一种球形酶制品及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种球形酶制品及其制备方法，以解决现有在油包水乳液中制备交联酶聚集体的方法制得的酶颗粒较大、孔隙率较小的问题。该球形酶制品是由下述原料复合而成：0.4份的酶液、0.1—0.25份的酶活性位点保护剂、0.1～0.35份的表面活性剂、10份的矿物油和0.1～0.2份的交联剂。制备方法包括粗酶的纯化、乳化液体系、制备交联剂、球形酶的形成步骤；本发明球形酶制备方法具有如下优点：1）操作简单、快速，制备成本低；2）颗粒尺寸易于控制；3）酶活性和稳定性有较大幅度提高；4）适宜于多种单一酶或多种酶的固定化，具有一定的通用性；5）有较高的机械性能。
【专利说明】一种球形酶制品及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种球形酶制品及基于乳化液的球形酶制备方法。
【背景技术】
[0002]酶作为催化剂被广泛应用于工业生产中，从环境应用如污水治理和生物修复、食品和饮料生产等到化学品生产，如此广阔的应用归功于酶的高选择性催化性能，而且在催化过程中酶潜在地降低了介质中的毒性成分或有害副产物，降低了污水污染和能源消耗。然而，催化剂在实际生产中的应用存在许多缺点，除了高成本外还显示出游离酶对温度、PH值、有机溶剂、氧化作用和剪切力的不稳定性，而且游离酶不能被回收利用，导致酶的应用受到限制。
[0003]通过酶的固定化可以克服上述问题，但传统有载体固定化方法制备成本相对较高、酶活性损失较大以及载体的存在降低了其对酶的承载量，通过以酶的无载体固定化代替有载体固定化可以大大降低制备成本和增加单位量的酶活性。
[0004]目前有许多无载体固定化催化剂研究成果和专利方法，如交联溶解酶、交联酶晶体、交联酶聚集体和交联喷雾干燥酶，尤以交联酶晶体和交联酶聚集体的研究最为广泛。董晓毅利用CLEAs技术对脲酶聚集体进行了固定化，将游离脲酶用硫酸铵沉淀后，以戊二醛作为交联剂对其进行化学交联，得到交联脲酶聚集体；潘力采用气相平衡法对脂肪酶进行结晶化后再以2-甲基-2，4戊二醇为沉淀剂、戊二醛为交联剂制备出交联脂肪酶晶体颗粒应用于不对称有机合成反应中，取得较好效果。
[0005]但上述所述几种固定化方法均存在较多缺陷，如CLEC技术要求易于结晶化的高纯度酶，因而制备成本高和应用范围有限；而CLEA技术依赖于酶的初始沉淀，然后再交联，该方法虽然制备成本较低、工艺简单、要求酶纯化到一定程度即可，然而CLEA和CELC技术都存在由于酶颗粒尺寸的增加而引起的扩散限制，造成催化效率不高；另外，现有在油包水乳液中制备交联酶聚集体的方法，制得的酶颗粒较大、孔隙率较小而造成小分子底物向颗粒内部渗透受阻，催化效率不高。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种球形酶制品，以解决现有在油包水乳液中制备交联酶聚集体的方法制得的酶颗粒较大、孔隙率较小的问题。
[0007]本发明的另一个目的在于提供一种基于乳化液体系的球形酶制品的制备方法。
[0008]一种球形酶制品，是由下述原料复合而成:
按照以下体积份配比复合，0.4份的酶液、
0.1—0.25份的酶活性位点保护剂、
0.1~0.35份的表面活性剂、
10份的矿物油和
0.1~0.2份的交联剂；其中酶液为50~100重量份的纯化酶溶解于I体积份的缓冲液中而成。
[0009]酶选自脂肪酶或蛋白酶、糖化酶、漆酶等其他酶种。缓冲液选5mmol/L乙醇胺，本发明所提到的缓冲液是根据酶种类来选择的，并根据酶特性调节为所需PH值；缓冲液为市场购买。
[0010]进一步的，所述表面活性剂为Span-20。所述交联剂为戊二醛-聚乙烯亚胺共聚物或戊二醛-乙二胺溶液，所述戊二醛-聚乙烯亚胺共聚物为由25%戊二醛溶液与3~5%的聚乙烯亚胺溶液按照体积比1:1混合而成，所述戊二醛-乙二胺溶液由25%戊二醛与
0.33!1101/1的乙二胺溶液按照1:1一1: 3的体积比混合而成。其中乙二胺和聚乙烯亚胺的作用是增加酶分子与戊二醛的链接长度，可以控制球形酶的颗粒尺寸。
[0011]进一步的，所述酶活性位点保护剂为三丁酸甘油酯.可根据不同酶选择不同的酶活性位点保护剂。本发明所提到的酶活性位点保护剂一般为酶的底物或底物的结构类似物。
[0012]进一步的,所述的表面活性剂选自Span-20,添加量优选0.25ml。表面活性剂也可以是其他Span系列及壬基酚聚氧乙烯醚代替。本发明所提到的Span-20为非离子型表面活性剂，其作用是增加酶分子的表面疏水性，以利于酶分子朝着油水相界面处迁移。
[0013]一种球形酶制 备方法，包括以下步骤:
本发明球形酶制品，是在油包水乳化液体系中形成的。
[0014]A、粗酶的纯化:采用超滤浓缩-透析法或离子交换柱法，对粗制酶进行纯化，然后经真空冷冻干燥后作为待固定的纯化酶；
B、乳化液体系:该乳化液体系是由油相和水相组分，其中:
水相组分是体积份为0.4份的酶液和0.1-0.25份的酶活性位点保护剂，其中酶液为50~100重量份的纯化酶溶解于I体积份的缓冲液中而成；
油相组分为0.1~0.35份的表面活性剂和10份的矿物油，可以磁力搅拌5~lOmin。
[0015]C、制备交联剂:交联剂戊二醛-聚乙烯亚胺共聚物是由25%戊二醛溶液与3~5%的聚乙烯亚胺溶液按照体积比1:1混合反应2~5min形成；交联剂戊二醛-乙二胺是由25%戊二醛与0.33mol/L的乙二胺溶液按照1:1一 1: 3的体积比反应5min~15min形成；
D、球形酶的形成:将上述油相组分与水相组分混合，搅拌，然后添加0.1~0.2体积份的交联剂进行乳化交联，分离得到球形酶，用缓冲液冲洗后得到该酶的球形酶颗粒。
[0016]为了更好的实现本发明，所述步骤D球形酶的形成过程中，为了防止交联过程中乳化液被破坏，添加交联剂后乳化液体系在700rpm转速条件下每隔30min搅拌5min,共进行2h—4h,随后乳化液体系4000rpm转速下离心15min,分离得到球形酶；或者在700rpm转速条件下持续搅拌2~4h ;优选在700rpm转速条件下持续搅拌2~4h。
[0017]为了更好的实现本发明，所述步骤D球形酶的形成过程中，分离得到的球形酶，用含有5mmol/L乙醇胺的缓冲液冲洗数次。作用是清除球形酶颗粒表面和内部过剩的戊二醛。
[0018]为了更好的实现本发明，所述步骤D球形酶的形成过程中，分离得到的球形酶，用乙醇胺的缓冲液冲洗数次，再用20mmol/L、pH8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗以清除未反应的
乙醇胺。[0019]本发明球形酶的制备方法适用于大多数生物酶，经过部分纯化后的酶可以用冷冻干燥的方法制成干粉状，以防酶在溶液状态下失活。
[0020]本发明的原理:在添加有表面活性剂的油包水乳化液体系中，蛋白质或酶分子在搅拌条件下由于受到疏水基的促使而集中于液滴球形面上，经交联剂交联形成一种具有网状结构的无载体固定化酶球形颗粒。
[0021]本发明提供的球形酶制备方法较其它无载体固定化酶相比，具有如下优点:1)操作简单、快速，制备成本低；2)颗粒尺寸易于控制；3)酶活性和稳定性有较大幅度提高；4)适宜于多种单一酶或多种酶的固定化，具有一定的通用性；5)有较高的机械性能。
[0022]本发明所形成的球形酶制品为稳定性较好、高酶活的具有空间网状结构的球形酶制品，可以应用于工业生产、环境保护、生物传感、检测、有机合成及医药生产等诸多领域。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1是本发明的工艺流程图。
【具体实施方式】
[0024]下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0025]本发明球形酶制品是在油包水乳化液体系中形成的，本发明实施例以脂肪酶作为实验用酶。
[0026]实施例1
A、粗酶的纯化:采用超滤浓缩-透析法或离子交换柱法对粗脂肪酶进行部分纯化，然后经真空冷冻干燥后作为待固定的纯化脂肪酶；
B、乳化液体系:该乳化液体系是由油相和水相组分，其中:
水相组分:取酶液0.4ml，然后向其中加入0.1ml脂肪酶酶活性位点保护剂三丁酸甘油酯；酶液由IOOmg纯化脂肪酶溶解于Iml浓度为20mmol/L、pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液中制成；
油相组分:0.25ml的Span-20加入到IOml矿物油中，磁力搅拌lOmin。
[0027]C、制备交联剂:25%戊二醛溶液与3%的聚乙烯亚胺溶液按照体积比1:1混合反应2min，形成戊二醛-聚乙烯亚胺共聚物；
D、球形酶的形成:将上述油相组分与水相组分混合，于磁力搅拌器上在1500rpm转速条件下搅拌lmin，然后添加0.15 ml戊二醛-聚乙烯亚胺溶液进行乳化交联，为了防止交联过程中乳化液被破坏，乳化液体系在700rpm转速条件下每隔30min搅拌5min,持续2h,随后乳化液体系4000rpm转速下离心15min,分离得到球形酶,然后用含有5mmol/L乙醇胺的缓冲液冲洗数次后，再用浓度为20mmol/L的Tris-HCl缓冲液冲洗以清除未反应的乙醇胺，即可得到脂肪酶球形酶颗粒。
[0028]本实施例以脂肪酶作为实验酶，用相应国标方法或国际通用的酶活测定方法检测球形酶酶活。结果是本实施例1所得脂肪酶球形酶酶活残留率最高，为86.3%。
[0029]实施例2
重复实施例1的步骤，有以下不同点:制备交联剂的反应时间不同，25%戊二醛溶液与3%的聚乙烯亚胺溶液的混合反应时间为5min。然后测定该脂肪酶球形酶的表观酶活，所得脂肪酶球形酶酶活残留率为85.8%。
[0030]实施例3
重复实施例1的步骤，有以下不同点:制备交联剂的原料浓度不同，聚乙烯亚胺溶液的浓度为5%，然后测定该脂肪酶球形酶的表观酶活，所得脂肪酶球形酶酶活残留率为73.4%。
[0031]实施例4
与实施例3有以下不同点:制备交联剂的反应时间不同为5min，然后测定该脂肪酶球形酶的表观酶活，所得脂肪酶球形酶酶活残留率为72.6%。
[0032]实施例5
重复实施例1的步骤，交联剂的用量仍为0.15ml，有以下不同点:交联剂的选择不同，交联剂为25%戊二醛与0.33mol/L的乙二胺溶液按照1:1的体积比反应lOmin，然后测定该脂肪酶球形酶的表观酶活，酶活残留率为78.6%。
[0033]实施例6
与实施例5有以下不同点:25%戊二醛与0.33mol/L的乙二胺溶液的体积比不同为1: 2的体积比，反应时间不同为5min，测定该脂肪酶球形酶的表观酶活，酶活残留率达到68.6%。
[0034]实施例7
与实施例5有以下不同点:25%戊二醛与0.33mol/L的乙二胺溶液的体积比不同为1:
3的体积比，测定该脂肪酶球形酶的表观酶活，酶活残留率达到60.4%。
[0035]对比例I
重复实施例1的步骤，有以下不同点:交联剂的选择不同，以25%戊二醛溶液为交联剂，测定该脂肪酶球形酶的表观酶活。结果显示:所得脂肪酶球形酶的酶活残留率为43.4%。
[0036]说明本发明实施例的效果明显比对比例的酶活残留率高。
[0037] 对于交联剂不同添加量的选择见以下实施例8-11。
[0038]实施例8
重复实施例1的步骤，有以下不同点:添加0.1 ml的戊二醛-聚乙烯亚胺共聚物进行乳化交联。测定该脂肪酶球形酶的表观酶活，酶活残留率为79.3%。
[0039]实施例9
重复实施例1的步骤，有以下不同点:添加0.2ml的戊二醛-聚乙烯亚胺共聚物进行乳化交联。测定该脂肪酶球形酶的表观酶活，酶活残留率为73.5%。
[0040]实施例10
与实施例5有以下不同点:添加0.1 ml戊二醛-乙二胺聚合物进行乳化交联。然后测定该脂肪酶球形酶的表观酶活。结果如表2所示，当Glu-EDA的添加量为0.1 ml时,酶活残留率为59%。
[0041]实施例11
与实施例5有以下不同点:添加0.2 ml戊二醛-乙二胺聚合物进行乳化交联，测定该脂肪酶球形酶的表观酶活，酶活残留率为62%。
[0042]实施例1、8_11结果表明:实施例中在脂肪酶球形酶制备中以戊二醛-聚乙烯亚胺共聚物为交联剂，交联剂添加量为0.15 ml时，所得球形酶酶活残留率最高。
[0043]搅拌方式的选择见以下实施例12 — 14:
实施例12
重复实施例1的步骤，有以下不同点:乳化液体系的搅拌时间为持续搅拌4h，用带有测微尺的光学显微镜检测球形酶颗粒尺寸。结果显示:该球形酶颗粒大小平均值为270微米，并有少许球形酶颗粒聚集成较大颗粒。
[0044]实施例13
重复实施例1的步骤，有以下不同点:加入交联剂后置于磁力搅拌器上，不是每隔30min搅拌5min，持续4h，而是在4°C温度条件下连续搅拌2h。然后用带有测微尺的光学显微镜测定球形酶颗粒的大小。结果显示:该球形酶颗粒大小平均值为120微米，且无球形酶颗粒聚集现象。
[0045]实施例14
重复实施例1的步骤，有以下不同点:油相与水相混合，加入交联剂后置于磁力搅拌器上，700rpm搅拌lOmin，在4°C条件下静置10h。然后用带有测微尺的光学显微镜测定球形酶颗粒的大小。结果显示:该球形酶颗粒大小平均值为660微米，并有大量的球形酶颗粒聚集成较大颗粒。
[0046]实施例12-14的结果表明:实施例13的效果最好。
[0047]酶液浓度的选择 见 实施例15及对比例2:
实施例15
重复实施例1的步骤，有以下不同点:制备酶液的纯化酶的用量不同，为50mg，然后测定球形酶酶活和蛋白质含量，并计算球形酶酶活回收率。球形酶酶活回收率是52%。
[0048]对比例2
重复实施例1的步骤，有以下不同点:制备酶液的纯化酶的用量不同，为150mg。测定球形酶酶活和蛋白质含量，并计算球形酶酶活回收率。显示当用Iml缓冲液中溶解150 mg纯化酶时，在油相中无法充分分散，影响球形酶的形成。
[0049]实施例1和实施例15及对比例2结果表明:实施例1中纯化酶的用量为IOOmg时，所得球形酶酶活残留率最高 。
[0050]通过本发明实施例与对比例的比较，说明本发明所制的球形酶都具有较高的酶活回收率。
【权利要求】
1.一种球形酶制品，其特征在于它是由下述原料复合而成: 按照以下体积份配比复合，0.4份的酶液、 0.1—0.25份的酶活性位点保护剂、 0.1~0.35份的表面活性剂、 10份的矿物油和 0.1~0.2份的交联剂； 其中酶液为50~100重量份的纯化酶溶解于I体积份的缓冲液中而成。
2.根据权利要求1所述的一种球形酶制品，其特征在于:所述表面活性剂为Span-20。
3.根据权利要求1或2所述的一种球形酶制品，其特征在于:所述交联剂为戊二醛-聚乙烯亚胺共聚物或戊二醛-乙二胺溶液，所述戊二醛-聚乙烯亚胺共聚物为由25%戊二醛溶液与3~5%的聚乙烯亚胺溶液按照体积比1:1混合而成，所述戊二醛-乙二胺溶液由25%戊二醛与0.33mol/L的乙二胺溶液按照1:1一 I: 3的体积比混合而成。
4.根据权利要求3所述的一种球形酶制品，其特征在于:所述酶活性位点保护剂为三丁酸甘油酯。
5.根据权利要求4所述的一种球形酶制品，其特征在于:所述的表面活性剂选自Span-20，添加量优选0.25体积份。
6.一种球形酶制备方法`，其特征在于包括以下步骤: A、粗酶的纯化:对粗制酶进行纯化，然后经真空冷冻干燥后作为待固定的纯化酶； B、乳化液体系:该乳化液体系是由油相和水相组分，其中水相组分是体积份为0.4份的酶液和0.1—0.25份的酶活性位点保护剂，其中酶液为50~100重量份的纯化酶溶解于I体积份的缓冲液中而成； 油相组分为0.1~0.35份的表面活性剂和10份的矿物油； C、制备交联剂:交联剂戊二醛-聚乙烯亚胺共聚物是由25%戊二醛溶液与3~5%的聚乙烯亚胺溶液按照体积比1:1混合反应2~5min形成；交联剂戊二醛-乙二胺是由25%戍二醒与0.33mol/L的乙二胺溶液按照1:1一 1: 3的体积比反应5min~15min形成； D、球形酶的形成:将上述油相组分与水相组分混合，搅拌，然后添加0.1~0.2体积份的交联剂进行乳化交联，分离得到球形酶，用缓冲液冲洗后得到该酶的球形酶颗粒。
7.根据权利要求6所述的一种球形酶制备方法，其特征在于:所述步骤D球形酶的形成过程中，添加交联剂后乳化液体系在700rpm转速条件下每隔30min搅拌5min,共进行2h—4h,随后乳化液体系4000rpm转速下离心15min,分离得到球形酶。
8.根据权利要求6所述的一种球形酶制备方法，其特征在于:所述步骤D球形酶的形成过程中，添加交联剂后乳化液体系在在700rpm转速条件下持续搅拌2~4h。
9.根据权利要求6所述的球形酶制备方法，其特征在于:所述步骤D球形酶的形成过程中，分离得到的球形酶，用含有5mmol/L乙醇胺的缓冲液冲洗数次。
10.根据权利要求6所述的球形酶制备方法，其特征在于:所述步骤D球形酶的形成过程中，分离得到的球形酶，用乙醇胺的缓冲液冲洗数次，再用20mmol/L、pH8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗以清除未反应的乙醇胺。
【文档编号】C12N11/08GK103484445SQ201310453870
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】魏甲乾, 张文齐, 陈娟 申请人:甘肃省科学院生物研究所