抑制水牛SUV39H1基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抑制水牛SUV39H1基因表达的shRNA，该shRNA为shSUV39H1-259或shSUV39H1-597，它们都包含19nt的siRNA正义链，9nt的loop环，19nt的siRNA反义链和终止信号。该shRNA能高效抑制水牛SUV39H1基因的表达。本发明还公开了上述shRNA的慢病毒表达载体及其构建方法。实验证实，应用本发明的shRNA可有效稳定地抑制水牛SUV39H1基因表达，在基因功能研究和转基因动物制备过程中，可通过抑制SUV39H1基因表达探讨其对外源转目的基因表达效率的影响及其作用机理，为寻找提高转基因动物中外源基因的表达效率提供新的思路和方法。
【专利说明】抑制水牛SUV39H1基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及水牛花斑抑制因子同源物I (SUV39H1)基因，尤其是一种抑制水牛SUV39H1基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002]水牛是我国南方主要大家畜之一，具有耐高温高湿、抗病力强、耐粗饲等生物学特性，非常适合我国南方农村饲养。水牛奶的品质好、营养价值高，其干物质的含量、乳脂率和总蛋白的含量均为普通牛奶的2倍，特别是乳酪蛋白的含量(4.14%)，是黑白花奶牛的16倍(0.26%)，是制造高档奶酪的优质原料。因此，开发利用水牛畜种资源，将现有役用水牛转化为乳用或乳肉兼用的商品水牛，是水牛畜牧产业发展的趋势。然而，水牛的自然繁殖率很低、种群生产性能低下，急需发展和完善一批与家畜遗传改良密切相关的农业高技术来提高水牛繁殖力。利用胚胎生物技术和克隆技术，特别是转基因克隆技术，是培育高繁殖力和闻广奶量水牛新品种的一条有效技术措施。
[0003]转基因动物制备过程中，外源基因的表达水平受到很多因素的影响，其中表观遗传修饰是影响外源基因表达效率的一个重要因素。组蛋白甲基化是组蛋白修饰方式之一，在广泛的表观修饰中，组蛋白甲基化对染色质的结构和功能都具有很重要的作用。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种抑制水牛SUV39H1基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法和应用。
[0005]为解决上述技术问题本发 明采用如下技术方案:抑制水牛SUV39H1基因表达的shRNA,该 shRNA 为 shSUV39Hl_259 或 shSUV39Hl_597，它们都包含 19nt 的 siRNA 正义链，9nt的loop环，19nt的siRNA反义链和终止信号；loop环的碱基序列为TTCAAGAGA ;终止信号的碱基序列为TTTTTTT ；shSUV39Hl-259的正义链具有序列表SEQ.1D.N0.1的碱基序列，其反义链具有序列表SEQ.1D.N0.2的碱基序列；shSUV39Hl-597的正义链具有序列表SEQ.1D.N0.3的碱基序列，其反义链具有序列表SEQ.1D.N0.4的碱基序列。
[0006]上述抑制水牛SUV39H1基因表达的shRNA的慢病毒表达载体，该载体是:
[0007]pSicoR-GFP-shSUV39Hl-259 或 pSicoR-GFP-shSUV39Hl_597。
[0008]上述抑制水牛SUV39H1基因表达的shRNA的慢病毒表达载体的构建方法，慢病毒表达载体由合成的shSUV39Hl-259或shSUV39Hl_597分别克隆入慢病毒表达载体pSicoR-GFP 中而得。
[0009]上述抑制水牛SUV39H1基因表达的shRNA在抑制水牛SUV39H1基因表达方面的应用。
[0010]上述抑制水牛SUV39H1基因表达的ShRNA的慢病毒表达载体在抑制水牛SUV39H1基因表达方面的应用。[0011]上述抑制水牛SUV39H1基因表达的ShRNA在调控转基因细胞中外源基因的表达效率方面的应用。
[0012]上述抑制水牛SUV39H1基因表达的shRNA慢病毒表达载体在调控转基因细胞中外源基因的表达效率方面的应用。
[0013]SUV39H1蛋白是哺乳动物中首个被确认的组蛋白赖氨酸甲基化转移酶，是一种专一作用于组蛋白H3第9位赖氨酸，它特异地结合到组蛋白H3K9mel/2位点，表观遗传修饰中，SUV39H1基因所催化的组蛋白H3第9位赖氨酸残基位点的二甲基化和三甲基化(H3K9me2/3)作用尤为突出并主要催化H3K9的三甲基化，促进异染色质的形成和调苄基因转录，直接影响外源基因表达效率。除参与基因的转录表达外，SUV39H1基因还与DNA甲基化、组蛋白乙酰化等表观修饰有关。因此，有必要为进一步了解SUV39H1在调控外源基因表达机制方面奠定基础，并为研究其在转基因动物中的应用提供参考依据。
[0014]为此，发明人利用分子和细胞生物学技术，首先克隆得到水牛花斑抑制因子同源物I (SUV39H1)编码区，构建了水牛SUV39H1基因融合蛋白表达载体，设计合成了水牛SUV39H1基因shRNA片段并构建其慢病毒表达载体。然后，采用脂质体转染方法将水牛SUV39H1基因融合蛋白表达质粒和其shRNA慢病毒表达载体共转入293T细胞，收集细胞检测水牛SUV39H1基因在293T细胞中的表达，快速筛选获得高效抑制水牛SUV39H1基因的shRNA干扰序列，并尝试其在调控转基因细胞中外源基因的表达效率方面的应用。本发明研究工作包括以下基本步骤:
[0015]<1>水牛SUV39H1基因的克隆、融合表达载体的构建及其检测
[0016]克隆得到水牛SUV39H1基因mRNA的ORF全长序列，经过测序验证序列正确后，将其定向插入pEGFP-Nl载体中，构建水牛SUV39H1基因的融合蛋白表达载体，酶切验证阳性重组质粒PEGFP-N1-SUV39H1。重组质粒经脂质体转染方法导入293T细胞，细胞培养48h后，荧光显微镜下观察细胞绿色荧光表达情况，鉴定其能够在293T细胞中表达。
[0017]<2>shRNA片段设计及其慢病毒表达载体的构建、细胞检测
[0018]针对水牛SUV39H1基因⑶s序列，参照siRNA设计原理，选择2个siRNA序列作为靶位点(259bp-278bp，597bp-617bp)，BLAST比对确认以上序列与其他基因序列无同源性。将其设计为shRNA结构，shRNA结构包含19nt的siRNA正义链，9nt的loop环(TTCAAGAGA)，19nt的siRNA反义链和终止信号(TTTTTTT)，shRNA两端引入酶切位点Xho1、NotI。分别命名为shSUV39Hl-259、shSUV39Hl-597。同时选择一个无关序列shRNA1864(N.C)作为阴性对照。合成shRNA序列并克隆到慢病毒表达载体pSicoR-GFP中，酶切和测序验证。shRNA慢病毒表达载体(pSicoR-GFP-shSUV39Hl-259/597/N.C)经脂质体转染方法导入293T细胞，转染后48h，荧光显微镜下观察细胞水平上各shRNA片段表达情况。
[0019]<3>抑制水牛SUV39H1基因表达shRNA序列的筛选
[0020]采用共转染的方法，将目的基因水牛SUV39H1基因表达载体(靶质粒)与shRNA表达载体(干扰质粒)以1:3质量比经脂质体共转染入293T细胞，转染48h后，荧光显微镜下观察细胞荧光情况。通过实时定量PCR (Real-Time RT-PCR)方法在mRNA水平检测SUV39H1基因的表达，计算各shRNA片段抑制效率。
[0021]通过上述步骤，发明人快速获得了本发明的高效稳定抑制水牛SUV39H1基因表达的 shRNA 序列 shSUV39Hl-259 和 shSUV39Hl_597。实验显示，当靶质粒(pEGFP_Nl_SUV39Hl)与干扰质粒(pSicoR-GFP-shSUV39Hl-259/597/N.C)以 1:3 比例转染时，shSUV39Hl_259 和shSUV39Hl-597 对 SUV39H1 的抑制效率分别为 33.85% 和 78.75%, shSUV39Hl_597 抑制效率高于shSUV39Hl-259。如前所述，结合本发明，在基因功能研究和转基因动物制备过程中，可通过抑制SUV39H1基因表达探讨其对外源转目的基因表达效率的影响及其作用机理，为寻找提闻转基因动物中外源基因的表达效率提供新的思路和方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1是水牛SUV39H1基因融合蛋白表达载体pEGFP_Nl_SUV39Hl的结构示意图。
[0023]图2 是 shRNA 的慢病毒表达载体 pSicoR-GFP-shSUV39Hl_259/597/N.C 的结构示意图。
[0024]图3是靶质粒与干扰质粒(质量比1:3)共转染293T细胞48h后荧光观察结果图，图中:A:pEGFP-Nl-SUV39Hl 质粒和 pSicoR-GFP-1864 质粒，B:pEGFP_Nl_SUV39Hl质粒和 pSicoR-GFP-SUV39HlshRNA259 质粒，C:pEGFP_Nl_SUV39Hl 质粒和pSicoR-GFP-SUV39HlshRNA597 质粒，D:pEGFP_Nl_SUV39Hl 质粒，E:无质粒对照。
[0025]图4是靶质粒与干扰质粒(质量比1:3)共转染293T细胞实时荧光定量PCR检测图(48h)，图中:SUV39H1 是 SUV39H1 靶质粒，1864 是对照 1864shRNA，shRNA I 是shSUV39Hl-259, shRNA2 是 shSUV39Hl_597，其中不同上标的值差异显著 a，b, c (P〈0.05)。
[0026]图5是祀质粒与干扰质粒(质量比1:3)共转染293T细胞Western_blot检测图(72h)，图中:A图以P-actin抗体，B图以SUV39H1抗体，I:SUV39H1靶质粒，2:对照shRNA1864, 3:shSUV39Hl-259,4:shSUV39Hl_597。
[0027]图6是SUV39H1基因shRNA 病毒感染转IFN a -2b基因Bcap-37细胞系样品SUV39H1基因qRT-PCR检测结果图，图中不同上标的值差异显著a，b, c,d(P<0.05)
[0028]图7是SUV39H1基因shRNA病毒感染转IFNa -2b基因Bcap-37细胞系样品外源IFNa -2b基因qRT-PCR检测结果图，图中不同上标的值差异显著a，b, c,d(P<0.05)
【具体实施方式】
[0029]一、相关表达载体的构建
[0030]1.水牛SUV39H1基因表达载体的构建
[0031]根据NCBIGenBank公布的牛 SUV39H1 基因mRNA[NM_001046264.2]序列设计引物，并在上下游引物的5，端分别引入Xho1、EcoRI酶切位点，引物为:
[0032]SUV39H1-上游 5’ -CTCGAGGGAAAGATGGCGGAAAAT-3’(序列表 SEQ.1D.N0.7)，
[0033]SUV39H1-下游 5’ -GAATTCCCGAAGAGGTATTTGCGGCAG-3’(序列表 SEQ.1D.N0.8)。
[0034]从屠宰场取水牛新鲜卵巢组织，放入预先加有Iml RNA保护剂的2ml EP管中。用Trizol裂解法提取总的RNA，反转录为cDNA。以水牛卵巢cDNA为模板，扩增得到水牛SUV39H1基因的ORF全长序列(序列表SEQ.1D.N0.9)，长度约为IlOObp,将PCR产物回收后插入PMD18-T载体，命名为pMD18-T-SUV39Hl，用EcoRI和XhoI酶切鉴定，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳可看到长度分别为2.8Kb和1.1Kb的条带，证明已插入，将重组质粒PMD18-T-SUV39H1送上海生工测序，测得序列长度为1128bp。测序结果经Blast比对，与NCBI中黄牛SUV39H1基因同源性为99%。[0035]用XhoI和EcoRI双酶切pMD18_T_SUV39Hl，胶回收IlOObp的片段。用同样的酶线性化pEGFP-Nl载体。将SUV39H1基因片段定向插入载体pEGFP-Nl中，重组质粒用XhoI和EcoRI进行酶切鉴定正确。水牛SUV39H1融合蛋白表达载体pEGFP_Nl_SUV39Hl结构如图1所示。
[0036]2.shRNA慢病毒表达载体的构建
[0037]采用siRNA设计软件，针对SUV39H1基因ORF序列，选择2个不同的靶位点作为靶序列(259bp-278bp，597bp-617bp)，并将其设计为包含19nt的siRNA正义链、9nt的loop环(TTCAAGAGA)和19nt的siRNA反义链的shRNA结构，分别命名为shSUV39Hl_259和shSUV39Hl-597 ;同时选择一个无关序列shRNA_1864 (N.C)作为阴性对照(见表1)。合成2条shRNA序列和I条阴性对照序列，并克隆入慢病毒表达载体pSicoR-GFP中，测序验证，并用XhoI和NotI双酶切验证。构建的shRNA表达载体结构如图2所示。
[0038]表1shRNA序列结构
[0039]
【权利要求】
1.一种抑制水牛SUV39H1基因表达的shRNA，其特征在于:该shRNA为shSUV39Hl_259或shSUV39Hl-597，它们都包含19nt的siRNA正义链，9nt的loop环，19nt的siRNA反义链和终止信号； 所述loop环的碱基序列为TTCAAGAGA ； 所述终止信号的碱基序列为TTTTTTT ； 所述shSUV39Hl-259的正义链具有序列表SEQ.1D.N0.1的碱基序列，其反义链具有序列表SEQ.1D.N0.2的喊基序列； 所述shSUV39Hl-597的正义链具有序列表SEQ.1D.N0.3的碱基序列，其反义链具有序列表SEQ.1D.N0.4的喊基序列。
2.根据权利要求1所述抑制水牛SUV39H1基因表达的shRNA的慢病毒表达载体，其特征在于该载体是:
pSicoR-GFP-shSUV39Hl-259 或 pSicoR-GFP-shSUV39Hl_597。
3.根据权利要求2所述抑制水牛SUV39H1基因表达的shRNA的慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于:所述慢病毒表达载体由合成的所述shSUV39Hl-259或shSUV39Hl_597分别克隆入慢病毒表达载体PSicoR-GFP中而得。
4.根据权利要求1所述抑制水牛SUV39H1基因表达的shRNA在抑制水牛SUV39H1基因表达方面的应用。
5.根据权利要求2所述抑制水牛SUV39H1基因表达的shRNA的慢病毒表达载体在抑制水牛SUV39H1基因表达方面的应用。
6.根据权利要求1所述抑制水牛SUV39H1基因表达的shRNA在调控转基因细胞中外源基因的表达效率方面的应用。
7.根据权利要求2所述抑制水牛SUV39H1基因表达的shRNA慢病毒表达载体在调控转基因细胞中外源基因的表达效率方面的应用。
【文档编号】C12N15/867GK103497953SQ201310469472
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年10月10日 优先权日:2013年10月10日
【发明者】李湘萍, 石德顺, 林浪 申请人:广西大学