g, NH4Cl0.5 -1.5g, NH4NO3L O -2.0g,酵母膏 0.05 -0.lg，余量为水，ρΗ=6.5 -7.5。
10.按照权利要求9所述的五氯酚降解菌的应用，其特征在于:当培养液中五氯酚终浓度为100mg/L，培养温度30°C，培养液pH=7.4的条件下，降解菌菌株在24h到达对数生长期，96h到达稳定期，最高菌液浓度为0D600=0.4 ;伴随细菌的生长，五氯酚的降解率逐步提高，至72h五氯酚的降解率达90%，然后随着细菌生长状态的稳定和新老交替，降解率缓慢提升，至测定终点168h，降解率达93%。
【文档编号】C12R1/01GK103451138SQ201310425870
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】焦绪栋, 秦松, 李莉莉 申请人:中国科学院烟台海岸带研究所