人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的快速适应方法
【专利摘要】本发明公开了一种人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的快速适应方法，将新鲜狂犬病毒接种人二倍体细胞上，带毒传代，仅需4-5个循环，传代12-15代，病毒滴度从第P1代的3.0logLD50/ml升至P15代的7.0logLD50/ml以上，缩短病毒的适应周期至少50%，在不影响病毒免疫原性的前提下快速提高病毒产量，节约人力物力。
【专利说明】人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的快速适应方法
[0001]发明所属领域:
[0002]本发明属于疫苗【技术领域】，具体地的说，本发明涉及人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的快速适应方法。
【背景技术】 [0003]狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的人畜共患的自然疫源性疾病，是中国法定报告中死亡数和病死率最高的传染性疾病。据2003年世界狂犬病调查报告显示，中国的发病人数仅次于印度，居世界第二位，中国卫生部已将狂犬病列为2类传染病加以管理，但近年来中国狂犬病疫情一直呈上升趋势，疫情形势十分严峻。
[0004]目前世界大量生产的狂犬疫苗有二倍体细胞狂犬疫苗、Vero细胞灭活疫苗、地鼠肾细胞、鸡胚、鸭胚疫苗。实验已经证明，在人体试验中所使用的任何疫苗的免疫原性都无法和人二倍体细胞HDCV相比。人二倍体细胞为正常核型细胞，无致癌性，并且由于HDCV所具有的高免疫性和良好的耐受性，目前已经成为评价任何一种人用新疫苗的标准疫苗。HDCV的一个缺点是在HDCV上培养的狂犬病毒滴度相对较低，这使得疫苗的价格非常昂贵。
[0005]狂犬病毒在人二倍体细胞上培养毒种必须先在细胞上进行适应。国内外的相关研究机构均做了大量的适应实验，如US3397267 (Mario V.Fernandes et.al)描述了 CVS、PM、HEP毒株在W1-38上的适应方法，是通过用感染的细胞传代，在传代过程中逐渐加大未感染病毒的细胞比例，进行连续传代，使病毒连续适应于细胞中增殖，约需要30-40代后才能适应。在未适应二倍体细胞之前用病毒悬液加正常细胞传代，其病毒滴度约为3.021ogLD5(l/ml，而通过带毒细胞传代后，其滴度可达7.01ogLD5(l/ml。我国中检所严子林等人采用相同的方法，用适应小鼠的狂犬固定毒CTN鼠脑悬液在KMB-17上适应，37代以前主要用带毒细胞加正常细胞混合后进行传代，37代后用病毒悬液加正常细胞传代。病毒滴度变化，2代
1.0，4 代 1.56，14 代 1.98，26 代 3.17，37-38 代 4.5，39-40 代 3.5-4.0，41-50 代 4.5-6.33，51-106代，2个代次为6.16-6.23，34个代次为4.5-5.5，15个代次为3.9-4.33，大部分代次在4.5-5.5/0.03ml之间，40代后CTN鼠脑病毒适应人二倍体细胞。浙江普康生物技术股份有限公司毛子安等人，将狂犬病毒固定毒CTN-1V5株连续在KMB-17中传代，并以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒，病毒滴度由第I代的4.51ogLD5(l/ml逐渐升高，到20代时病毒滴度≥6.9logLD50/ml，传代至47代病毒滴度基本稳定在7.01ogLD50/mL.[0006]以上这些方法均采用带毒传代并且需逐渐加大新鲜细胞的方法进行，需传代40代以上才能适应，耗时太长，且滴度较低。
【发明内容】
:
[0007]本发明的目的是克服现有工艺存在的不足之处，提供一种人用狂犬病病毒株在人二倍体细胞的快速适应方法，缩短病毒的适应周期，在不影响病毒免疫原性的前提下快速提高病毒产量，节约人力物力。
[0008]为达到上述目的，本发明公开了一种人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的适应方法，该方法包括下列步骤:
[0009]1)将新鲜狂犬病毒按0.0001-1M0I接种入分散为单个细胞的人胚肺二倍体细胞悬液中，在30-40°C吸附30-90分钟，补加细胞培养液至合适体积，30-40°C培养，2-5天成致密单层，弃细胞培养液，换病毒维持液，再培养3-7天，收获培养上清液，补加5-30%牛血清置低温冻存，并标为人二倍体细胞培养病毒Pl代；
[0010]2)带毒细胞消化传代，依1:1-1:3的传代比率传代，生长2-5天细胞成致密单层后换病毒维持液，30-40°C培养3-7天，收获上清冻存，标为人二倍体细胞培养病毒P2代；
[0011 ] 3)再次带毒细胞消化传代，依1:1-1: 3的传代比率传代，生长2-5天细胞成致密单层后换病毒维持液，30-40°C培养3-7天，收获上清冻存，标为人二倍体细胞培养病毒P3代；
[0012]4)接种步骤3)收获的病毒，重复步骤I )，2)，3)，为一个循环，经过4_5个循环，获得对人二倍体细胞敏感的狂犬疫苗毒种。
[0013]在本发明中，所述的人胚肺二倍体细胞为W1-38或MRC-5或KMB-17或Walvax-2，CCTCC C201055。优选为人胚肺二倍体细胞 Walvax-2，CCTCC C201055。
[0014]在本发明中，所述的分散为单个细胞的人胚肺二倍体细胞悬液是指将处于对数生长期的人胚肺二倍体细胞用胰酶消化分散，加培养液后离心并去上清，细胞沉淀用无血清培养液悬浮制得；在本发明中，病毒吸附细胞在30-40°C吸附30-90分钟，优选的，病毒在36°C吸附细胞60分钟；在本发明中，感染细胞在36°C培养，3-5天成致密单层。
[0015]在本发明中，所使用的细胞培养液为含5%_20%牛血清的MEM培养液；病毒维持液是含5%牛血清和1%蔗糖的MEM培养液。
[0016]在本发明中，人用狂犬疫苗毒种为CTN-1V5株或aG株或PM株，优选CTN-1V5株。
[0017]在本发明中，一种优选的人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的适应方法，该方法包括下列步骤:
[0018]I)将新鲜狂犬病毒CTN-1V5株按0.01M0I接种病毒入分散为单个细胞的人胚肺二倍体细胞Walvax-2悬液中，在36°C吸附60分钟，补加细胞培养液至合适体积，36°C培养，
4-5天成致密单层，弃细胞培养液，换含5%牛血清和1%蔗糖的MEM病毒维持液，再培养3-7天，收获培养上清液，补加5-30%牛血清置低温冻存，并标为人二倍体细胞培养病毒Pl代；
[0019]2)带毒细胞消化传代，依1:1-1:3的传代比率传代，生长2-5天细胞成致密单层后换病毒维持液，36°C培养3-7天，收获上清冻存，标为人二倍体细胞培养病毒P2代；
[0020]3)再次带毒细胞消化传代，依1:1-1:3的传代比率传代，生长2-5天细胞成致密单层后换病毒维持液，36°C培养3-7天，收获上清冻存，标为人二倍体细胞培养病毒P3代；
[0021]4)接种步骤3)收获的病毒，重复步骤1)，2)，3)，为一个循环，经过4-5个循环，获得对人二倍体细胞敏感的狂犬疫苗毒种。
[0022]在本发明中，经过4-5个循环，传代12-15代，细胞CPE逐渐增加，病毒滴度从第Pl代的 3.0logLD50Ail 升至 P15 代的 7.01ogLD50/ml 以上。
[0023]在本发明中，新鲜狂犬病毒是指直接从患病的动物体内取出的材料，或标准病毒毒种在低温存放后接种敏感动物并致动物出现典型症状后收获的病毒材料，如将低温存放后的病毒毒种接种鼠脑传代2-3次后得到的材料。
[0024]在本发明中，优选的人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2，保藏于国家知识产权局指定的保藏机构-中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201055，保藏日期是2010年7月13日。中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编 430072,电话:027_68752319。Email: cctcciwhu.edu.cn。
[0025]在本发明中，病毒与细胞在36°C吸附细胞60分钟，细胞是对数生长期细胞，处旺盛生长阶段，且将单层细胞通过胰酶消化成单个细胞。被病毒感染细胞在36°C培养，3-5天成致密单层。细胞培养液为含5%-20%牛血清的MEM培养液。病毒维持液是含5%牛血清和1%蔗糖液的MEM培养液。
[0026]本发明所述的方法适用于所有用于人用狂犬病疫苗生产的毒株，如CTN-1V5株、aG 株、PM 株、PV 株、CVS 株、SAD 株、ERA 株、Flury LEP 株、Flury HEP 株、Vnukovo32 株、Kissling CV株，其中CTN-1V5株的适应情况优于其他病毒株。狂犬病毒为弹状病毒科的典型成员，不同毒株在相同细胞内病毒粒子数量有明显差异。在培养过程中因感染量大或经长期培养易出现DI粒子，大量DI粒子的存在可显著降低病毒的免疫原性。本发明的毒株在适应之前，先稀释后接种到易感动物如9-llg小鼠脑内，优选出典型病毒颗粒而达到复壮的目的。
[0027]本发明所述的方法使用于所有用于人用疫苗生产的人二倍体细胞，包括W1-38、KMB-17、MRC_5、2BS以人胚肺二倍体细胞株Walvax-2株。其中，Walvax-2细胞株的适应状况优于其它二倍体细胞。Walvax-2细胞株具有典型的人二倍体细胞体外培养特征，细胞成纤维状成片成束生长，形态良好，呈有限生命代次，培养至58代次体外培养告终。根据《中国药典三部》——“生物制品生产用动物细胞基质制备及检定规程”建立原始、主代、工作代三级细胞库，并进行了全面的检定。所有细胞基质中，walvax-2显示了其良好的适应性。
[0028]本发明所使用的细胞培养液为199培养液、MEM培养液或DMEM培养液，优选MEM培养液，含5%-20%牛血清，NaHC03调节pH至7.0-7.2。为有效降低产品的潜在风险，提高产品质量，本发明的细胞培养液、病毒维持液均不添加抗生素，为减少其他细菌污染的风险，培养液可采用0.22um滤膜进行过滤除菌。
[0029]本发明所用的病毒维持液为199、MEM、DMEM病毒维持液，优选MEM培养液，含1_5%牛血清。因狂犬病毒颗粒的完整性和免疫原性直接相关，为了保证释放到上清的狂犬病毒颗粒的完整性，本发明在病毒维持液中还添加其他的病毒保护剂如0.001-1%蔗糖液(W/W)，为了提高病毒的产量，使病毒尽快适应于细胞，本发明还在病毒维持液中添加了氨基酸，如精氨酸等。
[0030]本发明的液体毒种_70°C保存2.5年，滴度下降仅为0.21ogLD5(l/ml，冻干毒种滴度没有变化，可长期保存。
[0031 ] 本发明的优势是在维持甚至提高狂犬病毒免疫原性的前提下，缩短狂犬病毒在细胞基质上的适应时间。采用发明中的方法适应狂犬毒种，10-15代滴度均大于7.0logLD50/ml，继续传代至30-40代，毒种保持稳定。
[0032]本发明适应的毒种按照《中华人民共和国药典》三部中的相关方法进行全检，无菌、支原体、外源因子均为阴性，中和指数大于105，保护指数大于1000。
[0033]本发明中所指的人用狂犬病疫苗生产的毒株，如CTN-1V5株、aG株、PM株、PV株、CVS 株、SAD 株、ERA 株、Flury LEP 株、Flury HEP 株、Vnukovo32 株、Kissling CV 株在美国典型培养物保藏中心，中国药品生物制品标准化研究中心等都有保藏，处于公开销售状态，符合要求的研究者可从中索取；同样的W1-38和MRC-5美国典型培养物保藏中心有保藏，处于公开销售状态，符合要求的研究者可从中索取；KMB-17和2BS在中国典型培养物保藏中心有保藏，处于公开销售状态，符合要求的研究者可从中索取；人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2在专利201210371784.X已公开，且保藏于国家知识产权局指定的保藏机构-中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201055，保藏日期是2010年7月13日。中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编430072，电话:027-68752319，符合要求的研究者可按法索取。
[0034]本发明的优点主要体现在以下几个方面:
[0035]I)本发明提供的方法，仅需4-5个循环。经过4-5个循环，传代12_15代，病毒滴度从第Pl代的3.0logLD5ciAil升至P15代的7.01ogLD50/ml以上，缩短病毒的适应周期一半还多，在不影响病毒免疫原性的前提下快速提高病毒产量，节约人力物力；
[0036]2)狂犬病疫苗生产的毒株CTN-1V5在人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2可快速适应，传代10代，病毒滴度升至7.0logLD5ciAil以上。
[0037]3)本发明所述的Walvax-2细胞为自主研发的人二倍体细胞，具有典型的人二倍体细胞体外培养特征，细胞成纤维状成片成束生长，形态良好生命周期为58代次。有全面检定的原始、主代、工作代三级细胞库 ；
[0038]4)适应的液体毒种_70°C保存2.5年，滴度下降仅为0.21ogLD5(l/ml，冻干毒种滴度没有变化，可长期保存。
【具体实施方式】
[0039]下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。
[0040]实施例1病毒在易感动物上的复壮
[0041]分别取狂犬病疫苗生产的毒株CTN株-1V5，PM株，aG株做10000倍稀释，鼠脑接种9-llg昆明小鼠，0.03ml/只，饲养4-5天，选有典型狂犬病症状的小鼠无菌取鼠脑。制备成KT1鼠脑悬液，取KT1病毒悬液用2%小牛血清磷酸盐缓冲液稀释成10_2病毒悬液，重复以上步骤进行传代，传代3代后使用。
[0042]实施例2 CTN-1V5病毒在细胞Walvax-2细胞和MRC-5细胞上的适应
[0043]2.1常规方法复苏Walvax-2细胞和MRC-5细胞，使用含10%小牛血清的MEM传代至25-30代使用，长成单层后消化，分散呈单个细胞，加完全培养液后离心并去上清，细胞沉淀用无血清培养液悬浮制得分散为单个细胞的人胚肺二倍体细胞悬液；
[0044]2.2将新鲜狂犬病毒CTN-1V5毒种按0.0001-1M0I接种入分散为单个细胞的人胚肺二倍体细胞悬液中，在37°C吸附90分钟，补加细胞培养液至合适体积共8毫升，30-40°C培养，2-5天成致密单层，弃细胞培养液，换含5%小牛血清、1%蔗糖液的MEM培养液维持5天收获上清，补加5-30%牛血清置低温冻存，并标为人二倍体细胞培养病毒Pl代；
[0045]2.3带毒细胞消化传代，依1:1-1:3的传代比率传代，生长2_5天细胞成致密单层后换病毒维持液，30-40°C培养3-7天，收获上清冻存，标为人二倍体细胞培养病毒P2代；
[0046]2.4再次带毒细胞消化传代，依1:1-1:3的传代比率传代，生长2_5天细胞成致密单层后换病毒维持液，30-40°C培养3-7天，收获上清冻存，标为人二倍体细胞培养病毒P3代；
[0047]2.5接种步骤2.4)收获的病毒，重复步骤2.2，2.3，2.4为一个循环，经过5个循环，传代15次，获得对人二倍体细胞敏感的狂犬疫苗毒种。
[0048]按照《中华人民中和国药典》鼠脑接种法进行滴度检测，采用ll_13g昆明小鼠，鼠脑接种0.03ml/只,观察14天计算半数致死量。
[0049]表一:CTN_1V5在细胞Walvax-2和MRC-5上的适应情况
[0050]
【权利要求】
1.一种人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的适应方法，该方法包括下列步骤: O将新鲜狂犬病毒按0.0001-1M0I接种入分散为单个细胞的人胚肺二倍体细胞悬液中，在30-40°C吸附30-90分钟，补加细胞培养液至合适体积，30-40°C培养，2-5天成致密单层，弃细胞培养液，换病毒维持液，再培养3-7天，收获培养上清液，补加5-30%牛血清置低温冻存，并标为人二倍体细胞培养病毒Pl代； 2)带毒细胞消化传代，依1:1-1:3的传代比率传代，生长2-5天细胞成致密单层后换病毒维持液，30-40°C培养3-7天，收获上清冻存，标为人二倍体细胞培养病毒P2代； 3)再次带毒细胞消化传代，依1:1-1:3的传代比率传代，生长2-5天细胞成致密单层后换病毒维持液，30-40°C培养3-7天，收获上清冻存，标为人二倍体细胞培养病毒P3代； 接种步骤3)收获的病毒，重复步骤I )，2)，3)，为一个循环，经过4-5个循环，获得对人二倍体细胞敏感的狂犬疫苗毒种。
2.根据权利要求1中所述的人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的适应方法，其中人胚肺二倍体细胞为 W1-38 或 MRC-5 或 KMB-17 或 Walvax-2，CCTCC C201055。
3.根据权利要求1中所述的人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的适应方法，其中人胚肺二倍体细胞 Walvax-2，CCTCC C201055。
4.根据权利要求1中所述的人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的适应方法，其中，病毒在36°C吸附细胞60分钟。
5.根据权利要求1中所述的人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的适应方法，其中，感染细胞在36°C培养，3-5天成致密单层。
6.根据权利要求1中所述的人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的适应方法，其中，所使用的细胞培养液为含5%-20%牛血清的MEM培养液。
7.根据权利要求1中所述的人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的适应方法，其中，病毒维持液是含5%牛血清和1%蔗糖的MEM培养液。
8.根据权利要求1中所述的人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的适应方法，其中，人用狂犬疫苗毒种为CTN-1V5株或aG株或PM株。
9.根据权利要求1中所述的人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的适应方法，其中，人用狂犬疫苗毒种为CTN-1V5株。
10.根据权利要求1中所述的人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的适应方法，该方法包括下列步骤: 1)将新鲜狂犬病毒CTN-1V5株按0.0lMOI接种病毒入分散为单个细胞的人胚肺二倍体细胞Walvax-2悬液中，在36°C吸附60分钟，补加细胞培养液至合适体积，36°C培养，4- 5天成致密单层，弃细胞培养液，换含5%牛血清和1%蔗糖的MEM病毒维持液，再培养3-7天，收获培养上清液，补加5-30%牛血清置低温冻存，并标为人二倍体细胞培养病毒Pl代； 2)带毒细胞消化传代，依1:1-1:3的传代比率传代，生长2-5天细胞成致密单层后换病毒维持液，36°C培养3-7天，收获上清冻存，标为人二倍体细胞培养病毒P2代； 3)再次带毒细胞消化传代，依1:1-1:3的传代比率传代，生长2-5天细胞成致密单层后换病毒维持液，36°C培养3-7天，收获上清冻存，标为人二倍体细胞培养病毒P3代； 4)接种步骤3 )收获的病毒，重复步骤1 )，2 )，3 )，为一个循环，经过4-5个循环，获得对人二倍体细胞敏感的狂犬疫苗毒种。
【文档编号】C12N7/00GK103468649SQ201310463715
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年10月8日 优先权日:2013年10月8日
【发明者】杨喆, 马波, 何丽芳, 王丽丽, 李伟, 陈敏, 王馨, 尹孝兵 申请人:云南沃森生物技术股份有限公司