一种生产2-klg的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种生产2-KLG的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌及其应用，本发明通过基因工程技术，将来源于普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium?vulgare)的山梨糖脱氢酶（SDH）、山梨酮脱氢酶（SNDH）基因，通过连接肽连接后表达于氧化葡萄糖酸杆菌中，获得了高效生产2-KLG的G.oxydans工程菌。G.oxydans是二步发酵法生产2-KLG中第一步发酵过程常用菌种，将sdh、sndh基因表达于G.oxydans中，可以解除小菌对伴生菌依赖的问题，实现了从D-山梨醇到2-KLG的直接转化，简化了维生素C生产工艺，2-KLG的产量可达32.4g/L，具有很好的应用前景。
【专利说明】—种生产2-KLG的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种氧化葡萄糖酸杆菌工程菌及其应用，特别是一种生产2-KLG的氧化葡萄糖酸杆菌工程菌及其应用，属于遗传工程领域。
【背景技术】
[0002]维生素C(Vitamin C, VC),又称为抗坏血酸(Ascorbic acid),是一种人体必需的维生素和抗氧化剂，广泛应用于医药、食品、饲料和化妆品等工业。目前国内维生素C工业化生产采用二步发酵法，在第二步混合菌发酵体系中，执行糖酸转化的微生物只有小菌，小菌单独生长很困难，需要与大菌共同培养才能正常生长。两种菌的发酵控制为生产工艺增加了很大困难，且小菌产酸性状不稳定，因而导致生产不稳定，经常因菌种退化造成倒罐，导致生产上屡屡遭受重大损失。我国维生素C发酵技术从山梨醇到2-KLG的发酵过程由3种细菌参与，势必在微生物代谢过程中造成底物和培养基的大量浪费，发酵过程分为两步不但延长了生产周期还造成能源和人力的大量浪费。因此，现有维生素C两步发酵工艺尚存在巨大技术进步的潜力。G.0xydans是二步发酵法生产2-KLG中第一步发酵过程常用菌种，通过基因工程手段将维生素C两步发酵有关基因转化到G.0xydans中构建得到一步发酵菌株，实现由山梨醇经单菌一步发酵生成2-KLG，解除了小菌对伴生菌依赖的问题，简化了维生素C生产工艺。
[0003]采用连接肽工程改造G.0xydans 一步菌生产维生素C合成前体2-KLG国内未见有相关报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的 是提供一种生产2-KLG的氧化葡萄糖酸杆菌工程菌。
[0005]所述工程菌表达sdh、sndh基因，sdh、sndh基因通过连接肽进行连接。
[0006]所述sdh、sndh基因核苷酸序列如KVU-0203、NCBI登陆号为AEM40042.1，KVU-0095NCBI 登陆号为 AEM39934.1 所示。
[0007]所述sdh、sndh融合基因克隆于G.0xydans-E.coli穿梭质粒载体P⑶Cl上。
[0008]本发明要解决的另一个技术问题是提供一种生产2-KLG的G.0xydans基因工程菌的构建方法。
[0009]为解决上述技术问题，本发明的具体方案为:
[0010]I)根据本实验室对K.VUlgare WSH-001的全基因组测序结果中注释的sdh、sndh(NCBI登陆号为AEM40042.UAEM39934.1)基因序列设计引物克隆sdh/sndh基因或通过化学全合成获得基因，通过融合PCR将sdh和sndh以不同的连接肽进行连接；
[0011]2)将sdh、sndh融合基因与载体连接得到重组表达载体；
[0012]3)将得到的重组表达载体转化氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)后得到重组菌株。
[0013]下面是本发明技术方案的具体描述:[0014]质粒及重组菌的构建
[0015]将本实验室对K.vulgare WSH-001的全基因组测序结果中注释的sdh及sndh基因序列分别以连有 10 种连接肽(GGGGS、GGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGS、PTPTP、PTPTPTPTP、PTPTPTPTPTPTPTP、EAAAK、EAAAKEAAAK、EAAAKEAAAKEAAAK 及 SSSNNNNNNNNNN)的引物进行扩增，通过PCR融合后连接到克隆载体pMD19-T测序，同时将来源于G.0xydans的强启动子tufB进行扩增连接到克隆载体pMD19_T测序，获得正确的转化子后进行双酶切连接到E.col1-G.0xydans穿梭质粒载体p⑶Cl,构建得到10个融合表达载体 pGUC-tufB-sdh-GS-sndh、pGUC-tufB-sdh-GS2-sndh> pGUC-tufB-sdh-GS3-Sndh>pGUC-tufB-sdh-PT-sndh、 pGUC-tufB-sdh_PT4-sndh、 pGUC-tufB-sdh_PT7-sndh、pGUC-tufB-sdh-EAK-sndh、pGUC-tufB-sdh_EAK2-sndh、pGUC-tufB-sdh-EAK3-sndh 及p⑶C-tufB-sdh-S3N1Q-sndh。将构建好的重组表达载体转化E.coli JM109,菌落PCR验证阳性转化子(出现约3027bp的条带)，通过三亲本杂交的方法将重组表达载体转移至G.0xydans WSH-003 中。
[0016]重组菌的种子培养及发酵
[0017]种子培养基(g/L):山梨醇15，酵母粉1.0, ρΗ4.8~5.1，琼脂20 (固体培养基)，121°C灭菌15min，氨苄青霉素终浓度100 μ g/mL。
[0018]发酵培养基(g/L):山梨醇15，酵母粉1.2，氯化钙0.2，初始pH5.1~5.4，121°C灭菌15min，氨苄青霉素终浓度100 μ g/mL。
[0019]培养条件:从固体平板上刮取几环菌体接种于装有50mL液体培养基(加入终浓度75 μ g/mL氨苄青霉素)的500mL双刺摇瓶中，30°C旋转式摇床200r/min振荡培养至对数生长期(30h左右)，按15%(v/v)接种量转接至终浓度75 μ g/mL氨苄青霉素的新鲜培养基，再培养至对数生长期，按15%(v/v)接种量转接发酵培养基，30°C，200r/min，发酵168h。
[0020]山梨醇、2-KLG含量测定:液相色谱(LC)
[0021]发酵样品用流动相十倍稀释,0.45 μ m滤膜过滤。AgilentllOOsystem, RioRad公司Aminex HPX-87H色谱柱；流动相:2.75ymol/L浓硫酸；柱温:35°C;流速:0.6mL/min ;进样量:5 μ L ;检测器:示差折光检测器。
[0022]本发明通过基因工程改造,将来源于普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigeniumvulgare)的sdh、sndh基因以不同的连接肽融合后表达于氧化G.0xydans WSH-003中，获得了 10株利用山梨醇生产2-KLG的G.0xydans工程菌。采用G.0xydans工程菌利用山梨醇一步发酵生产2-KLG，解除了小菌对伴生菌依赖的问题，简化了维生素C生产工艺。2-KLG的产量可达34.8g/L，具有很好的应用前景。本发明提供的构建方法简单，适于标准化。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1采用10种连接肽将山梨糖脱氢酶和山梨酮脱氢酶进行融合后2-KLG产量。G.0xydans/pGUC-t-sdh-GS-sndh (I), G.0xydans/pGUC-t-sdh- (GS) 2_sndh (2), G.0xydans/pGUC-t-sdh- (GS) 3_sndh ⑶，G.0xydans/pGUC-t-sdh- (PT) 2P_sndh (4)，G.0xydans/pGUC-t-sdh- (PT) 4P_sndh (5), G.0xydans/pGUC-t-sdh- (PT) 7P_sndh (6), G.0xydans/pGUC-t-sdh-EAK-sndh (7), G.0xydans/pGUC-t-sdh- (EAK) 2_sndh (8)，G.0xydans/pGUC-t-sdh- (EAK) 3_sndh (9)，G.0xydans/pGUC-t-sdh-S3N10-sndh (10)。【具体实施方式】
[0024]实施例1表达载体的构建
[0025]将本实验室对K.vulgare WSH-001的全基因组测序结果中注释的sdh及sndh基因序列分别以连有 10 种连接肽(GGGGS、GGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGS、PTPTP、PTPTPTPTP、PTPTPTPTPTPTPTP、EAAAK、EAAAKEAAAK、EAAAKEAAAKEAAAK 及 SSSNNNNNNNNNN)的引物进行扩增，通过PCR融合后连接克隆载体pMD19-T进行测序，同时将来源于G.0xydans的强启动子tufB进行扩增连接到克隆载体pMD19_T测序，获得正确的转化子后进行双酶切连接到E.col1-G.0xydans穿梭质粒载体p⑶Cl,构建到10个融合表达载体 pGUC-tufB-sdh-GS-sndh、pGUC-tufB-sdh-GS2-sndh> pGUC-tufB-sdh-GS3-Sndh>pGUC-tufB-sdh-PT-sndh、 pGUC-tufB-sdh_PT4-sndh、 pGUC-tufB-sdh_PT7-sndh、pGUC-tufB-sdh-EAK-sndh λ pGUC-tufB-sdh_EAK2-sndh、pGUC-tufB-sdh_EAK3-sndh 及pGUC-tuf B-sdh-S3N10-sndh。
[0026]实施例2G.0xydans工程菌的构建
[0027]将构建好的表达载体转化到E.coli JM109，涂布到含有氨苄青霉素的LB培养基上(酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaC110g/L，固体培养基加20g/L琼脂，121°C灭菌15min)，挑取转化后平板上的转化子进行PCR验证，出现约3027bp的条带，证明已成功转化到E.coli JM109中，再通过三亲本杂交的方法转移至G.0xydans WSH-003中，得到10株G.0xydans 工程菌。
[0028]实施例3发酵生产2-KLG
[0029]种子培养基(g/L):山梨醇15，酵母粉1，ρΗ4.8~5.1，琼脂20(固体培养基)，121°C灭菌15min，氨苄青霉素终浓度100 μ g/mL。
[0030]发酵培养基(g/L):山梨醇15，酵母膏1.2，氯化钙0.2，初始？册.1~5.4，1211:灭菌15min，氨苄青霉素终浓度100 μ g/mL。
[0031]培养条件:从固体平板上刮取几环菌体接种于装有50mL液体培养基(加入终浓度75 μ g/mL氨苄青霉素)的500mL双刺摇瓶中，30°C旋转式摇床200r/min振荡培养至对数生长期(30h左右)，按15%(v/v)接种量转接至终浓度75 μ g/mL氨苄青霉素的新鲜培养基，再培养至对数生长期，按15%(v/v)接种量转接发酵培养基，30°C，200r/min，发酵168h。10株工程菌中得到2-KLG最高产量为32.4g/L(Fig.1)。
[0032]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1.一种生产2-KLG的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)基因工程菌,其特征在于表达外源sdh、sndh基因,所述外源sdh、sndh基因通过连接肽连接。
2.权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述sdh、sndh基因核苷酸序列如KVU-0203.NCBI 登陆号为 AEM40042.1，KVU-0095NCBI 登陆号为 AEM39934.1 所示。
3.权利要求1所述的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，其特征在于所述连接肽为GGGGS、GGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGS、PTPTP、PTPTPTPTP、PTPTPTPTPTPTPTP、EAAAK、EAAAKEAAAK、EAAAKEAAAKEAAAK 或 SSSNNNNNNNNNN。
4.权利要求1所述基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤: 1)根据本NCBI公开的sdh(NCBI登陆号为AEM40042.1)、sndh(NCBI登陆号为AEM39934.1)基因序列设计引物克隆或采用化学全合成法sdh、sndh基因，通过融合PCR将sdh和sndh以不同的连接肽进行连接； 2)将融合后的基因与载体连接得到重组表达载体； 3)将得到的重组表达载体转化氧化葡萄糖酸杆菌后得到产2-KLG的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌。
5.权利要求1所述氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌在发酵生产2-KLG中的应用。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于具体步骤为:将所述氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌接种于装有50mL液体培养基(含有终浓度75 μ g/mL氨苄青霉素)的500mL双刺摇瓶中，30°C旋转式摇床200r/min振荡培养至对数生长期，按15%(v/v)接种量转接至终浓度75μ g/mL氨苄青霉素的新鲜培养基，再培养至对数生长期，按15%(v/v)接种量转接发酵培养基，300C，200r/min`,发酵 168h。
【文档编号】C12P7/60GK103484418SQ201310466179
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年10月8日 优先权日:2013年10月8日
【发明者】陈坚, 周景文, 高丽丽, 堵国成 申请人:江南大学