人乳头瘤病毒基因,及载体,菌株,表达方法

人乳头瘤病毒基因,及载体,菌株,表达方法
【专利摘要】本发明涉及经毕赤酵母表达密码子优化的52，31和45型人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1的基因，含有这些基因的载体、菌株，其制备方法，以及表达方法。
【专利说明】人乳头瘤病毒基因，及载体，菌株，表达方法

【技术领域】
[0001] 本领域涉及分子生物学领域，具体而言，本发明涉及经密码子优化而适于在毕赤 酵母中表达的HPV52, HPV31，HPV45型人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1的基因，W及含有该基 因的载体、菌株及表达该基因的方法。

【背景技术】
[0002] 宫颈癌是仅次于乳腺癌的第二大妇科恶性肿瘤，全球每年有超过50万的妇女被 诊断出患有宫颈癌，27万妇女死于此病，年龄标准化感染率达10.5%。早在80年代初， Harald zur Hausen就发现人乳头瘤病毒化uman papilloma virus，HPV)的感染与宫颈癌 发病有关，后续的大量研究也已证明HPV与宫颈癌及其癌前病变有密切联系。到目前为止， 已发现了百余种HPV基因型，其中约40种可W感染生殖道粘膜。其中高危型HPV型别为 册￥16、18、31、33、45、52和58,90%^上的宫颈癌与它们有关。
[0003] 根据2010年W册的报告，HPV52是世界范围内宫颈癌中检测率占第7位的高危型 另ij，主要与亚洲地区的宫颈癌相关，而在宫颈高度病变中检出率排在第3位。与HPV16和 HPV18型不同的是HPV52的分布有一定的地理偏向性。亚洲HPV感染型别中，HPV52型检出 率较高，我国进行的多项研究表明HPV52型也属比较常见的型别。
[0004] 根据2010年W册的报告，HPV31是世界范围内宫颈癌中检测率占第6位的高危型 另IJ，而在宫颈高度病变中检出率排在第2位。HPV31被认为是宫颈鱗状细胞癌中最普遍的4 种高危型之一，在无症状的病人中广泛存在。具体来说HPV31型主要与宫颈上皮内异型增 生病变和宫颈癌的形成相关。
[0005] HPV45在中国妇女中HPV感染亚型的发生率为2. 3%，属于在中国发生率较高的 HPV亚型（Qiina Human Papillomavirus and Related Cancers'Fact 化eet2010，WH0/IC0 Information Centre on HPV and Cervical Cancer, Sepl5,2010)。
[0006] HPV是无包膜二十面体对称病毒，其病毒基因组DM为闭合环状，长度约 7200-8000bp,由早期编码区（early region)、晚期编码区（late region)和位于两者之间 的长调控区（long control region)组成。其中晚期编码区含两个开放阅读框（0RF)，编码 病毒衣壳蛋白L1和L2。L1蛋白分子量约55kDa，为主要衣壳蛋白，W 72个五聚体的形式支 撑整个病毒衣壳结构，在不同型别中氨基酸序列高度保守，能够刺激机体产生保护性抗体。 L2蛋白分子量较小，多位于L1蛋白内部。
[0007] 昆虫表达系统、酵母表达系统、原核表达系统和哺乳动物细胞等多种表达系统都 可W通过单独表达主要衣壳蛋白L1或联合表达L1+L2的方式获得病毒样颗粒（VLP)。L1 单独表达得到的VLP与天然病毒衣壳结构类似，可用于诱导与保护免受病毒侵袭有关的高 效价病毒中和抗体应答。
[000引因此，鉴于L1蛋白于不同基因型别内部高度保守，并且能够单独表达形成VLP，W L1蛋白作为HPV疫苗研发的目标蛋白具有较高的可行性。不过，W表达重组病毒蛋白得到 的VLP作为HPV疫苗的商业化开发与生产需要解决许多技术问题，其中首先需要解决的技 术问题就是如何提高重组病毒蛋白的表达水平。而LI蛋白在大肠杆菌、毕赤酵母、杆状病 毒等表达系统中，往往受到该些生物体内氨基酸密码子使用频率的限制导致表达水平较低 甚至无表达。如Merck公司的美国专利No. 7, 498, 036中记载，野生型VLP蛋白在酿酒酵母 中的表达量为35 y g/mg (破菌上清液中的VLP/破菌上清液总蛋白）左右。
[0009] 因此，本领域中需要一种高水平表达HPV5化1，HPV31L1，和HPV45L1基因的方法， 所述方法应该能够高水平地、操作简便和低成本地表达HPV5化1，HPV31L1，和HPV45L1基 因。


【发明内容】

[0010] 为了解决上述技术问题，根据本发明的第一方面，提供了一种能够在毕赤酵母中 表达的HPV52，HPV31，HPV45基因，所述基因具有SEQ ID N0;2，SEQ ID N0;4,和SEQ ID NO: 6所示的核巧酸序列。
[0011] 利用毕赤酵母作为表达重组蛋白的表达系统，具有表达量高、操作简便、成本低等 特点，并且相较于更高等的昆虫细胞与哺乳动物细胞而言更利于大规模工业化生产。由于 不同物种间氨基酸密码子使用频率不一，在利用毕赤酵母表达重组蛋白的时候，往往根据 目的蛋白的氨基酸序列经过密码子优化调整后得到更利于翻译的DNA序列。因此，本发明 的经过密码子优化后的HPV52, HPV31，HPV45基因在毕赤酵母中可W获得较高的表达水平， 更有利于针对HPV52, HPV31，HPV45的预防性疫苗的研发与生产。如本申请实施例所示，本 发明的密码子优化过的HPV52, HPV31，HPV45基因在毕赤酵母中的表达量分别可最高达约 140 y g/mg，110 y g/mg，150 y g/mg(破菌上清液中的VLP/破菌上清液总蛋白）。
[0012] 根据本发明的第二方面，提供了一种在毕赤酵母中表达HPV L1基因的方法，包括 下述步骤：
[0013] (1)将本发明的HPV52, HPV31，HPV45L1基因分别各自克隆入表达载体中；
[0014] (2)将步骤（1)所得的表达载体转化至毕赤酵母菌株中；
[0015] (3)使用抗生素对步骤（2)所得的转化菌株进行筛选，获得生长情况最好的一个 或多个菌株；
[0016] (4)通过测试HPV52，HPV31，HPV45L1基因的表达量对步骤（3)所得的菌株进行进 一步筛选，获得表达量最高的一个或多个菌株；
[0017] (5)使用步骤（4)所得的菌株进行表达，分别获得HPV52, HPV31，HPV45L1蛋白。
[0018] 根据本发明的一个具体实施方案，所述步骤（1)中所述的表达载体为pPICZaB载 体，并且所述步骤（3)中使用的抗生素为Zeocin。。
[0019] 根据本发明的一个具体实施方案，所述步骤（2)中使用的毕赤酵母菌株为毕赤酵 母X-33菌株。
[0020] 根据本发明的一个具体实施方案，所述步骤（4)中测试HPV52, HPV31，HPV45L1基 因的表达量的操作是通过Western blot方法进行的。
[0021] 根据本发明的一个具体实施方案，所述步骤巧）中的表达步骤为在发酵罐中进行 的发酵步骤。
[0022] 根据本发明的第H方面，提供了含有本发明的HPV52, HPV31，HPV45L1基因的表达 载体。
[0023] 根据本发明的一个具体实施方案，所述含有本发明的HPV52, HPV31，HPV45L1基因 的表达载体来源于pPICZ a B载体。
[0024] 根据本发明的第四方面，提供了含有本发明的HPV52, HPV31，HPV45L1基因或表达 载体的毕赤酵母菌株，所述菌株能够高水平地表达生产HPV52, HPV31，HPV45L1蛋白，更利 于针对HPV52, HPV31，和HPV45的预防性疫苗的研发与生产。

【专利附图】

【附图说明】
[00巧]图1显示了册￥5211基因双酶切后琼脂糖电泳图。册￥520.7%琼脂糖凝胶电泳鉴 定双酶切结果1 ;表达质粒化indlll+Kpnl) ;2 ;DNA Marker。
[0026] 图2显示了破菌后的HPV52L1上清液Western-blot鉴定。Western-blot鉴定 5化 1'诱导表达情况，1-8 ;重组表达菌株；9 ;PageRuler Prestained Protein Ladder ; 10 : 空宿主菌。
[0027] 图3显示了 HPV52L1蛋白样品SDS-PAGE电泳图。HPV52L1纯化后病毒样颗粒 SDS-PAGE电泳检定，IMarker ;2HPV52L1最终纯化后病毒样颗粒。
[0028] 图4显示了 HPV52L1蛋白样品中呈现病毒样颗粒电镜照片。HPV52L1纯化后病毒 样颗粒电镜照片。
[0029] 图 5 显示了 HPV31L1-PPIC ZaB 双酶切鉴定结果。1 ;DNA Marker ;2,3,6,8 : 31L1-PPIC ZaB单克隆质粒；4,5,7,9 ;31Ll-pPIC ZaB单克隆质粒双酶切（KpnI/BstBI)。
[0030] 图6显示了 HPV31L1诱导表达情况Western-blot鉴定。1-8 ;重组表达菌株；9 : 阳性蛋白原液；10 ;F*ageRuler Prestained Protein Ladder。
[0031] 图7显示了 HPV31L1纯化后病毒样颗粒SDS-PAGE电泳检定。IMarker ;2纯化后 HPV3IL1
[0032] 图8显示了 HPV31L1纯化后病毒样颗粒电镜照片
[0033] 图9显示了 HPV4化10. 8 %琼脂糖凝胶电泳鉴定双酶切结果。1 ;表达质粒 化indlll+Kpnl 双酶切）；2 ;DNA Marker
[0034] 图10显示了 HPV4化IWestern-blot鉴定45L1'诱导表达情况。1 ;空宿主菌；2-8， 10 ;重组表达菌株；9 ;PageRuler Prestained Protein Ladder
[00巧]图11显示了 HPV4化1纯化后SDS-PAGE电泳检定。1HPV4化1蛋白；2Marker
[0036] 图12显示了 HPV45L1纯化后病毒样颗粒电镜照片
[0037] 序列说明
[0038] SEQ ID NO ;1为野生型HPV52L1氨基酸序列。
[0039] SEQ ID NO ;2为本发明的HPV52L1基因的核巧酸序列。
[0040] SEQ ID NO ;3为野生型HPV31L1氨基酸序列。
[0041] SEQ ID NO ;4为本发明的HPV31L1基因的核巧酸序列。
[0042] SEQ ID NO ;5为野生型HPV45L1氨基酸序列。
[0043] SEQ ID NO ;6为本发明的HPV45L1基因的核巧酸序列。
[0044] SEQ ID N0;7HPV5化1基因的核巧酸序列正向引物。
[0045] SEQ ID NO ;8HPV52L1基因的核巧酸序列反向引物。
[0046] SEQ ID NO ;9HPV45L1基因的核巧酸序列正向引物。
[0047] SEQ ID N0;10HPV4化1基因的核巧酸序列反向引物。

【具体实施方式】
[0048] 通过W下实施例详细描述本发明，W便本领域普通技术人员能够更好地理解本发 明。下述实施例仅仅出于示例性目的，并非意在限制本发明的范围。已经努力确保有关数 字（如数量、温度等）的准确性，但应该考虑到会存在一些误差和偏差。除非另有说明，温 度W C为单位或者为环境温度，压力接近或等于大气压。除非另有说明，在下述各实施例中 用到的限制性内切酶均购自New化gland Biol油公司。应当理解的是，除非另有说明，下 述各实施例中所用到的仪器设备均为本领域的常规设备。除非另有说明，所使用的培养基 均为市售可得的常规培养基，本领域技术人员均熟知其中的成分及含量。为了简便起见，在 本文中有可能使用各种通用的缩写，本领域技术人员完全能够理解其含义。
[004引 实施例
[0050] 实施例1 ;HPV52L1密码子优化设计
[0051] 根据野生型 HPV52L1 氨基酸序列（GenBank ;CAA52590. 1，SEQ ID NO ;1)和毕赤酵 母偏爱性密码子，合成52L1序列。将野生型HPV5化IDNA序列进行改造，所有密码子均采用 毕赤酵母中使用频率较高或最高的密码子，并考虑二级结构的形成W及酶切位点的选择， 最终得到本发明的HPV52L1基因的核巧酸序列SEQ ID NO ;2。
[0052] 实施例2 ;HPV52L1重组表达载体构建
[0053] 合成所得的52L1序列通过下列方法克隆入pPICZal地aB载体（Invitrogen)。W PCR的方式扩增得到两端分别带有BstBI和化nl的52L1DNA片段，PCR引物；正向引物；5'C AGGTGATCTTCGMACGATGAGTGTTTGGAGAC3,炬S巧I) (SEQ ID NO ;7);反向引物；5，ATTGGTACCC TATTATCTTTTAACT3'（Kpnl) (SEQ ID NO ;8)。PCR 程序；94°C 5 分钟，94°C 30 砂、55°C 30 砂、 72°C 1分50砂循环30次，72°C 10分钟，1(TC 10分钟，运行结束。PCR产物W琼脂糖凝胶 电泳鉴定并回收1500bp处条带（Qiagen gel extraction kit)。回收片段与pPICZal地aB WBstBI和化nl (New化gland Biol油）联合酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定并分别回收约 1500bp和3600bp片段。回收后52L1与pPICZal地aB W摩尔比为5 : 1的比例用T4连接 酶（Takara)16°C过夜连接，第二天连接产物转化入E. coli D册a，涂布于低盐LB平板（含 25ug/mL Zeocin)，37°C过夜培养。挑取部分转化后克隆抽提质粒，双酶切化indlll+Kpnl) 鉴定，琼脂糖电泳检测（图1)。鉴定所得阳性重组克隆经DM测序验证正确后保存，此重组 载体命名为pPIC巧化1。
[0054] 实施例3 ;HPV52L1重组表达菌株构建与表达
[00巧]W SacI线性化pPIC巧化1，酶切反应结束后酷；氯仿去除蛋白，再加入2. 5倍体积 无水己醇，1/10体积3M NaAc (抑5. 2)沉淀DNA，所得沉淀经75%己醇洗涂、烘干后W少量无 菌dd&O溶解沉淀，电转毕赤酵母宿主菌（Invitrogen)，涂布于YPDS平板（含180 y g/mL Zeocin)，3(TC培养3天，得数百克隆。从中挑取数十克隆接种于Yro平板（含1500yg/mL Zeocin)，筛选质粒高拷贝菌株，3(TC培养2天。部分克隆生长较快，挑取生长情况最好的数 个克隆接种于5mL YTO液体培养基，24小时后更换BMMY培养基，0. 5%甲醇诱导48小时后 收集菌体。菌体经玻璃珠破碎后，离也所得上清液W Western-blot鉴定（图2)，所用一抗 为自制兔多抗。取表达量最高的菌株冻存于-8(TC，作为发酵罐培养工作种子。
[005引实施例4 ;HPV5化1重组蛋白的发酵罐培养
[0057] 从工作种子库取1支菌种甘油冻存管，即实施例3所得的表达HPV5化1的基因 工程菌，融化后吸取lOOuL接入5血YTO培养基，280转/分钟（rpm)，3(TC培养20小 时。菌体密度达ODe。。约为1-2。镜检无杂菌污染。将检验合格的活化液ImL接入500mL YTO培养基，280巧m，3(TC培养20小时。菌体密度达ODe。。约为2-6。镜检无杂菌污染。发 酵用基础盐培养基 BSMl(K2S〇4273g，M拆〇4l09g，CaS〇4 ? 2&017. 6g，H3PO44OO. 5mL，K0册2g, 甘油600g，PTM160血，泡敌1血，去离子水加至15L)，不含有抗生素，配制后在3化发酵罐 (Bioengineering公司）中进行实罐灭菌。灭菌条件为12TC，30分钟，消后冷至30°C。将上 述活化后种液: 15接种于罐内。发酵温度为30. 0 + 0. 5°C，初始P册.00 + 0. 05,起始转 速 300巧m 培养，通气量 0. 5vvm，DO (溶氧值）100 %，添加 PTM1 (CuS〇4 ? 5&06. Og，NalO. 008g, MnS〇43. Og, NaMo〇4〇. 2g, H3BO3O. 02g, &1SO42O. Og, C0CI2O. 5g, FeS〇4 ? 7&065. Og, biotinO. 2g, H2S〇45.0mU去离子水加至IL)痕量盐类。初始增殖阶段大约24小时左右，维持溶氧值不 低于20%，当碳源消耗完毕时，溶氧值迅速地上升，菌体湿重达到约lOOg/L。初始两小时 W每小时200mL/h的速率补加体积百分比50%的甘油溶液（每升添加12mL PTM1)。补料 两小时后改为300mLA。通过调节揽拌转速、空气流量、罐压（<0.8bar)使溶氧水平维持在 30% W上。补加约4小时，菌体湿重约200g/L时，停止补料，溶氧值上升。同时将抑值控 制调为6. 00 + 0. 05,开始加入甲醇（每升添加12血PTM1)诱导。最初甲醇加入量控制在 30mLA。缓慢增加甲醇的加入量，甲醇诱导4小时后将补料速度设定为90mLA。维持溶氧 值高于体积百分比20%，温度维持在3(TC，抑值控制为6. 00 + 0. 05。诱导40小时发酵结 束时放出发酵液。4°C离也收集菌体，菌体湿重达390g/L。
[005引 实施例5 ;HPV52L1蛋白纯化
[0059] 收集的菌体破菌（破菌缓冲液；200mM MOPS, pH7. 0,0. 7化C1，0. 05% Tween-80) 离也后，取破菌后上清液经过层析方法纯化，得到自组装成病毒样颗粒的LI蛋白，具体 步骤如下；将表达HPV5化1VLP的毕赤酵母细胞，按1 : 5加入破菌缓冲液混合，充分混 匀后，高压破碎W上细胞息液，并重复操作，使90 %的细胞破碎。将高压破碎的破菌液， 于9000巧m，30min，1(TC离也分离，收集离也后上清液。将经过离也澄清的破菌上清液通 过P0R0S50HS(Applied Biosystems公司层析柱进行初步纯化，洗脱方式为；100%缓冲 液A(0.5M化Cl，50mMM0PS抑7.0,0.05%Tween-80)至100%的缓冲液B(1.5M化Cl， 50mM MOPS抑7. 0,0.05% Tween-80)的线性梯度洗脱，收集洗脱组分，并采用SDS-PAGE， Western-blot 检测。
[0060] 将含有HPV52L1蛋白的洗脱组分合并后，使用CHT炬I0-RAD Typell)层析柱 进一步纯化，洗脱方式为；1〇〇%缓冲液A巧mM PB，0. 6M化Cl，50mM MOPSp册.5,0. 05% Tween-80)至100%的缓冲液B(200mMPB，0.6M化Cl，p册.5,0.05%Tween-80)的线性梯 度洗脱。收集洗脱组分，并采用SDS-PAGE和Western-blot检测，将含有HPV5化IVLP的组 分合并，即为最后的纯化样品。SDS-PA(iE电泳检测L1蛋白纯度，扫描结果显示纯化的病毒 样颗粒纯度大于90% (图3)。经过电镜（上海复旦大学化学系电镜室）观察纯化样品中 呈现病毒样颗粒（图4)，结果显示颗粒直径在60-100nm之间。
[0061] 实施例6 ;本发明的HPV52L1重组蛋白的表达量测定
[0062] 本实施例根据化a壯ord法测得的发酵后菌体破菌上清液中总蛋白含量和Elisa 夹也法测得的HPV5化IVLP的表达量，计算得到HPV5化IVLP在破菌后总蛋白中的含量。具 体步骤如下：
[0063] 1.使用化a壯ord法测定发酵菌体破菌上清液中总蛋白含量
[0064] 使用上海博彩生物科技有限公司市售的K4000Bra壯ord protein quantitation reagent试剂盒进行测定。
[0065] 在7支 1. 5ml EP管内一次加0y l，10y l，20y l，40y l，80y l，100y 1 BSA标准品 (0. 5mg/ml)和实施例4中获得的发酵菌体的破菌上清液40 y 1 (稀释100倍），用水补足至 总体积为100 yl，混匀。每一浓度设3个平行样。每管加入900 yl Bra壯ord solution, 立即混匀，室温放置10分钟后分别测定ODggg光吸收值。根据6组BSA标准品作出蛋白浓 度对吸光值标准曲线并计算得到线性方程式，再根据破菌上清液所得光吸收值与标准曲线 线性方程式计算出发酵菌体破菌上清液的总蛋白含量。
[0066] 2.用Elisa夹也法测定HPV5化1VLP在发酵后菌体破菌上清液中的含量
[0067] 使用纯化的HPV5化1VLP做标准蛋白浓度曲线，诱导前的菌体作为阴性对照。
[0068] 用包被液（1.6g化2〇)3,2. 95g NaHC〇3)将兔抗HPV5化1VLP多抗稀释2000倍， 然后向酶标板的各凹孔中各加入0. 1ml稀释后的兔多抗，4°C过夜。移去包被液，用0. 3ml PBST(PBS，抑7. 0,0. 05% Tween-20)洗涂凹孔，再用0. 3ml封闭液巧％脱脂奶粉+PBST)于 37°C保温2小时。
[0069] 用稀释液（PBS，PH7.0) W连续二倍稀释的方式，将实施例5中获得的纯化 HPV5化1VLP从浓度2 y g/ml梯度稀释到0. 0625 y g/ml，W此作为标准样品。同时将实施例 4中获得的发酵菌体的破菌上清液稀释200倍，然后分别向凹孔中加入0. 1ml梯度稀释后的 不同浓度的HPV5化1VLP溶液或稀释后的破菌上清液，于37C保温1小时后，移去抗原液， 并用0.31111口851'洗涂凹孔。然后用抗体稀释缓冲液任85，口^.0,2%脱脂奶粉）将祖8885 鼠抗HPV5化1VLP单抗（购自C肥MIC0N公司）1000倍稀释后加入到凹孔中，每孔加0. 1ml， 37°C保温1小时。移去单抗溶液，用0. 3ml PBST洗涂凹孔。再向各凹孔中加入用抗体稀释 缓冲液稀释5000倍的HRP标记的羊抗鼠IgGO. 1ml，37C保温0. 5小时。移去抗体溶液，并 用0. 3ml PBST洗涂凹孔，向凹孔中各加入0. 1ml DAB显色液（购自Amresco公司），室温 作用20分钟。向每个凹孔中加入0. 05ml2M &S化终止液W终止反应，并用酶标比色仪测定 〇〇4日。吸光值。
[0070] 利用梯度稀释的HPV5化1VLP的0〇45。的检测结果，制作标准蛋白浓度曲线，再通过 标准蛋白浓度曲线换算得HPV52L1蛋白的发酵表达量。
[0071] 本实施例的结果示于表1。由表1可W看出，本发明的HPV52L1基因的表达量最高 可达到140 y g/mg(破菌上清液中的HPV5化1VLP/破菌上清液总蛋白）。
[0072] 表1 ;本发明的HPV52L1基因的表达量
[0073]

【权利要求】
1. 一种人乳头瘤病毒基因，所述的基因为天然L1蛋白基因经毕赤酵母偏爱密码子优 化，其特征在于，HPV基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2,SEQIDNO:4,或SEQIDNO:6所 /_J、i〇
2. 根据权利要求1所述的HPV基因，其中该基因表达的蛋白质能够在毕赤酵母内自组 装成病毒样颗粒。
3. -种在毕赤酵母中表达HPV基因的方法，包括下述步骤： A将权利要求1所述的一个HPV基因的核酸分子克隆至表达载体中； B将步骤A中所的表达载体转化至毕赤酵母菌株中； C培养和筛选转化体； D使用步骤C获得的菌株表达重组的HPV蛋白。
4. 根据权利要求3所述的表达载体，其特征是，一种毕赤酵母表达载体。
5. 根据权利要求4所述的表达载体，其特征是，pPICZaB载体。
6. 根据权利要求3所述的毕赤酵母菌株，其特征是，选自毕赤酵母X-33、GS115、KM71 和SMD1168菌株。
7. 根据权利要求6所述的毕赤酵母菌株，含有权利要求4或5之一项所述的表达载体。
8. -种制备抗人乳头瘤病毒52, 31，或45型疫苗的方法，其特征是，包括采用权利要求 1-6所述的方法、菌株、载体、基因、蛋白的任一项，制备重组人乳头瘤病毒52, 31，或45型L1 蛋白病毒样颗粒，然后加入药学上可用的疫苗佐剂。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征是，所述的药学上可用的疫苗佐剂为铝佐剂。
10. 根据权利要求8所述的疫苗，其特征在于，用于预防人乳头瘤病毒相关疾病的，选 自重组人乳头瘤病毒52, 31，或45型L1蛋白病毒样颗粒，包含其中一种或多种的组合物中 的用途。
11. 根据权利要求10所述的用途，其特征是，所述的疾病选自：肿瘤、宫颈上皮内瘤样 病变、外生殖器疣。
【文档编号】C12N15/37GK104513826SQ201310454513
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】丛薇, 刘瑞峰, 许丹 申请人:上海泽润生物科技有限公司