一种耐高温中性蛋白酶HuPro及其基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种具有耐高温中性蛋白酶HuPro及其基因和应用。本发明提供了一种来源于Humicola?sp.P8的中性蛋白酶HuPro，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，且本发明提供了编码上述中性蛋白酶的编码基因hupro。本发明的中性蛋白酶具有以下性质：最适pH8.0，在中性和碱性范围内依然保持较高酶活，最适温度65℃，良好的pH和热稳定性，并且具有广泛的底物特异性。
【专利说明】—种耐高温中性蛋白酶HuPro及其基因和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐高温中性蛋白酶HuPiX)及其基因和应用。
【背景技术】
[0002]蛋白酶是一类催化多肽或蛋白质水解的酶的统称。按水解底物的部位可分为内肽酶和外肽酶，前者水解蛋白质中间部分的肽键，后者则自蛋白质的氨基或羧基末端逐步降
解氨基酸残基。
[0003]中性蛋白酶有着广泛的应用，例如:造纸，酿造，纺织，饲料等领域。但是，不同的工业应用，对蛋白酶的性质的需求是不同的，如:饲料工业需要嗜酸的蛋白酶，能源、纺织工业需要中碱性的中性蛋白酶。目前工业应用的中性蛋白酶,主要来自Trichoderma和Penicillium spp.,这些酶的最适pH在5.0左右,最适温度在50-60度之间，而中性、热稳定性好的酶则有更好的优势:耐热可以提高反应速率，降低底物的粘度，同时还可以抑制其他微生物的生长。
[0004]本发明的中性蛋白酶具有以下性质:最适pH8.0，在pH5.0~10.0范围内具有50%以上的酶活力，最适温度65°C，良好的热稳定性，在65°C处理I个小时酶活几乎没有损失，并且具有很高耐蛋白质变性剂和有机溶剂等特性。热稳定性优良并在中性和碱性范围内具有较高酶活力的特性使其在洗涤、纺织、食品工业应用上具有很大的潜力。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种能高效应用的耐热中性蛋白酶。
[0006]本发明的再一目的是提供编码上述耐热中性蛋白酶的基因。
[0007]本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
[0008]本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
[0009]本发明的另一目的是提供一种制备上述耐热中性蛋白酶的基因工程方法。
[0010]本发明的另一目的提供上述耐热中性蛋白酶的应用。
[0011]本发明从腐质霉(Humicola sp.L8)中分离得到一种新的耐高温中性蛋白酶HuPro ο
[0012]本发明提供了一种中性蛋白酶HuPro，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0013]SEQ ID N0.1:
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[0021]其中，该酶包括535个氨基酸和一个终止密码子，N-端15个氨基酸为信号肽，因此，成熟的中性蛋白酶HuPro的理论分子量为56.3kDa[0022]因此，成熟的中性蛋白酶HuPro的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示
[0023]aprasvdtihsdaapi Isssnaeivpnsyiikfkkhvnddkvqahhawiqeihsdreaqradlrkrglvddvfrglkhtykigs
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[0030]本发明的HuPix)同时具有好的热稳定性，常温下，在中性和碱性的范围内均具有高活性。本发明的中性蛋白酶，其最适pH值为8.0，在pH5.0~10.0的范围内维持50%以上的酶活性；最适温度为65°C，在65°C和70°C具有良好的热稳定性。
[0031]本发明提供了编码上述耐热中性蛋白酶的基因hupro。具体地，该基因的序列如SEQ ID N0.2 所示:
[0032]atgagaggccttttcgctctctctctcgcggcctgcgtcgctgctgcgccgcgcgccagcgtcgacaccatccacagtgatgccg
[0033]ctcccattctctcatcttctaacgccgagattgtccccaactcgtacatcatcaagttcaagaagcatgtcaacgacgacaaggttca
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[0050]ccaaggccaaggagttctccaagaagatccacgagctcgtcgatgaggagctcaaggacttcttggagcaggtcactgcctaa
[0051]成熟中性蛋白酶HuPio编码基因序列如SEQ ID N0.4所示
[0052]gcgccgcgcgccagcgtcgacaccatccacagtgatgccgctcccattctctcatcttctaacgccgagattgtccccaactcgta
[0053]catcatcaagttcaagaagcatgtcaacgacgacaaggttcaggcccaccatgcttggatccaggagattcattcggaccgtgag
[0054]gcgcagcgcgccgacctccggaagcgtggcctggttgacgacgtcttccgcggcttgaagcacacctacaagatcggctccga
[0055]cttcatcggctactcgggccactttgatgacgaggtcatcgagaaggtccggaggcacccagatgttgagtacattgagcgcgac
[0056]agcgtcgtccataccatgcgctacgttgaggaggagagcaagtgcgacggtgacgttgagaaggctgccCCttggggtctggcc
[0057]cgtatctcgcaccgggaacgcctcggcttctccaccttcaataagtacctctacgcctctgagggtggt
【权利要求】
1.一种耐高温中性蛋白酶HuPro，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1或SEQ IDN0.3所示。
2.一种耐高温中性蛋白酶基因hupro，其特征在于，编码权利要求1所述的耐高温中性蛋白酶HuPro。
3.如权利要求2所述的耐高温中性蛋白酶基因hupro，其特征在于，其碱基序列如SEQID N0.2 或 SEQ ID N0.4 所示。
4.包含权利要求2所述耐高温中性蛋白酶基因hupro的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为载体pPIC-hupix)
6.包含权利要求2所述耐高温中性蛋白酶基因hupro的重组菌株。
7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，
8.一种制备权利要求1所述耐高温中性蛋白酶HuPix)的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 2)培养重组菌株，诱导重组中性蛋白酶表达； 3)回收并纯化所表达的中性蛋白酶HuPro。
9.权利要求1所述耐高温中性蛋白酶`HuPro的应用。
【文档编号】C12N9/58GK103497943SQ201310478921
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月22日 优先权日:2013年9月22日
【发明者】詹志春, 张菁 申请人:武汉新华扬生物股份有限公司