一种简化的Sanger法基因测序方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，公开了一种简化的Sanger法基因测序方法。本发明以荧光定量PCR和核酸纯化技术为基础，对Sanger法基因测序技术进行大幅度改进，减少了sanger法基因测序流程和操作步骤，缩短了基因测序时间。本发明测序方法操作简单、安全，同时不需要较多昂贵试剂的使用，经济高效；本发明测序方法能有效缩短操作时间，测序过程可在4～6小时内完成；本发明的基因测序过程可以在96孔板或8连管中全部完成，不需要转移试管，从而能够有效防止污染。
【专利说明】—种简化的Sanger法基因测序方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种简化的Sanger法基因测序方法。
【背景技术】
[0002] 在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于DNA测序的技术主要有Frederick Sanger发明的Sanger双脱氧链终止法(ChainTermination Method)。Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，这样就形成了大量末端被突光标记的、长短不一(终止位点不同)的延伸产物。接着，再用高分辨率的毛细管凝胶电泳分离这些延伸产物，通过对延伸产物末端四种不同荧光颜色的区分，计算机软件会自动“读出”DNA序列，从而获得可见的DNA碱基序列。Sanger基因测序技术经过了 30年的不断发展与完善，现在已经可以对长达1，OOObp的DNA片段进行测序，而且对每一个碱基的读取准确率高达99.999%。由于具有很高的读取准确率，Sanger法测序成为基因突变、单核苷酸多态性等基因分析的金标准。但是由于Sanger法测序前需要对样本进行前期处理，处理时间长，操作步骤多，处理过程中容易造成污染，从而限制了 Sanger法基因测序在临床中的使用。
[0003]因此,本领域迫切需求开发Sanger法测序流程简化方案,用于减少Sanger法测序流程，缩短Sanger法测序时间。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种简化的Sanger法基因测序方法，本发明以荧光定量PCR和核酸纯化技术为基础,对Sanger法基因测序技术进行大幅度改进,减少了 sanger法基因测序流程和操作步骤，缩短了基因测序时间。
[0005]为解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
[0006]一种简化的Sanger法基因测序方法，它包括如下步骤:
[0007](I)目的基因荧光定量PCR扩增:采用荧光定量聚合酶连反应，得到目的基因的定量结果和PCR产物；
[0008](2)根据步骤(1)中的定量结果，对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化并对纯化后的产物进行测序PCR反应:在步骤(1)得到的PCR产物中加入核酸外切酶I和碱性磷酸酶的混合液，混合均匀后，再加入封闭液体，然后在封闭液体上加入测序引物、Bigdye和Bigdye buffer,运行PCR程序，得到测序PCR产物；
[0009](3)利用磁珠法对步骤(2)得到的测序PCR产物进行纯化，得到纯化后的测序PCR产物；
[0010](4)将步骤(3)纯化后的测序PCR产物加样至测序仪进行序列分析。
[0011 ] 上述方案中，步骤(1)所述荧光定量PCR扩增中，上游引物5 ’端插入通用M13序列:TGTAAAACGACGGCCAGT，下游引物 5’端插入通用 Ml3 序列 CAGGAAACAGCTATGACC ;步骤(2)所述的测序引物为通用序列:TGTAAAACGACGGCCAGT。
[0012]上述方案中，步骤(2)所述核酸外切酶I和碱性磷酸酶的添加量为:每微升PCR产物中加入IU的核酸外切酶I和0.4U的碱性磷酸酶。
[0013]上述方案中，步骤(2 )所述封闭液体为液体石蜡或其他具有相同属性的化学物质。
[0014]上述方案中，步骤(2)所述PCR测序程序为:37°C 15分钟，80°C 2分钟；96°C I分钟；96°C 10 #,50°C 5 #,60°C 75 秒，40 个循环；4°C 5 分钟。
[0015]上述方案中，步骤(3)所述的磁珠法纯化测序PCR产物的具体过程为:向测序PCR产物中加入氯化钠溶液，再加入异丙醇和磁珠，混匀后，室温下静置3~5分钟，再置于磁力架静置I~3min ;弃废液，然后再加入体积浓度为70%的乙醇，混匀，室温下静置I~3min，再置于磁力架静置I~3分钟；弃废液，将液体吸干后室温下晾干；然后加入双蒸水，混匀，60°C放置3~5min，再置于磁力架静置I~3min ;取上清，然后将上清置于95°C，5min，再放在_20°C，5min,即得到纯化后的测序PCR产物。
[0016]本发明提供了一种简化的Sanger基因测序方法，该方法可以在一个96孔板或者8连管中完成整个基因测序过程，该方法能简化操作步骤，缩短操作时间，并且能够极大的防止污染。
[0017]本发明的有益效果:[0018](I)本发明测序方法操作简单、安全，同时不需要较多昂贵试剂的使用，经济高效；
[0019](2)本发明测序方法能有效缩短操作时间，测序过程可在4~6小时内完成；
[0020](3)本发明的基因测序过程可以在96孔板或8连管中全部完成，不需要转移试管，从而能够有效防止污染。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为传统sanger基因测序流程图。
[0022]图2为本发明简化的sanger基因测序流程图。
[0023]图3为实施例1荧光定量PCR扩增曲线。
[0024]图4为实施例1测序结果峰图。
【具体实施方式】
[0025]为了更好地理解本发明，下面结合附图、实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实例。
[0026]实施例1
[0027]1、引物探针的合成
[0028]对EGFR基因18、19、20和21外显子设计引物和探针，用人工合成的方法合成如下引物和探针:
[0029]EGFR18F:TTGTCTCTGTGTTCTTGTCCC
[0030]EGFR18R:TTCCCAAACACTCAGTGAAAC
[0031 ] EGFR18P:FAM-CCCAGCTTGTGGAGCCTCTTACACCC-BHQl
[0032]EGFR19F:ACATTATCAGGCTTAGGTGCG[0033]EGFR19R:CAGACAGTAGAAAAGGTGGGC
[0034]EGFR19P:FAM-CTCCACAGCCCCAGTGTCCCTCA-BHQ1
[0035]EGFR20F:TCCCTGTGCTAGGTCTTTTG
[0036]EGFR20R:TCCCTTCCCTGATTACCTTT
[0037]EGFR20P:FAM-CGATCTGCACACACCAGTTGAGC-BHQl
[0038]EGFR21F:CTTTCATGCGCCTTTCCAT
[0039]EGFR2IR:GCCACCTCCTTACTTTGCCT
[0040]EGFR21P:FAM-ACGTTCGCCAGCCATAAGTCCTCG-BHQl
[0041]上述引物和探针序列均为5’端至3’端，F表示上游引物，R表示下游引物，P表示探针，FAM表示探针中荧光基团，BHQl表示淬灭基团。所有的上游引物5’端均添加通用序列:TGTAAAACGACGGCCAGT，下游引物 5’ 端均添加通用序列:CAGGAAACAGCTATGACC。
[0042]2、检测样本DNA的荧光定量PCR扩增
[0043](I)提取样本DNA:采用Qiagen公司商品化石蜡DNA提取试剂盒，提取样本DNA的具体步骤如下:
[0044]1.1从石蜡样本切8片左右8~10 μ m厚的石蜡切片，放入1.5ml离心管中；
[0045]1.2加入Iml 二 甲苯，盖上离心管盖，涡旋混匀至蜡明显的溶解，室温，4000rpm，离心2min，用移液器小心弃上 清，注意不要将组织去掉；
[0046]1.3加入Iml无水乙醇，涡旋混匀(乙醇将残留的二甲苯去掉)，14000rpm，离心2min,用移液器小心弃上清，注意不要将组织去掉；
[0047]1.4室温(15~25°C)晾干或37°C金属浴烘干残留的乙醇；
[0048]1.5加入180 μ I ATL (检测是否有沉淀出现，沉淀使用70°C水浴溶解)缓冲液混匀，再加入20 μ I蛋白酶K，涡旋混匀；
[0049]1.656°C水浴Ih以上(最好过夜)，直至样本被完全裂解(中途可以震荡几次)；
[0050]1.790°C水浴Ih (加ATL缓冲液90°C保温，在一定程度上可以修复甲醛对核酸结构的改变，但是保温时间过长或温度过高，会导致DNA断裂。如果只有一个加热器，56°C结束后将样品放在室温，等温度升至90°C后再将样品放入加热器)；
[0051]1.8短暂离心，加入200 μ I的AL缓冲液(检测是否有沉淀出现，沉淀使用70°C水浴溶解)，涡旋混匀；然后加入200 μ I无水乙醇，涡旋混匀(样本、AL缓冲液和乙醇的混匀要迅速，如果同时提取大量样本，可以先将AL缓冲液和乙醇混合，然后一起加入样本混匀)；
[0052]1.9短暂离心，将全部裂解物转移至试剂盒提供的纯化柱中(纯化柱装入2ml的收集管中)，盖上收集管盖，8000rpm离心lmin，将纯化柱放入新的收集管中；
[0053]1.10向纯化柱加入500 μ I AWl缓冲液(检查AWl中是否已经加入乙醇)，盖上收集管盖，8000rpm离心lmin，倒掉收集管中液体，将纯化柱放入收集管中；
[0054]1.11向纯化柱加入500 μ I AW2缓冲液(检查AW2中是否已经加入乙醇)，盖上收集管盖，8000rpm离心lmin，倒掉收集管中液体，将纯化柱放入收集管中；
[0055]1.1214000rpm离心3min，使纯化柱膜完全干燥(可以考虑室温开盖放置2~5分钟以便充分干燥);
[0056]1.13纯化柱放入新的灭菌的1.5ml离心管中(自备)，向纯化柱膜正中加入20~100 μ I ATE或ddH20，室温放置2~5min，14000rpm离心lmin，收集液体即得到石蜡样本DNA, 4°C保存，长期存放放置在_20°C。
[0057](2)利用上述合成的上游引物、下游引物和探针，采用荧光定量PCR扩增样本DNA，得到荧光定量PCR扩增产物，PCR反应体系(5 μ I)为:
【权利要求】
1.一种简化的Sanger法基因测序方法，其特征在于，包括如下步骤: (I)目的基因荧光定量PCR扩增:采用荧光定量聚合酶连反应，得到目的基因的荧光定量结果和PCR产物； (2 )根据步骤(1)中的定量结果，对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化并对纯化后的产物进行测序PCR反应:在步骤(1)得到的PCR产物中加入核酸外切酶I和碱性磷酸酶，混合均匀后，再加入封闭液体，然后在封闭液体上加入测序引物、Bigdye和Bigdye缓冲液,运行PCR程序，得到测序PCR产物； (3)利用磁珠法对步骤(2)得到的测序PCR产物进行纯化，得到纯化后的测序PCR产物； (4)将步骤(3)纯化后的测序PCR产物加样至测序仪进行测序分析。
2.根据权利要求1所述的基因测序方法，其特征在于步骤(2)所述核酸外切酶I和碱性磷酸酶的添加量为:每微升PCR产物中加入IU的核酸外切酶I和0.4U的碱性磷酸酶。
3.根据权利要求1所述的基因测序方法，其特征在于步骤(2)所述 封闭液体为液体石腊。
4.根据权利要求1所述的基因测序方法，其特征在于步骤(2)所述PCR程序为:37°C15分钟，80°C 2分钟；96°C I分钟；96°C 10秒，50°C 5秒，60°C 75秒，40个循环；4°C 5分钟。
5. 根据权利要求1所述的基因测序方法，其特征在于步骤(1)所述荧光定量PCR扩增中，上游引物5’端插入通用M13序列:TGTAAAACGACGGCCAGT，下游引物5’端插入通用M13序列CAGGAAACAGCTATGACC ;步骤(2)所述的测序引物为通用序列:TGTAAAACGACGGCCAGT。
6.根据权利要求1所述的基因测序方法，其特征在于步骤(3)所述的磁珠法纯化测序PCR产物的具体过程为:向测序PCR产物中加入氯化钠溶液，再加入异丙醇和磁珠，混匀后，室温下静置3~5分钟，再置于磁力架静置I~3min ;弃废液，然后再加入体积浓度为70%的乙醇，混匀，室温下静置I~3min，再置于磁力架静置I~3分钟；弃废液，将液体吸干后室温下晾干；然后加入双蒸水，混匀，60°C放置3~5min，再置于磁力架静置I~3min ;取上清，然后将上清置于95°C，5min,再放在_20°C，5min,即得到纯化后的测序PCR产物。
【文档编号】C12Q1/68GK103484552SQ201310469440
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年10月9日 优先权日:2013年10月9日
【发明者】叶伦, 李雪梅, 付金玲, 陈刚 申请人:武汉康录生物技术有限公司