一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株。本发明所提供的不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株具体为黄曲霉（Aspergillus?flavus）GZ-17，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC?No.8050。实验证明，本发明所提供的黄曲霉菌株GZ-17对产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株产毒有抑制作用，在该菌株与产毒菌的孢子浓度比为105:105时，该不产毒菌对产毒菌的抑制产毒率达到近96%。该菌株对于抑制产毒黄曲霉侵染农产品、降低农产品中黄曲霉毒素污染具有重要意义。
【专利说明】一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于农产品安全领域，涉及一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株，以及该菌株在抑制黄曲霉产毒方面的应用。
【背景技术】
[0002]黄曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)—类主要由黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)等真菌产生的次级代谢产物,现已分离出AFB1、AFB2、AFG1、
18种不同结构的黄曲霉毒素，其中最重要的是AFBpAFByAFGpAFGy在我国，黄曲霉毒素主要由黄曲霉产生。黄曲霉毒素具有致癌、致畸、致细胞突变的作用，被世界卫生组织(WHO)认定为一级致癌物，严重影响人类健康，其中AFB1的毒性最强，其毒性为氰化钾的10倍、砒霜的68倍。黄曲霉毒素主要污染花生等作物，严重影响我国花生及其制品的出口，给我国的出口贸易带来了巨大损失。因此，有效防控黄曲霉毒素污染，对于保障我国食品安全和维护国家经济利益具有重要意义。
[0003]其中，利用不产毒黄曲霉或寄生曲霉来抑制产毒菌菌群数量及产毒量是防控黄曲霉毒素污染的重要手段。美国环境保护协会注册了两株不产毒的黄曲霉菌株，用于防治棉花和花生黄曲霉毒素污染，并在美国多个州的试验田中广泛试用。但是来自不同地区的不产毒菌株在抑制产毒菌方面有一定的适用范围，例如非洲筛选获得的不产毒菌能较好地抑制当地黄曲霉产毒，而美国筛选得到的菌株在抑制非洲产毒黄曲霉产毒方面就没有很好的效果。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株，以及该菌株在抑制黄曲霉产毒方面的应用。
[0005]本发明提供的黄曲霉菌株具体为黄曲霉(Aspergillus flavus)GZ_17。该菌株已于2013年8月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC N0.8050。
[0006]所述黄曲霉(Aspergillus flavus) GZ-17CGMCC N0.8050缺失黄曲霉毒素合成基因aflT、黄曲霉毒素合成基因pksA、黄曲霉毒素合成基因nor-Ι、黄曲霉毒素合成基因fas-2、黄曲霉毒素合成基因fas-Ι、黄曲霉毒素合成基因aflR、黄曲霉毒素合成基因aflj、黄曲霉毒素合成基因adhA、黄曲霉毒素合成基因estA、黄曲霉毒素合成基因norA、黄曲霉毒素合成基因ver-Ι、黄曲霉毒素合成基因verA ;因此,该菌株不能合成黄曲霉毒素。其中，ver-Ι和verA这两个基因，它们是黄曲霉毒素合成`必须基因，是4种黄曲霉毒素(B1、B2、GpG2)最终形成的最关键的两个基因。
[0007]所述黄曲霉(Aspergillus flavus) GZ-17CGMCC N0.8050在抑制产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒中的应用也属于本发明的保护范围。[0008]一种用于抑制产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒的菌剂，它的活性成分为所述黄曲霉(Aspergillus flavus) GZ-17CGMCC N0.8050。
[0009]在上述应用或菌剂中，所述黄曲霉(Aspergillus flavus)GZ_17CGMCC N0.8050可为分生孢子或/和菌丝体。
[0010]在上述应用或菌剂中，所述抑制产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒体现在:使所述产黄曲霉毒素的黄曲霉的产毒素量降低，具体如使所述产黄曲霉毒素的黄曲霉在农产品中的产毒量降低。
[0011]所述农产品可为谷物、油料作物、坚果、香辛料、饲料原料、中草药和水果等。在本发明的一个实施例中，所述农产品为花生，具体为含水量20% (质量百分含量)的花生。
[0012]在上述应用中，在抑制所述产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒的过程中，所述黄曲霉(Aspergillus flavus) GZ-17CGMCC N0.8050与所述产黄曲霉毒素的黄曲霉的孢子个数比为 1:10 至 10:1 (如 1:1-10:1，具体如 1:10 或 1:1 或 10:1)。
[0013]在本发明的一个实施例中，在抑制所述产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒的过程中，所述黄曲霉(Aspergillus flavus)GZ_17CGMCC N0.8050的孢子、所述产黄曲霉毒素的黄曲霉的孢子和所述花生的配比为(5X IO3~5X IO5)个孢子:5X104个孢子:5g花生。另外，在抑制所述产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒的过程中，培养条件为30°C，培养14天。
[0014]在上述应用或菌剂中，所述产黄曲霉毒素的黄曲霉具体可为黄曲霉(Aspergi I Iusflavus) GD-1。
[0015]在上述应用或菌剂中，所述不产黄曲霉毒素具体为至少不产黄曲霉毒素B2, G1和G20
[0016]以上所有的所述产毒中 的“毒”均指“黄曲霉毒素”，进一步为“黄曲霉毒素B1 ”。
[0017]所述黄曲霉(Aspergillus flavus) GZ-17CGMCC N0.8050在制备所述菌剂中的应用也属于本发明的保护范围。
[0018]所述黄曲霉(Aspergillusflavus) GZ-17CGMCC N0.8050 在生产分生孢子或 / 和菌丝体中的应用也属于本发明的保护范围。
[0019]本发明的黄曲霉菌株GZ-17的菌落形态与普通黄曲霉相似，但不合成黄曲霉毒素；其不产毒素的机制是:该菌株的毒素合成基因从基因aflT到合成基因verA出现缺失，verA基因到最后一个毒素合成基因hypA之间的基因是完整的。
[0020]实验证明，本发明的黄曲霉菌株GZ-17对产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株产毒有抑制作用，在该菌株与产毒菌的孢子浓度比为IO5:1O5时，该不产毒菌对产毒菌的抑制产毒率达到近96%。该菌株对于抑制产毒黄曲霉侵染农产品、降低农产品中黄曲霉毒素污染具有重要意义。
[0021]保藏说明
[0022]囷种名称:黄曲霉
[0023]拉丁名:(Aspergillusflavus)
[0024]菌株编号:GZ-17
[0025]保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0026]保藏机构简称:CGMCC
[0027]地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号[0028]保藏日期:2013年8月21日
[0029]保藏中心登记入册编号:CGMCC N0.8050
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1为黄曲霉毒素BpByGpG2混合标准品(LB96951)的UPLC图谱。其中，I为黄曲霉毒素标准品中AFG2，保留时间为1.273min ；2为黄曲霉毒素标准品中AFG1，保留时间为
1.483min ；3为黄曲霉毒素标准品中AFB2，保留时间为1.720min ；4为黄曲霉毒素标准品中AFB1，保留时间为2.057min。
[0031]图2为菌株GZ-17的UPLC图谱。
[0032]图3为黄曲霉菌株GZ-17毒素合成基因缺失示意图。
[0033]图4为黄曲霉菌株GZ-17的平板菌落形态。
[0034]图5为黄曲霉菌株GZ-17对产黄曲霉毒素的黄曲霉菌GD-1的竞争菌落图。其中，A 为 GZ-17:⑶-1 (IO4:1O5) ；B 为 GZ_17:GD_1 (105:1O5) ；C 为 GZ_17:GD_1 (106:1O5)。
[0035]图6为黄曲霉毒素BI标准品的UPLC图谱。其中，I即为黄曲霉毒素B1标准品。
[0036]图7为单独产黄曲霉毒素的黄曲霉菌⑶-1的UPLC图谱。其中，I为目的洗脱峰。
[0037]图8为GZ-17:⑶-1(106:1O5)的UPLC图谱。其中，I为目的洗脱峰。
【具体实施方式】
`[0038]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0039]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0040]产黄曲霉毒素的黄曲霉菌GD-1:记载于 “Chu-Shu Zhang, Fu-Guo Xing, JonathanNimal Selvaraj et al.The effectiveness of ISSR profiling for studying geneticdiversity of Aspergillus flvcus from peanut-cropped soils in China.BiochemicalSystematics and Ecology50 (213): 147-153” 一文。
[0041]黄曲霉毒素G2混合标准品(LB96951):购于SUPELC0公司。
[0042]黄曲霉毒素B1标准品(LB88848):购于SUPELC0公司。
[0043]黄曲霉毒素B1的Elisa酶联免疫法试剂盒(HEM0396/HEM0348):购于北京华安麦科生物技术有限公司。试剂盒自带AFB1酶标物、AFB1抗试剂、底物液A液、底物液B液等相关试剂。
[0044]实施例1、黄曲霉菌株GZ-17的采集、分离、鉴定
[0045]一、从花生种植土壤中分离黄曲霉菌株GZ-17
[0046]从广东花生种植土壤中用DG18培养基分离黄曲霉菌株。具体操作如下:
[0047]1、土壤样品菌悬液的制备
[0048]取IOg 土样，加入90mL0.1%蛋白胨无菌水(w/v)，在室温震荡30min，制成10—1菌悬液；再取0.SmLKT1菌悬液加4.5mL0.1%蛋白胨无菌水，制备出10_2稀释度的菌悬液；按上述方法制备10_3稀释度的菌悬液。
[0049]2、菌株的分离与纯化
[0050]每个稀释度取0.1mL菌液，涂布在DG18培养基(配方:酪蛋白胨5.0g，无水葡萄糖
10.0g,磷酸二氢钾1.0g,硫酸镁0.5g，氯硝胺0.002g,琼脂15.0g,氯霉素0.lg，用蒸馏水1000mL溶解，再加入200.0g的甘油，混匀，121°C灭菌。)上，30°C黑暗培养5d，每个稀释度重复3次。挑取长有黄色孢子的菌株在DG18培养基上进行二次划线分离，直至得到单个菌落。挑取单个菌落于MEA斜面试管培养基(配方:每升培养基中含有麦芽浸粉30.0g，大豆蛋白胨3.0g，琼脂15.0g ；pH5.8)上，于30°C培养3d后保存于4°C中。将其中一株菌记为GZ-17。
[0051]二、菌株GZ-17的鉴定
[0052]1、形态学鉴定
[0053]挑取保存于MEA培养基上的菌株GZ-17于AFPA培养基(配方:蛋白胨10.0g/L，酵母浸粉20.0g/L,柠檬酸铁铵0.5g/L，氯硝铵0.002g/L,氯霉素0.lg/L，琼脂15.0g/L, pH为
6.3)上，30°C培养3-5d，可见AFPA培养基背面为亮橘色。
[0054]2、分子鉴定
[0055]通过真菌钙调基因序列对菌株GZ-17进行分子鉴定(Rodrigues, P., Santos, C.,Venancioj A., Lima, N., 2011.Species identification of Aspergillus section Flaviisolates from Portuguese almonds using phenotypic, including MALD1-T0F ICMS，andmolecular approaches.J Appl Microbiol 111877-892 )D 黄曲霉基因组钙调蛋白 PCR 扩增所用的引物为CLl和CL2A (序列如下)。PCR扩增反应程序为:94°C预变性5min，I个循环；94。。变性30s，54。。退火30s，72。。延伸90s，共30个循环；72°C最后延伸7min0扩增后，产物保存于4°C。产物送至上海生工生物工程有限公司测序。并在BLASTresearches上比对测序结果(http:// www.ncb1.nlm.nih.gov/)。
[0056]CLl:5，-GARTWCAAGGAGGCCTTCTC-3，；
[0057]CL2A: 5，-TTTTTGCATCATGAGTTGGAC-3，。
[0058]菌株GZ-17的PCR扩增产物的测序结果如序列表中序列I所示。将菌株GZ-17的钙调蛋白基因的测序结果提交上NCBI上进行比对，发现，其与黄曲霉菌NRRL3357和NRRL21882的同源性均为99%。
[0059]经过以上形态学鉴定和分子鉴定，可知菌株GZ-17为黄曲霉(Aspergillusflavus)。
[0060]3、利用超高效液相色谱法检测菌株GZ-17是否产黄曲霉毒素[0061 ] (I)待测样品制备
[0062]将菌株GZ-17接种于MEA斜面试管培养基上，28°C培养5天，将5ml无菌生理盐水加入MEA斜面试管培养基，冲洗，得菌悬液。将菌悬液加入50ml的试管中，再加入IOml的培养液(150g蔗糖/L，20g酵母提取物/L，IOg大豆蛋白胨/L，pH5.9)，30°C培养5天。将液体发酵液用滤纸过滤，取Iml滤液加入到免疫亲和柱(VICAM，G1010)中(使黄曲霉毒素挂到柱子上，从而有效去除杂质)，待液体排干后，用蒸馏水或去离子水洗涤2次，每次10mL，流速2~3d/s ;待液体排干后，上样ImL甲醇，用样品瓶接洗脱液，洗脱后液体即为待测样品，用于UPLC检测。
[0063](2)超高效液相色谱法检测待测样品
[0064]取黄曲霉毒素B2, G1, G2混合标准品(LB96951 )，用甲醇配制成溶液，再取步骤(I)制备的待测样品，分别按照如下条件进行超高效液相色谱检测。看待测样品的色谱图在与黄曲霉毒素标准品相同的保留时间处是否有色谱峰出现。[0065]其中，超高效液相色谱的条件如下:色谱柱:C18色谱柱(50mmX2.1mm, 1.7 μ m)；检测器:荧光检测器ACQUITY型，激发波长365nm，发射波长:440nm ;柱温:40°C;流动相:甲醇:水(45:55，体积比)，辅以甲醇(色谱级纯甲醇)用于清洗；进样量:10μ L ;流速:0.2mL/
mirio
[0066]黄曲霉毒素BpB^GpG2混合标准品(LB96951)的UPLC图谱如图1所示，从图1中可以看出，黄曲霉毒素标准品中AFB1的保留时间为2.057min，AFB2的保留时间为1.720min,AFG1的保留时间为1.483min, AFG2的保留时间为1.273min。菌株GZ-17的UPLC图谱如图2所示，从图2中可以看出，在与黄曲霉毒素标准品对应的以上四个保留时间处均没有色谱峰产生。由此可见，菌株GZ-17不产黄曲霉毒素。
[0067]通过以上鉴定结果，确定步骤二所得的菌株GZ-17为不产生黄曲霉毒素的黄曲霉(Aspergillus flavus),并对其进行了保藏,保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏日期为:2013年8年21日，保藏号:CGMCC N0.8050。
[0068]实施例2、黄曲霉(Aspergillus flavus)GZ_17CGMCC N0.8050 中黄曲霉毒素合成
基因缺失鉴定
[0069]本发明的发明人以Genbank登录号为AY510451黄曲霉的毒素合成基因的序列为参照，设计了毒素合成相关基因hypB、hypC、hypD和hypE四对引物，其他基因的引物参考 Perng-Kuang Chang (Chang, P.K., Horn, B.ff.and Dorner, J.ff.(2005)Sequencebreakpoints in the afl atoxin biosynthesis gene cluster and flanking regions innonaflatoxigenic Aspergillus flavus isolates.Fungal Genet Bio42, 914 - 923.X 待测的29个基因及其对应的引物序列如表1所示。
[0070]表1不同黄曲霉毒素合成基因的引物序列
[0071]
【权利要求】
1.不产黄曲霉毒素的黄曲霉(Aspergillusflavus) GZ-17,它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC N0.8050。
2.权利要求1所述的黄曲霉(Aspergillusflavus)GZ_17CGMCC N0.8050在抑制产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒中的应用。
3.一种用于抑制产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒的菌剂，它的活性成分为权利要求1所述的黄曲霉(Aspergillus flavus) GZ-17CGMCC N0.8050。
4.根据权利要求2所述的应用或权利要求3所述的菌剂，其特征在于:所述黄曲霉(Aspergillus flavus) GZ-17CGMCC N0.8050 为分生孢子或 / 和菌丝体。
5.根据权利要求2-4中任一所述的应用或菌剂，其特征在于:所述抑制产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒体现在:使所述产黄曲霉毒素的黄曲霉的产毒量降低。
6.根据权利要求2-5中任一所述的应用，其特征在于:在抑制所述产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒的过程中，所述黄曲霉(Aspergillus flavus)GZ_17CGMCC N0.8050与所述产黄曲霉毒素的黄曲霉的孢子个数比为1:10至10:1。
7.根据权利要求2-6中任一所述的应用或菌剂，其特征在于:所述产黄曲霉毒素的黄曲霉为黄曲霉(Aspergillus flavus)⑶-1。
8.权利要求1所述的黄曲霉(Aspergillusflavus)GZ_17CGMCC N0.8050在制备权利要求3-7中任一所述菌剂中的应用。
9.权利要求1所述黄曲霉(Aspergillusflavus)GZ_17CGMCC N0.8050在生产分生孢子或/和菌丝体中的应用。
【文档编号】C12N1/14GK103509723SQ201310445854
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】刘阳, 魏丹丹, 周露, 张初署, 邢福国, 赵月菊, 王龑 申请人:中国农业科学院农产品加工研究所