一种随机突变获得的谷氨酸脱羧酶突变体基因及其编码蛋白质和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了两种pH作用范围拓宽的谷氨酸脱羧酶突变体，其DNA序列分别为SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.3，氨基酸序列分别为SEQ?ID?NO.2和SEQ?ID?NO.4。本发明结合随机突变（易错PCR）技术和DNA定点突变技术，对野生型谷氨酸脱羧酶GadB1编码基因进行分子改造，得到了两种突变酶GadB1T17I/D294G/Q346H和GadB1T17I/D294G/E312S/Q346H，相对野生酶其有效pH作用范围得到一定的扩展，尤其在偏中性pH条件下仍具有较好的活性。随着有效pH作用范围的拓宽，突变酶在pH5.5～6.5条件下，仍然具有较高的催化活性，因此解决了谷氨酸脱羧酶催化GABA生物合成时，在pH5.5～6.5时，催化能力低的问题，为利用该酶及其编码基因来生物合成GABA创造好的条件。
【专利说明】一种随机突变获得的谷氨酸脱羧酶突变体基因及其编码蛋白质和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及两种谷氨酸脱羧酶突变体基因及其应用，属于分子生物学的【技术领域】。
【背景技术】
[0002]定向进化属于非理性设计，是指通过在实验室中模拟达尔文自然进化过程，针对某一蛋白质酶的编码基因，通过易错PCR、DNA重组等技术来改造酶的基因，然后根据特定的改造目的，筛选有价值的突变酶。近10年来，定向进化技术已经在酶的相关性质改造领域取得了很多成功的案例，主要集中在提高催化活性，改进底物特异性，提高热稳定性等方面。定点突变(site-directed mutagenesis)属于理性设计,是指在目的DNA片段的指定位点引入特定的碱基对，从而改变其编码的氨基酸序列的技术。它是研究蛋白质结构与功能之间的复杂关系的强有力的工具，也是实验室常用的基因改造的手段。对某个已知的基因的特定喊基进行定点改造、缺失、或者插入，可以改变对应氣基酸序列和蛋白质的结构和功能特征，有助于了解蛋白质结构和功能的关系。尤其是，在利用随机突变等定向进化技术筛选得到具有效果的重要氨基酸位点后，然后对该位点进行定点突变分析，将有助于进一步了解该位点在蛋白质结构和功能的关系中所发挥的作用，所以理性设计和非理性设计的合理结合是蛋白质改造的一种重要技术手段。
[0003]谷氛酸脱竣酶(glutamatedecarboxylase,简称 GAD ；EC4.1.1.15)以 PLP 作为辅酶，催化谷氨酸发生不可逆的α-脱酸反应，过程中消耗一个质子，生成Υ-氨基丁酸(Y-aminbutyric，简称GABA)。GAD广泛存在于动物、植物、微生物中，但是在它们的机体里面的功能各不相同。其中在动物中主要是产生GABA，一种中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，因此具有重要的生理功能；在植物中，GAD系统可以抵抗多种压力，如骤然高温、缺氧、钙离子骤增等；在微生物中，特别是一些肠道细菌，如大肠杆菌、乳酸菌等，主要与机体耐酸机制有关，它们的最适PH —般在4~5，在此范围之外酶活力会大幅降低，尤其是当pH大于6时基本失去活性，这使得利用该酶生物合成GABA受到体系pH值的严重限制，因此需要拓宽GAD酶的pH作用范围，使其在偏中性条件下，仍具有较好的活性，解决谷氨酸脱羧酶催化GABA生物合成时，在pH5.5~6.5时，催化能力低的问题，为利用该酶及其编码基因来生物合成GABA创造好的条件。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供了两种谷氨酸脱羧酶突变体，核苷酸序列如SEQID N0.1和SEQ ID N0.3所示。其编码的突变体酶在偏中性条件下，酶活有明显的提高，解决了野生型的谷氨酸脱羧酶在偏中性PH条件下催化活性低的问题，为利用该酶催化GABA生物合成创造好的条件，氨基酸序列如SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4所示。其中SEQ ID N0.3所示突变体是在SEQ ID N0.1所述突变体基础上将312位氨基酸由谷氨酸突变为丝氨酸获得，其氨基酸序列如SEQ ID N0.4。
[0005]获得SEQ ID N0.2所示谷氨酸脱羧酶突变体的方法为在中国专利CN201110020606.8中公布的gadBl基因序列基础上，对其编码的氨基酸进行取代，所述氨基酸取代点为第17位的苏氨酸、第294位的天冬氨酸和第346位的谷氨酰胺。
[0006]获得SEQ ID N0.4所示谷氨酸脱羧酶突变体的方法为在中国专利CN201110020606.8中公布的gadBl基因序列基础上，对其编码的氨基酸进行取代，所述氨基酸取代点为第17位的苏氨酸、第294位的天冬氨酸、第312位的谷氨酸和第346位的谷氨酰胺。[0007]本发明还提供了一种针对上述突变体的指示剂平板筛选方法，具体方法为:将突变库中的转化子转移到筛选板上，30°C培养IOh后，挑取在菌落周围变绿色的单菌落。筛选板的配方为:在LB固体培养基中含有1.2g/L L-Glu、30mg/L卡拉霉素、1/10000甲基红-亚甲基指示剂，待平板凝固后，在每个培养皿上涂布10 μ LlM IPTG，然后正面放置30min。
[0008]上述突变体基因及其所编码氨基酸在生物合成GABA的应用均属于本发明要求保护的范围。
[0009]本发明还提供了一种生产上述谷氨酸脱羧酶突变体的方法，是将SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列以pET28a或能表达该酶的质粒为表达载体，以大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)或能表达该酶的菌株为表达宿主，实现突变体基因
gadB1T17I/D294G/Q346H 和 gadB ^i7IZD294GZE3I2SZQ346H 的高效表达。
[0010]本发明所用的谷氨酸脱羧酶的基因gadBl来自产Y-氨基丁酸的短乳杆菌，该菌株已于2010年12月27日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国武汉、武汉大学，保藏编号:CCTCC NO:M2010367，分类学命名短乳杆菌 Lb85 (Lactobacillus brevis Lb85),gadBl的测序结果在中国专利CN201110020606.8中已经公布，序列见SEQ ID N0.5。
[0011]本发明的具体方法如下:第一，以来自L.brevis Lb85的谷氨酸脱羧酶基因gadBl为模板，通过易错PCR获得随机突变文库，采用平板指示剂筛选和粗酶液酶活测定两步筛选法获得需要的突变酶，扩大培养，表达、纯化后得到突变酶GadBl—46H，并测定其最适pH ;第二，以第一步筛选得到的突变体基因为模板，进行E312S定点突变，构建突变体，以质粒pET28a或能表达该酶的载体为表达载体，将重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)细胞或能表达该酶的宿主细胞，挑选验证后的阳性单菌落进行扩大培养，表达、纯化后得到突变酶
GadB1T17I/D294G/E312S/Q346H；并测定其最适邱。
[0012]本发明中表达单元的启动子为常用的T7启动子，在T7启动子的作用下，突变体酶可以直接在宿主细胞E.coli BL2KDE3)中，完成胞内的可溶性表达。
[0013]本发明在gadBl的基础上进行易错PCR随机突变和定点突变，提高了突变酶在pH5.5 ~6.5 条件下的催化能力。通过 SffISS-MODEL (http: //swissmodel.expasy.0rg/)在线模拟突变体酶的三维结构(图5)，然后通过分析氢键作用力，发现突变酶中氨基酸替换后，在中性条件下可能会增大活性槽开口的角度，这样会增加酶与底物结合空间，减小它们结合的空间位阻。随着突变酶的有效PH作用范围的扩展，能够更好的运用突变体酶，在pH5.5~6.5的条件下，催化GABA的生物合成。
[0014]本发明通过比较野生酶GadBl和突变酶(^1(^11171/1)294_461!、63(^严1/1)294_1—34? 的有效作用PH范围和体外的催化能力，结果发现在pH6.5下，突变体酶GadB1—η将L-谷氨酸转变成GABA的转化率为野生型的10.6倍；突变体酶GadBlTm/D294G/E312S/Q346H将L-谷
氨酸转变成GABA的转化率为野生型的5.9倍。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为重组质粒pET28a(+)-gadBl的构建图谱:
[0016]图2为定点突变的原理示意图:
[0017]图3为平板初筛的颜色变化图:
[0018]图4为野生型和突变型酶纯化后的SDS-PAGE图谱:
[0019]图5为带有突变位点的谷氨酸脱羧酶的模拟的空间结构:
[0020]图6为野生和突变酶的最适pH变化图:
【具体实施方式】
[0021]以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。材料和试剂:
[0022]所用的限制性内切酶、T4DNA连接酶、PCR试剂等均购于TaKaRa宝生物公司；质粒提取试剂盒、基因组提取试剂盒、琼脂糖纯化试剂盒、大肠杆菌JM109、BL21(DE3)菌株购于天跟生物公司；引物购于上海捷锐公司；SDS-PAGE试剂盒购于碧云天生物公司；其他试剂均为国内或者国外购买的分析纯试剂。
[0023]实施例一:重组质粒的构建
[0024]本发明以PCR方法获取gadBl序列，但不限于PCR方法。
[0025]将L.brevis Lb85(菌株在相关文献中公开，已保存于武汉大学，保藏编号:CCTCCNO:M2010367，并在中国专利CN201110020606.8中公开)培养至指数生长中期，取3 mL菌液12000rpm离心I min弃上清，溶菌酶处理0.5 h，然后按照试剂盒说明提取基因组DNA。
[0026]设计如下的引物来用于gadBl的扩增:
[0027]gadBl-F:5’ ~GACCGCTCATATGGCTATGTTGTATGGAAAAC~3J
[0028]gadB1-R: 5，~CGTGAATTCTTAGTGCGTGAACCCGTATT~3，
[0029]其中上游引物酶切位点为NdeI CgadBl-F中下划线部分)，下游引物酶切位点为EcoRI (gadBl-R中下划线部分)。
[0030] PCR扩增条件:94°C变性 5min，34个循环(95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 90s)，最后 72°C延伸IOrnin0
[0031]扩增产物纯化后，用NdeI和EcoRI对PCR产物和载体pET28a进行双酶切，两者的回收产物，用T4连接酶22°C下连接4h，化学转化到JM109细胞中，待平板上长出转化子之后，挑取转化子液体培养，提取质粒，通过酶切和PCR验证获得重组质粒pET28a-gadBl (图1)，然后将重组质粒转到BL21 (DE3)细胞，得到BL21 (DE3)/pET28a-gadBl工程菌。
[0032]实施例二:利用随机突变来构建谷氨酸脱羧酶的突变文库
[0033]利用易错PCR技术在体外向谷氨酸脱羧酶基因gadBl引入核苷酸突变。
[0034]易错PCR的反应条件和引物:(50 UL体系)
[0035]
【权利要求】
1.一种谷氨酸脱羧酶突变体基因，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID N0.1。
2.权利要求1所述突变基因编码的谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于:其氨基酸序列如 SEQ ID N0.2。
3.权利要求1所述的突变体，其特征在于其312位氨基酸由谷氨酸突变为丝氨酸，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
4.权利要求3所述突变基因编码的谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于:其氨基酸序列如 SEQ ID N0.4。
5.获得权利要求2所述谷氨酸脱羧酶突变体的方法，其特征在于:在中国专利CN201110020606.8中公布的gadBl基因序列基础上，对其编码的氨基酸进行取代，所述氨基酸取代点为第17位的苏氨酸、第294位的天冬氨酸和第346位的谷氨酰胺。
6.获得权利要求5所述谷氨酸脱羧酶突变体的方法，其特征在于:在中国专利CN201110020606.8中公布的gadBl基因序列基础上，对其编码的氨基酸进行取代，所述氨基酸取代点为第17位的苏氨酸、第294位的天冬氨酸、第312位的谷氨酸和第346位的谷氨酰胺。
7.权利要求2或4所述突变体的指示剂平板筛选方法，其特征是:将突变库中的转化子转移到筛选板上，30°C培养IOh后，挑取在菌落周围变绿色的单菌落。筛选板的配方为:在LB固体培养基中含有1.2g/L L-Glu、30mg/L卡那霉素、1/10000甲基红-亚甲基指示剂，待平板凝固后，在每个培养皿上涂布10 μ LlM IPTG，然后正面放置30min。
8.权利要求1或3所述突变体基因及其所编码氨基酸在生物合成GABA的应用。
9.一种生产权利要求2或4所述两种谷氨酸脱羧酶突变体的方法，其特征是将SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列以pET28a或能表达该酶的质粒为表达载体，以大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)或能表达该酶的菌株为表达宿主，实现突变体基因gadB1T17I/D294G/Q346H 和职诎训SAB 棚的高效表达。
【文档编号】C12N15/70GK103484489SQ201310438191
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月24日 优先权日:2013年9月24日
【发明者】史锋, 谢一龙, 李永富, 李烨 申请人:江南大学