检测cyp4v2基因常见突变的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因检测领域，特别涉及用于检测BCD致病基因CYP4V2基因突变的试剂盒，本发明的试剂盒能够快速、经济、准确的判断CYP4V2基因c.802-8_810del17insGC，c.992A>C和c.1091-2A>G三个突变位点的基因型，通过对CYP4V2基因三个高频突变位点的联合检测，能对BCD携带者和患者做到早期确诊、早期预警和早期干预，可将由CYP4V2基因三个高频排他性突变相关BCD的预警时间提前至胎儿期，从而使BCD患儿得到早期治疗，并有利于BCD的优生优育，提高BCD的防治水平；本发明的检测方法为BCD患者和携带者的诊断和治疗提供了依据。
【专利说明】检测CYP4V2基因常见突变的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因检测领域，特别涉及用于检测BCD致病基因CYP4V2基因常见突变的试剂盒及其应用。【背景技术】
[0002]结晶样视网膜色素变性(Bietticrystalline corneoretinal dystrophy,BCD)是一种以眼底散在分布结晶样小闪光点为特征的视网膜退行性改变，同时可有脉络膜血管硬化，进行性夜盲和视野缩小。结晶样视网膜色素变性(crystalline retinaldegeneration)于1937年由Bietti首先报道，又名Bietti结晶样营养障碍(Bietti’scrystalline dystrophy)。BCD的发病年龄一般在20~40岁，双眼病变大致对称,并同步发展，之后进行性视力丧失，部分患者50~60岁时可出现全盲。该病在我国和日本较多见，在欧美国家较少见，男性稍多于女性，男女之比约为4:3。
[0003]B⑶是一种常染色体隐性遗传性疾病，其致病基因为CYP4V2，CYP4V2基因的纯合突变或双杂和突变会导致发病，而只有一个等位基因突变则是BCD的健康携带者，在我国汉族人群中CYP4V2基因致病突变的频率约为7/1000，群体患病率约为1/24000。
[0004]视力对人类的正常生产社会活动非常重要，目前我国盲人多达500多万，给经济社会造成了严重的负担。BCD是一种危害较大的致盲性疾病，发病年龄一般在20~40岁，因此BCD患者有较长的“窗口期”，因此对“窗口期”BCD患者的早期诊断和早期干预有重要意义。BCD是一种常染色体隐性遗传性疾病，一个等位基因突变虽是BCD的健康携带者，但两个携带者的婚配会使其子代B⑶患病风险高达25%，因此，对CYP4V2基因致病突变携带者的筛查也显得非常重要。
[0005]基因诊断作为一种新型的诊断技术，具有敏感性好、特异性高等特点，在疾病尤其是遗传性疾病中的应用越来越广泛。新生儿视力基因筛查技术在世界各国广泛开展，通过此筛查可以早期发现新生儿期视力损害并进行早期干预，以避免新生患儿由于遗传病带来的视力障碍。BCD在欧美国家较少见，而多见于中国和日本，目前尚缺乏产业化、规范化的胎儿或新生儿B⑶基因筛查技术，难以对B⑶患儿做到早期诊断。B⑶的致病基因为CYP4V2，定位于第4号染色体长臂，CYP4V2基因全长19kp，包含12个外显子，编码产物为525个氨基酸的蛋白质，该蛋白属于CYP450家族，在脂肪酸代谢中发挥重要作用。CYP4V2基因突变形式不一，特点各异。BCD致病基因CYP4V2高频突变的检测从原理上可对存在BCD发病风险的患者进行早期预警，结合其他眼科检查可以达到早期检测、治疗的目的。
【发明内容】
[0006]本发明的发明人通过110例B⑶患者样本的研究，发现在中国汉族人群中，CYP4V2基因的众多致病突变中c.802-8_810dell7insGC, c.992A>C和c.1091_2A>G三个突变最为常见，其中，所述的c.802-8_810dell7insGC突变表示第6内含子末尾的8个核苷酸TCATACAG和第7外显子开始的9个核苷酸GTCATCGCT缺失并在缺失的位置插入两个个核苷酸GC，从而导致第7外显子缺失。所述的c.992A>C突变表示CYP4V2基因在第8外显子中的第992位编码碱基由A突变为C，从而导致其第331位编码氨基酸由组氨酸突变为脯氨酸。所述的c.1091-2A>G突变表示CYP4V2基因第8内含子倒数第2个碱基由A突变为G，引起剪切受体AG变为GG，从而导致第9外显子缺失。对BCD患者的突变筛查结合其它地区的统计资料显示，这三个突变的发生频率约为76%，是目前所发现的最常见的BCD突变位点；并且通过研究证明，CYP4V2基因三个高频排他性突变c.802-8_810dell7insGC, c.992A>C和c.1091-2A>G与B⑶密切相关，是中国B⑶人群的重要高频突变，占总数的76%，可以作为早期分子标记来进行BCD的风险评估和基因预警。
[0007]有鉴于此，本发明提供了用于检测B⑶致病基因CYP4V2基因的三个高频突变c.802-8_810dell7insGC, c.992A>C和c.1091_2A>G的试剂盒，其检测结果特异性高，操作简单。
[0008]为实现上述目的，本发明的技术方案为:
[0009]用于检测CYP4V2基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增样本DNA的PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括用于检测c.802-8_810dell7insGC突变位点的特异性扩增引物I，所述特异性扩增引物I的上游引物序列如SEQ ID NO:4所示，所述特异性扩增引物I的下游引物序列如SEQ ID NO:5所示。所述特异性扩增引物I对应检测CYP4V2基因的c.802-8_810dell7insGC突变，所述特异性扩增引物I扩增的目标片段为CYP4V2-7，序列如SEQ ID NO:1 所示，大小为 246bp。
[0010]进一步，所述的试剂盒，所述PCR反应试剂还包括用于检测c.992A>C突变位点的特异性扩增引物II，所述特异性扩增引物II的上游引物序列如SEQ ID NO:6所示，所述特异性扩增引物II的下游引物序列如SEQ ID N0:7所示。所述特异性扩增引物II对应检测CYP4V2基因的c.992A>C突 变，所述特异性扩增引物II扩增的目标片段为CYP4V2-8，序列如SEQ ID NO:2 所示，大小为 220bp。
[0011]进一步，所述的试剂盒，所述PCR反应试剂还包括用于检测c.1091_2A>G突变位点的特异性扩增引物III，所述特异性扩增引物III的上游弓丨物序列如SEQ ID NO:8所示，所述特异性扩增引物III的下游引物序列如SEQ ID N0:9所示。所述特异性扩增引物III对应检测CYP4V2基因的c.1091-2A>G突变，所述特异性扩增引物III扩增的目标片段为CYP4V2-9，序列如SEQ ID NO:3所示，大小为215bp。
[0012]本发明的试剂盒中，特异性扩增引物I只能对应检测突变c.802-8_810dell7insGC ;特异性扩增引物II只能对应检测突变c.992A>C ;特异性扩增引物III只能对应检测突变c.1091-2A>G ;当三对引物对都选择时，才能对应检测CYP4V2基因的三个高频突变c.802-8_810dell7insGC, c.992A>C和c.1091_2A>G。因此，优选的，本发明所述的试剂盒，所述PCR引物包括上述三对特异性扩增引物。
[0013]检测CYP4V2基因的突变可用本领域的任何检测点突变的方法来进行，例如PCR(聚合酶链反应)_测序法、采用标记的CYP4V2基因DNA探针杂交法或用限制性片段长度多态性方法或序列特异性引物的方法等等。用本发明所述的试剂盒进行PCR扩增反应得到的PCR反应产物可以用直接测序的方法来检测是否存在已被确定的突变，也可以采用杂交探针来检测，所用的杂交探针可以是与正常的CYP4V2基因核苷酸序列杂交，或与突变的核苷酸序列杂交，或与它们的互补序列杂交的探针。这些探针可以用放射性同位素、发色物质或荧光物质标记，尤其是可利用等位基因特异探针。在本发明的一个实施方案中，采用PCR扩增结合限制性内切酶酶切的方法(PCR-RFLP )来检测样本。
[0014]因此，进一步，所述试剂盒还包括酶切反应的试剂，所述酶切反应的试剂包括限制性内切酶，所述c.802-8_8 IOde117insGC突变位点对应的限制性内切酶为Cdi I，所述c.992A>C突变位点对应的限制性内切酶为ApaI，所述c.1091_2A>G突变位点对应的限制性内切酶为Cdil。
[0015]结合B⑶患者的临床资料分析发现，CYP4V2基因的三个高频致病突变的外显率为100%，通过对CYP4V2基因三个高频突变位点的联合检测，可以非常准确的预警B⑶患者和携带者，具有现有BCD患者视觉检测都不具备的优势，是非常有效的分子标记物。
[0016]因此，本发明的另一目的在于提供利用本发明所述的试剂盒检测CYP4V2基因高频突变的方法，所述的方法为非诊断和治疗目的的方法，包括如下进行的步骤:
[0017]a取待检测的样本，提取全基因组DNA ；
[0018]b以步骤a中的全基因组DNA为模板，加入所述PCR反应试剂，进行PCR扩增反应，得到PCR扩增反应产物；
[0019]c将步骤b中所得到的PCR扩增反应产物用所述酶切反应的试剂进行酶切反应，得到酶切产物；
[0020]d根据步骤c所得的酶切产物来判断待检测的样本是否存在CYP4V2基因的突变。
[0021]进一步，所述的方法，其特征在于，步骤b中，所述PCR反应试剂中PCR引物的上游引物和下游引物的摩尔比为1:1。
[0022]进一步，所述的方法，步骤b中，PCR反应的条件为:反应在ABI9700热循环仪上进行，95°C预变性5min，然后按照95°C变性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec为一个循环，进行34个循环后，95°C变性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸5min，反应完毕后在4°C保存PCR产物。
[0023]进一步，所述的方法，步骤c中，所述PCR反应产物与所述酶切反应试剂中的限制性内切酶的比例为lug:5U，所述酶切反应的条件为:反应在37°C恒温水浴锅中进行，反应时间为12h。
[0024]进一步，所述的方法，步骤d中，对步骤c所得的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果来判断待检测的样本是否存在CYP4V2基因的突变。对步骤b所得的PCR扩增产物也可以进行测序，根据测序的结果来判断待检测的样本是否存在CYP4V2基因的突变。当采用琼脂糖凝胶电泳的方法时，是将酶切产物与DNA标准分子量在同一琼脂糖凝胶上进行恒压电泳，电泳结束后，将凝胶放入凝胶成像系统中进行图像扫描，根据图像上酶切产物与DNA标准分子量的条带对比进行鉴定。
[0025]本发明的另一目的在于提供所述的试剂盒在用于检测结晶样视网膜色素变性疾病中的应用。
[0026]本发明所述的试剂盒可以检测结晶样视网膜色素变性疾病(BCD)致病基因CYP4V2基因的突变，为BCD基因检测提供基础，可早期发现BCD病例以及BCD致病基因携带者；另外，本发明的试剂盒还可以同时对BCD致病基因CYP4V2基因的三个高频突变c.802-8_810dell7insGC，c.992A>C和c.1091_2A>G进行联合检测， 三个高频突变的联合检测可以早期发现并预警76%以上的BCD病例和携带者。[0027]B⑶致病基因CYP4V2，单纯带有一个突变的个体为B⑶的携带者，而带有纯合性突变或双杂合突变的个体则是BCD患者。
[0028]使用本发明的试剂盒的检测方法为通过检测来自于个体的待测样本中是否存在CYP4V2基因 c.802-8_810dell7insGC，c.992A>C和 c.1091_2A>G突变，能够快速、经济、准确的判断个体在这三个突变位点的基因型，从而对个体进行BCD的风险评估和基因预警。通过对CYP4V2基因三个高频突变位点的联合检测，能对BCD携带者和患者做到早期确诊、早期预警和早期干预，具有现有BCD患者视觉检测都不具备的优势，是非常有效的分子标记物。其中，所述的c.802-8_810dell7insGC突变表示第6内含子末尾的8个核苷酸TCATACAG和第7外显子开始的9个核苷酸GTCATCGCT缺失并在缺失的位置插入两个个核苷酸GC，从而导致第7外显子缺失。所述的c.992A>C突变表示CYP4V2基因在第8外显子中的第992位编码碱基由A突变为C，从而导致其第331位编码氨基酸由组氨酸突变为脯氨酸。所述的c.1091-2A>G突变表示CYP4V2基因第8内含子倒数第2个碱基由A突变为G，引起剪切受体AG变为GG，从而导致第9外显子缺失。CYP4V2基因的c.802_8_810dell7insGC，c.992A>C和c.1091-2A>G突变位点的示意图分别见图1、图2和图3。
[0029]CYP4V2基因突变相关的结晶样视网膜色素变性(Bietti crystallinecorneoretinal dystrophy,B⑶)疾病是常染色体隐形遗传疾病。发明人通过眼科门诊，共收集了 110例临床确诊的中国汉族BCD患者。临床确诊病例定义为:I)进行性夜盲和视野缩小，2)存在眼底散在分布结晶样小闪光点为特征的视网膜退行性改变。CYP4V2基因突变检测通过PCR扩增及双向sanger测序进行，突变筛查引物和反应条件见表1。结果表明，CYP4V2 基因三个排他性突变 c.802-8_810dell7insGC，c.992A>C 和 c.1091_2A>G 在确诊病例组以及病例亲属组中的总发生率均约为70%，与BCD密切相关，是中国BCD人群的重要高频突变，结合其它地区的统计资料显示，这三个突变发生频率合计约为76%，可以作为早期分子标记来进行BCD的风险评估和基因预警。
[0030]表1PCR引物序列和退火温度
【权利要求】
1.用于检测CYP4V2基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增样本DNA的PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括用于检测c.802_8_8IOdel 17insGC突变位点的特异性扩增引物I，所述特异性扩增引物I的上游引物序列如SEQ ID NO:4所示，所述特异性扩增引物I的下游引物序列如SEQ ID NO:5所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂还包括用于检测c.992A>C突变位点的特异性扩增引物II，所述特异性扩增引物II的上游引物序列如SEQ IDNO:6所示，所述特异性扩增引物II的下游引物序列如SEQ ID NO:7所示。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂还包括用于检测c.1091-2A>G突变位点的特异性扩增引物III，所述特异性扩增引物III的上游引物序列如SEQID NO:8所示，所述特异性扩增引物III的下游引物序列如SEQ ID NO:9所示。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶切反应的试剂，所述酶切反应的试剂包括限制性内切酶，所述c.802-8_810dell7insGC突变对应的限制性内切酶为Cdil，所述c.992A>C突变对应的限制性内切酶为ApalJy^iic.1091_2A>G突变对应的限制性内切酶为Cdil。
5.权利要求4所述的试剂盒用于检测CYP4V2基因突变的方法，所述的方法为非诊断和治疗目的的方法，其特征在于，包括如下进行的步骤: a取待检测的样本， 提取全基因组DNA ； b以步骤a中的全基因组DNA为模板，加入所述PCR反应试剂，进行PCR扩增反应，得到PCR扩增反应产物； c将步骤b中所得到的PCR扩增反应产物用所述酶切反应的试剂进行酶切反应，得到酶切产物； d根据步骤c所得的酶切产物来判断待检测的样本是否存在CYP4V2基因的突变。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤b中，所述PCR反应试剂中PCR引物的上游引物和下游引物的摩尔比为1:1。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤b中，PCR反应的条件为:反应在ABI9700热循环仪上进行，95°C预变性5min，然后按照95°C变性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec为一个循环，进行34个循环后，95°C变性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸5min,反应完毕后在4°C保存PCR产物。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤c中，所述PCR反应产物与所述酶切反应试剂中的限制性内切酶的比例为lug:5U，所述酶切反应的条件为:反应在37°C恒温水浴锅中进行，反应时间为12h。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤d中，对步骤c所得的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果来判断待检测的样本是否存在CYP4V2基因的突变。
10.权利要求1或2所述的试剂盒在用于检测结晶样视网膜色素变性疾病中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103468820SQ201310450222
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】郭洪, 孟晓红, 白云 申请人:中国人民解放军第三军医大学