黄蘑菇标准化组分制法及其在肺癌治疗中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种黄蘑菇标准化组分制法，该方法包括以下步骤：⑴将黄蘑菇干燥粉碎后进行水提并离心收集菌渣，该菌渣用丙酮提取并离心收集滤液；滤液经减压浓缩至膏状，即得丙酮提取物；⑵丙酮提取物用正己烷-乙酸乙酯混合液溶解后过滤，得到含丙酮提取物的样品溶液；含丙酮提取物的样品溶液在制备色谱上分离，即得Fr1、Fr2、……、Fr13、Fr14共14个标准化组分样品；⑶将14个标准化组分样品采用iCelligence实时无标记细胞分析仪进行体外抗肺癌细胞模型筛选，从而确定第7、第8以及第14号标准化组分具有体外抑制人肺癌细胞贴壁及增殖活性。本发明不但工艺简单，而且易于实施。同时，本发明所得的活性组分可应用于肺癌治疗中。
【专利说明】黄蘑菇标准化组分制法及其在肺癌治疗中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物化学及生物医药【技术领域】，尤其涉及黄蘑菇标准化组分制法及其在肺癌治疗中的应用。
【背景技术】
[0002]肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤，也是当今世界最常见的恶性肿瘤之一。据世界卫生组织/国际癌症研究中心统计，肺癌约占全部恶性肿瘤的19%，位于各种恶性肿瘤死亡率之首，全世界每年新增肺癌病例超过120万，且以3%左右的速率增加，肺癌对人类生存和健康构成了极大的威胁。目前对肺癌早期诊断方法、靶向给药系统及抗癌中药的研究已成为全球关注的焦点。
[0003]天然药物对于肺癌等疑难病症的治疗有着悠久的历史，天然药物中的活性成分可通过多种途径、多个靶点发挥其生物学医疗保健作用。特别是真菌来源的提取物及活性化合物，如灵芝多糖、茯苓多糖、虫草多糖，长春新碱，紫杉醇等已广泛应用并作为一线用药，在肺癌及其它疾病的治疗中发挥了不可替代的作用。食药用真菌种类丰富，代谢途径复杂多样，代谢产物结构类型繁多，加之其经过诱变育种、易于发酵产业化等优点，世界医药行业将其代谢产物作为筛选具有生物活性药物的重要来源和发现新型抗肺癌药物的主要目标之一 O
[0004]黄蘑菇是生长于青藏高原的珍稀野生食药用菌。目前有限的定性研究表明，黄绿蜜环菌子实体中含有较丰富的蛋 白质、氨基酸、糖类、生物碱和少量有机酸、黄酮、强心苷、甾体三萜类、苷类、皂苷、挥发油、香豆素萜类、鞣质、酚类化合物等，该类化合物具有抗流感、防治神经炎、脚气病、促进儿童发育、抗氧化及抗肿瘤等生物活性。
[0005]制备液相色谱是用大直径柱分离纯化稳定、均一组分的技术。随着天然药物现代化的迅速发展，制备液相色谱作为一种快速高效的分离技术受到天然产物化学、药物合成化学等研究领域的重视。很多样品组分只能用制备液相色谱技术进行分离，正相制备型高效液相色谱作为制备色谱中应用较多的分离质量均一、稳定、可靠组分的方法之一，成为目前一种必不可少的分离纯化手段，应用越来越广泛。
[0006]中国专利申请CN 200910154901.5《生物催化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法》涉及了黄绿蜜环菌生物转化合成白桦脂酸；中国专利申请CN200710069803.2《一种黄绿蜜环菌纤溶酶及其生产方法》涉及了黄绿蜜环菌代谢合成纤溶酶；中国专利申请CN200710066667.1《一种微生物细胞生物转化对羟基苯甲醇合成天麻素的方法》涉及了黄绿蜜环菌通过生物转化合成天麻素；中国专利申请CN200610155189.7《一种黄绿蜜环菌及其培养方法与应用》、在审专利《一种抗癌的黄绿蜜环菌多糖及提取工艺》、《一种黄绿蜜环菌的深层发酵及其应用》主要涉及黄绿蜜环菌菌丝体培养及多糖提取工艺。并未涉及黄蘑菇化学成分。上述文献关于黄蘑菇的研究，主要集中在生物转化上，对黄蘑菇化学成分的研究很少。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺简单、易于实施的黄蘑菇标准化组分制法。
[0008]本发明所要解决的另一个技术问题是提供该黄蘑菇标准化组分制法所得的活性组分在肺癌治疗中的应用。
[0009]为解决上述问题，本发明所述的黄蘑菇标准化组分制法，包括以下步骤:
⑴将黄蘑菇经干燥粉碎后，按Ig:4mL^20 mL的料液比用分析纯水在4(T90°C提取3次，每次flOh，并离心收集菌渣，该菌渣用丙酮按Ig:lmL^20 mL的料液比在1(T80°C提取3次，每次5~72h，并离心收集滤液；所述滤液经减压浓缩至膏状，即得丙酮提取物；
⑵所述丙酮提取物中加入其体积的1飞倍正己烷-乙酸乙酯混合液进行溶解，溶解后过0.45 μ m的有机滤膜，得到含丙酮提取物的样品溶液；所述含丙酮提取物的样品溶液在以10 μ m硅胶为分离基质的制备色谱上分离，即得Frl、Fr2、……、Frl3、Frl4共14个标准化组分样品；
⑶将所述14个标准化组分样品采用iCelligence实时无标记细胞分析仪按下述步骤进行体外抗肺癌细胞模型筛选:
①确认iCelligence测试系统正确连接，37°C、5%C02培养箱工作正常；
②8孔细胞板内按150μ L/孔加入培养基，室温放置15分钟后置于iCelligence测试台上测基线；所述培养基是指含10%胎牛血清的F-12k培养基；
③将所述14个标准化组分样品中的每个组分样品用DMSO配制成浓度为5mg/mL的样品溶液；
④将对数生长期的人肺癌细胞A549，用胰酶按常规方法消化后，以950rpm的速率离心5min，将细胞重悬于所述培养基中，并将细胞浓度调至2.85 X IO4个/mL，得到对数生长期的人肺癌细胞A549悬液，并按345 μ L/孔、每孔10000个细胞的量将所述对数生长期的人肺癌细胞Α549悬液接种入所述8孔细胞板的相应孔中，室温放置30 min ；
⑤将所述14个标准化组分样品分两批按每孔加5μ L所述浓度为5mg/mL的样品溶液、每孔加345 μ L所述对数生长期的人肺癌细胞Α549悬液的量接种入所述8孔细胞板的相应孔中，并置于所述iCelligence测试台，放入所述培养箱中开始检测；45 h后得到两张黄蘑菇抗肺癌标准化组分的活性检测图；其中纵坐标为细胞指数(cell index),横坐标为实时细胞增殖动态效应(RTCA)；
⑥根据所述两张黄蘑菇抗肺癌标准化组分的活性检测图，当细胞增殖曲线呈现上升平缓或不上升的趋势，则说明细胞分裂减缓或停止，即细胞不能进行正常的分裂，从而确定第7、第8以及第14号标准化组分具有体外抑制人肺癌细胞贴壁及增殖活性。
[0010]所述步骤⑴中减压浓缩的条件是指真空度为0.03、.1 MPa，温度为3(T80 °C。
[0011]所述步骤⑵中正己烷-乙酸乙酯混合液是指正己烷与乙酸乙酯按I mL:0.1 mL~10 mL的比例混合的溶液。
[0012]所述步骤⑵中制备色谱分离的条件是指色谱柱尺寸为260X50 mm;采用A为正己烷、B为乙酸乙酯的二元流动相体系进行分离:0~15 min, 100%A~100%A ; 15~35 min,60%A~60%A ;35~50 min，0%A~0%A ;检测波长为260 nm ;上样量为1.0 g。
[0013]如上所述的黄蘑菇标准化组分制法所得的活性组分在肺癌治疗中的应用，其特征在于:该活性组分作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂。
[0014]本发明与现有技术相比具有以下优点:
1、本发明采用溶剂提取、离心、工业制备色谱等常规方法，从黄蘑菇中分离得到了具有抗肺癌活性的标准化组分(参见图1、图2)，不但工艺简单，而且易于实施。
[0015]2、本发明利用iCELLigence系统检测，可实时动态检测细胞贴壁和增殖过程，提供高信息量的细胞效应图谱，提供大量、重要的动态反应信息；无标记、无创伤的电子检测不会干扰细胞生长和分析；可高准确/精确度的定量衡量细胞生长，提供高于2个数量级的动态范围；整个实验过程自动收集数据，实时分析，大大改善仅仅在最终点分析的结果；在培养孔中检测细胞质量，达到了活细胞品质控制的目的(参见图3、图4)。
[0016]3、本发明以细胞生长曲线为基本指标判定标准化组分对贴壁、繁殖等细胞生理活性的影响，结果直观、易判断；所得的活性组分可用于研发制备抗肺癌治疗药物。
[0017]4、本发明拓展了抗肺癌药物的原料来源，扩大了黄蘑菇的用途，使黄蘑菇成为抗肺癌药物的有效组分原料，显著提高黄蘑菇的附加值。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0019]图1为本发明黄蘑菇标准化组分的色谱分离图A。
[0020]图2为本发明黄蘑菇标准化组分的色谱分离图B。
[0021]图3为本发明黄蘑菇标准化组分的抗肺癌活性检测图A。
[0022]图4为本发明黄蘑菇标准化组分的抗肺癌活性检测图B。
【具体实施方式】
[0023]实施例1 黄蘑菇标准化组分制法，包括以下步骤:
⑴将黄蘑菇经干燥粉碎后，按Ig:4mL的料液比用分析纯水在40°C提取3次，每次10h，并离心收集菌渣，该菌渣用丙酮按Ig: ImL的料液比在10°C提取3次，每次72h，并离心收集滤液；滤液在真空度为0.03 MPa、温度为30°C的条件下经减压浓缩至膏状，即得丙酮提取物。
[0024]⑵丙酮提取物中加入其体积的I倍正己烷-乙酸乙酯混合液进行溶解，溶解后过0.45 μ m的有机滤膜，得到含丙酮提取物的样品溶液；含丙酮提取物的样品溶液在以10 μ m硅胶为分离基质的制备色谱上分离，即得Frl、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6、Fr7、Fr8、Fr9、Frl0、Fr 11、Fr 12、Fr 13、Fr 14共14个标准化组分样品。
[0025]其中:
制备色谱分离的条件是指色谱柱尺寸为260X50 mm;采用A为正己烷、B为乙酸乙酯的二元流动相体系进行分离:0~15 min，100%A~100%A ;15~35 min，60%A~60%A ;35~50 min,0%Α、%Α ;检测波长为260 nm ;上样量为1.0 g。正己烷-乙酸乙酯混合液是指正己烷与乙酸乙酯按I mL:0.1 mL的比例混合的溶液。
[0026]⑶将14个标准化组分样品采用iCelligence实时无标记细胞分析仪按下述步骤进行体外抗肺癌细胞模型筛选:①确认iCelligence测试系统正确连接，37°C、5%C02培养箱工作正常。[0027]②8孔细胞板内按150 μ L/孔加入培养基，室温放置15分钟后置于iCelligence测试台上测基线。
[0028]其中:培养基是指含10%胎牛血清的F_12k培养基。
[0029]③将14个标准化组分样品中的每个组分样品用DMSO配制成浓度为5mg/mL的样品溶液(即每mLDMSO中含有5 mg组分样品)。
[0030]④将对数生长期的人肺癌细胞A549，用胰酶按常规方法消化后，以950rpm的速率离心5min，将细胞重悬于培养基中，并将细胞浓度调至2.85 X IO4个/mL，得到对数生长期的人肺癌细胞A549悬液，并按345 μ L/孔、每孔10000个细胞的量将对数生长期的人肺癌细胞Α549悬液接种入8孔细胞板的相应孔中，室温放置30 min。
[0031]⑤将14个标准化组分样品分两批按每孔加5 μ L浓度为5mg/mL的样品溶液、每孔加345 μ L对数生长期的人肺癌细胞Α549悬液的量接种入8孔细胞板的相应孔中，并置于iCelligence测试台，放入培养箱中开始检测；45 h后得到两张黄蘑菇抗肺癌标准化组分的活性检测图；其中纵坐标为细胞指数(cell index)，横坐标为实时细胞增殖动态效应(RTCA)0
[0032]⑥根据两张黄蘑菇抗肺癌标准化组分的活性检测图，当细胞增殖曲线呈现上升平缓或不上升的趋势，则说明细胞分裂减缓或停止，即细胞不能进行正常的分裂，从而确定第7、第8以及第14号标准化组分具有体外抑制人肺癌细胞贴壁及增殖活性。
[0033]实施例2 黄蘑菇标准化组分制法，包括以下步骤:
⑴将黄蘑菇经干燥粉碎后，按Ig:20 mL的料液比用分析纯水在90°C提取3次，每次Ih,并离心收集菌渣，该菌渣用丙酮按Ig:20 mL的料液比在80°C提取3次，每次5h，并离心收集滤液；滤液在真空度为0.1 MPa、温度为80°C的条件下经减压浓缩至膏状，即得丙酮提取物。
[0034]⑵丙酮提取物中加入其体积的6倍正己烷-乙酸乙酯混合液进行溶解，溶解后过
0.45 μ m的有机滤膜，得到含丙酮提取物的样品溶液；含丙酮提取物的样品溶液在以ΙΟμπι硅胶为分离基质的制备色谱上分离，即得Frl、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6、Fr7、Fr8、Fr9、Frl0、Fr 11、Fr 12、Fr 13、Fr 14共14个标准化组分样品。
[0035]其中:
制备色谱分离的条件同实施例1。正己烷-乙酸乙酯混合液是指正己烷与乙酸乙酯按I mL: 10 mL的比例混合的溶液。
[0036]⑶将14个标准化组分样品采用iCelligence实时无标记细胞分析仪按实施例1所述步骤进行体外抗肺癌细胞模型筛选，确定第7、第8以及第14号标准化组分具有体外抑制人肺癌细胞贴壁及增殖活性。
[0037]实施例3 黄蘑菇标准化组分制法，包括以下步骤:
将黄蘑菇经干燥粉碎后，按Ig:12 mL的料液比用分析纯水在65°C提取3次，每次5.5h，并离心收集菌渣，该菌渣用丙酮按Ig: IOmL的料液比在45°C提取3次，每次38h，并离心收集滤液；滤液在真空度为0.06 MPa、温度为55°C的条件下经减压浓缩至膏状，即得丙酮提取物。
[0038]⑵丙酮提取物中加入其体积的3.5倍正己烷-乙酸乙酯混合液进行溶解，溶解后过0.45 μ m的有机滤膜，得到含丙酮提取物的样品溶液；含丙酮提取物的样品溶液在以10 μ m硅胶为分离基质的制备色谱上分离，即得Frl、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6、Fr7、Fr8、Fr9、Fr IO、Fr 11、Fr 12、Fr 13、Fr 14共14个标准化组分样品。
[0039]其中:
制备色谱分离的条件同实施例1。正己烷-乙酸乙酯混合液是指正己烷与乙酸乙酯按I mL:5 mL的比例混合的溶液。
[0040]⑶将14个标准化组分样品采用iCelligence实时无标记细胞分析仪按实施例1所述步骤进行体外抗肺癌细胞模型筛选，确定第7、第8以及第14号标准化组分具有体外抑制人肺癌细胞贴壁及 增殖活性。
[0041]上述实施例f 3中黄蘑菇标准化组分制法所得的活性组分作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂应用于肺癌治疗中。
【权利要求】
1.黄蘑菇标准化组分制法，包括以下步骤: ⑴将黄蘑菇经干燥粉碎后，按1g:4mL-20 mL的料液比用分析纯水在4(T90°C提取3次，每次flOh，并离心收集菌渣，该菌渣用丙酮按Ig:lmL^20 mL的料液比在1(T80°C提取3次，每次5~72h，并离心收集滤液；所述滤液经减压浓缩至膏状，即得丙酮提取物； ⑵所述丙酮提取物中加入其体积的1飞倍正己烷-乙酸乙酯混合液进行溶解，溶解后过0.45 μ m的有机滤膜，得到含丙酮提取物的样品溶液；所述含丙酮提取物的样品溶液在以10 μ m硅胶为分离基质的制备色谱上分离，即得Frl、Fr2、……、Frl3、Frl4共14个标准化组分样品； ⑶将所述14个标准化组分样品采用iCelligence实时无标记细胞分析仪按下述步骤进行体外抗肺癌细胞模型筛选: ①确认iCelligence测试系统正确连接，37°C、5%C02培养箱工作正常； ②8孔细胞板内按150μ L/孔加入培养基，室温放置15分钟后置于iCelligence测试台上测基线；所述培养基是指含10%胎牛血清的F-12k培养基； ③将所述14个标准化组分样品中的每个组分样品用DMSO配制成浓度为5mg/mL的样品溶液； ④将对数生长期的人肺癌细胞A549，用胰酶按常规方法消化后，以950rpm的速率离心5min，将细胞重悬于所述培养基中，并将细胞浓度调至2.85 X IO4个/mL，得到对数生长期的人肺癌细胞A549悬液，并按345 μ L/孔、每孔10000个细胞的量将所述对数生长期的人肺癌细胞Α549悬液接种入所述8孔细胞板的相应孔中，室温放置30 min ； ⑤将所述14个标准化组分样品分两批按每孔加5μ L所述浓度为5mg/mL的样品溶液、每孔加345 μ L所述对数生长期的人肺癌细胞Α549悬液的量接种入所述8孔细胞板的相应孔中，并置于所述iCelligence测试台，放入所述培养箱中开始检测；45 h后得到两张黄蘑菇抗肺癌标准化组分的活性检测图；其中纵坐标为细胞指数，横坐标为实时细胞增殖动态效应； ⑥根据所述两张黄蘑菇抗肺癌标准化组分的活性检测图，当细胞增殖曲线呈现上升平缓或不上升的趋势，则说明细胞分裂减缓或停止，即细胞不能进行正常的分裂，从而确定第7、第8以及第14号标准化组分具有体外抑制人肺癌细胞贴壁及增殖活性。
2.如权利要求1所述的黄蘑菇标准化组分制法，其特征在于:所述步骤⑴中减压浓缩的条件是指真空度为0.03~0.1 MPa，温度为30~80 °C。
3.如权利要求1所述的黄蘑菇标准化组分制法，其特征在于:所述步骤⑵中正己烷-乙酸乙酯混合液是指正己烷与乙酸乙酯按I mL:0.1 mL~10 mL的比例混合的溶液。
4.如权利要求1所述的黄蘑菇标准化组分制法，其特征在于:所述步骤⑵中制备色谱分离的条件是指色谱柱尺寸为260X50 mm;采用A为正己烷、B为乙酸乙酯的二元流动相体系进行分离:0~15 min，100%A~100%A ;15~35 min，60%A~60%A ;35~50 min，0%A~0%A ;检测波长为260 nm ;上样量为1.0 g。
5.如权利要求1所述的黄蘑菇标准化组分制法所得的活性组分在肺癌治疗中的应用，其特征在于:该活性组分作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂。
【文档编号】C12Q1/02GK103494843SQ201310469542
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年10月10日 优先权日:2013年10月10日
【发明者】王启兰, 党军, 陶燕铎, 梅丽娟, 史强强, 顾朋嫒, 马琳, 李园园 申请人:中国科学院西北高原生物研究所