一种用于抑制内皮细胞分化的蟾皮钙调素结合蛋白edf-1编码基因的克隆方法
【专利摘要】一种用于抑制内皮细胞分化的蟾皮钙调素结合蛋白EDF-1编码基因的克隆方法，属于生物医药【技术领域】。以从蟾蜍的皮肤第一链cDNA为模板实施PCR，将获得的PCR产物与转化至E.coli感受态细胞，通过筛选阳性的菌落，质粒回收及酶切，获得能用于抑制内皮细胞分化的蟾皮钙调素结合蛋白EDF-1编码基因，其工艺简便，原料充足，获得的编码基因性能稳定。
【专利说明】—种用于抑制内皮细胞分化的蟾皮钙调素结合蛋白EDF-1编码基因的克隆方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药【技术领域】，具体为一种用于抑制内皮细胞分化的蟾皮钙调素结合蛋白EDF-1编码基因的克隆方法。
【背景技术】
[0002]蟾蜍基原的我国传统中药材蟾酥、蟾皮和蟾衣等具有消炎、止痛、抗肿瘤等作用。近年的试验及临床研究表明，它们可诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞分化以及抑制肿瘤血管 形成等作用。外用蟾酥在治疗体表肿瘤及癌症中也具有良好的疗效。现代医学研究还表明，蟾皮的药理活性强，在抗肿瘤及治疗心血管疾病方面具有重要作用。
[0003]近几年来，发明人从事蟾蜍皮肤多肽类有效成分的研究，以日本蟾蜍(Bufojaponicus formosus)皮肤 cDNA 质粒文库为模板，通过菌落 PCR (polymerase chainreaction)筛选具有完整开放阅读框(open reading frame, 0RF)的cDNA。同时，为拓展中华大蟾蜍(B.gargarizans)的药用价值及后续研究中的取材方便，合成中华大蟾蜍背部皮肤第一链cDNA，进行其相关基因的克隆。内皮分化相关因子-1 (EndothelialDifferentiation-related Factor-1, EDF-1)是一种钙调素(calmodulin, CaM)结合蛋白，参与抑制内皮细胞的分化的过程。血管生成是指从现有血管形成新的毛细血管的过程，在生理和病理条件下均会发生。而这个复杂的过程需要内皮细胞的迁移和增殖，并分化成管状结构。所以，从某种角度看，EDF-1参与肿瘤发育和演进过程，并起到抑制作用。
【发明内容】
[0004]针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种用于抑制内皮细胞分化的蟾皮钙调素结合蛋白EDF-1编码基因的克隆方法的技术方案，其性能稳定、方法简单快捷，获得的EDF-1含量高。
[0005]所述的一种用于抑制内皮细胞分化的蟾皮钙调素结合蛋白EDF-1编码基因的克隆方法，其特征在于包括以下步骤:
I)将蟾蜍清洗处死，取其背部皮肤剪成小块后投入液氮中速冻9-15h，置于_70°C超低温冰箱保存备用；
2)称取步骤I)中一小块蟾蜍背部皮肤，按RNA提取试剂盒说明提取其总RNA，用Quantscript RT kit合成其皮肤第一链cDNA,备用；
3)根据蟾蜍其他两栖类EDF-lcDNA序列设计上、下游引物，取步骤2)中第一链cDNA 0.8-1.5 μ L，加灭菌超纯水至18-22 μ L，加入与第一链cDNA等量的上、下游引物，在50-98°C循环实施PCR60-80min ;反应结束后，取一部分PCR产物与pUCm-T连接，转化至E.coli感受态细胞DH5，然后取2-5mL转化液均匀涂布于LB琼脂盘上，并在37°C恒温培养14-18h，挑取白色菌落接种于10-15mL LB培养基中，实施菌落PCR，将通过菌落PCR确定为阳性的菌落0.2-05mL接种于2-4mL含100mg/mL氨苄青霉素-的LB培养液中，再次37°C恒温振荡培养14_18h，然后使用试剂盒进行质粒回收并对其进行EcoR I和Xho I双酶切，SP可。
[0006]所述的一种用于抑制内皮细胞分化的蟾皮钙调素结合蛋白EDF-1编码基因的克隆方法，其特征在于蟾蜍皮肤液氮中速冻时间为10-14h，优选为ll-13h。
[0007]所述的一种用于抑制内皮细胞分化的蟾皮钙调素结合蛋白EDF-1编码基因的克隆方法，其特征在于PCR的温度为60-90°C，优选65-80°C ；PCR的时间为65_75min，优选68-72min。
[0008]所述的一种用于抑制内皮细胞分化的蟾皮钙调素结合蛋白EDF-1编码基因的克隆方法，其特征在于转化液均匀涂布于LB琼脂盘上后在37°C恒温培养15-16h。
[0009]所述的一种用于抑制内皮细胞分化的蟾皮钙调素结合蛋白EDF-1编码基因的克隆方法，其特征在于菌落振荡培养时间为15_16h。
[0010]上述一种用于抑制内皮细胞分化的蟾皮钙调素结合蛋白EDF-1编码基因的克隆方法，以从蟾蜍的皮肤第一链cDNA为模板实施PCR，将获得的PCR产物与转化至E.coli感受态细胞，通过筛选阳性的菌落，质粒回收及酶切，获得能用于抑制内皮细胞分化的蟾皮钙调素结合蛋白EDF-1编码基因，其工艺简便，原料充足，获得的编码基因性能稳定。
[0011]本申请文件中涉及的百分含量除另有说明外，其它的均为纯物质的重量百分含量。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为中华大蟾蜍及F-7 ORF的克隆；
图2为中华大蟾蜍沒F-7 ORF序列及其推导氨基酸序列；
图1中M:标准DNA; Al: PCR产物；B1: pGM_T_及F_7 EcoR I和ZAo I酶切产物； 图2中□为起始密码子和终止密码子。
[0013]
【具体实施方式】
[0014]现结合本发明的实施例，进一步说明本发明的有益效果。
[0015]实施例1
将蟾蜍清洗处死，取其背部皮肤剪成小块后投入液氮中速冻9h，再称取一小块蟾蜍背部皮肤，按RNA提取试剂盒说明提取其总RNA,用Quantscript RT kit合成其皮肤第一链cDNA，然后根据其他两栖类EDF-lcDNA序列确设计上、下游引物，取第一链cDNAl.3 μ L，加灭菌超纯水至22 μ L，加入与第一链cDNA等量的上、下游引物，在90°C循环实施PCR60min。反应结束后，取一部分PCR产物与pUCm-T连接，转化至E.coli感受态细胞DH5，然后取
3.5mL转化液均匀涂布于LB琼脂盘上。并在37°C恒温培养14h。挑取白色菌落接种于IOmLLB培养基中，实施菌落PCR。将通过菌落PCR确定为阳性的菌落0.35mL接种于4mL含IOOmg/mL氨苄青霉素-的LB培养液中，再次37°C恒温振荡培养15.5h，然后使用试剂盒进行质粒回收并对其进行EcoR I和Xho I双酶切，即得钙调素结合蛋白EDF-1的编码基因。
[0016]实施例2将蟾蜍清洗处死，取其背部皮肤剪成小块后投入液氮中速冻15h，再称取一小块蟾蜍背部皮肤，按RNA提取试剂盒说明提取其总RNA,用Quantscript RT kit合成其皮肤第一链cDNA，然后根据其他两栖类EDF-lcDNA序列设计上、下游引物，取第一链cDNA 1.1 μ L，加灭菌超纯水至18yL，加入与第一链00嫩等量的上、下游引物，在561:循环实施？0?801^11。反应结束后，取一部分PCR产物与pUCm-T连接，转化至E.coli感受态细胞DH5，然后取
2.5mL转化液均匀涂布于LB琼脂盘上。并在37°C恒温培养18h。挑取白色菌落接种于15mLLB培养基中，实施菌落PCR。将通过菌落PCR确定为阳性的菌落0.25mL接种于2mL含IOOmg/HiL氨苄青霉素-的LB培养液中，再次37°C恒温振荡培养17h，然后使用试剂盒进行质粒回收并对其进行EcoR I和Xho I双酶切，即得钙调素结合蛋白EDF-1的编码基因。
[0017]实施例3 将蟾蜍清洗处死，取其背部皮肤剪成小块后投入液氮中速冻10h，再称取一小块蟾蜍背部皮肤，按RNA提取试剂盒说明提取其总RNA,用Quantscript RT kit合成其皮肤第一链cDNA，然后根据其他两栖类EDF-lcDNA序列设计上、下游引物，取第一链cDNA 1.0 μ L，加灭菌超纯水至19 μ L，加入与第一链cDNA等量的上、下游引物，在72°C循环实施PCR72min。反应结束后，取一部分PCR产物与pUCm-T连接，转化至E.coli感受态细胞DH5，然后取4mL转化液均匀涂布于LB琼脂盘上。并在37°C恒温培养15h。挑取白色菌落接种于IlmL LB培养基中，实施菌落PCR。将通过菌落PCR确定为阳性的菌落0.3mL接种于3mL含IOOmg/mL氨苄青霉素-的LB培养液中，再次37°C恒温振荡培养16h，然后使用试剂盒进行质粒回收并对其进行EcoR I和Xho I双酶切，即得钙调素结合蛋白EDF-1的编码基因。
[0018]实施例4
将蟾蜍清洗处死，取其背部皮肤剪成小块后投入液氮中速冻lih，再称取一小块蟾蜍背部皮肤，按RNA提取试剂盒说明提取其总RNA,用Quantscript RT kit合成其皮肤第一链cDNA，然后根据其他两栖类EDF-lcDNA序列设计上、下游引物，取第一链cDNA 0.9 μ L，加灭菌超纯水至20 μ L，加入与第一链cDNA等量的上、下游引物，在78°C循环实施PCR75min。反应结束后，取一部分PCR产物与pUCm-T连接，转化至E.coli感受态细胞DH5，然后取3mL转化液均匀涂布于LB琼脂盘上。并在37°C恒温培养16h。挑取白色菌落接种于12mL LB培养基中，实施菌落PCR。将通过菌落PCR确定为阳性的菌落0.4mL接种于2.5mL含IOOmg/mL氨苄青霉素-的LB培养液中，再次37°C恒温振荡培养15h，然后使用试剂盒进行质粒回收并对其进行EcoR I和Xho I双酶切，即得钙调素结合蛋白EDF-1的编码基因。
[0019]实施例5
将蟾蜍清洗处死，取其背部皮肤剪成小块后投入液氮中速冻12h，再称取一小块蟾蜍背部皮肤，按RNA提取试剂盒说明提取其总RNA,用Quantscript RT kit合成其皮肤第一链cDNA，然后根据其他两栖类EDF-lcDNA序列设计上、下游引物，取第一链cDNA 1.5 μ L，加灭菌超纯水至21 μ L，加入与第一链cDNA等量的上、下游引物，在50°C循环实施PCR65min。反应结束后，取一部分PCR产物与pUCm-T连接，转化至E.coli感受态细胞DH5，然后取5mL转化液均匀涂布于LB琼脂盘上。并在37°C恒温培养17h。挑取白色菌落接种于13mL LB培养基中，实施菌落PCR。将通过菌落PCR确定为阳性的菌落0.5mL接种于3.5mL含IOOmg/mL氨苄青霉素-的LB培养液中，再次37°C恒温振荡培养18h，然后使用试剂盒进行质粒回收并对其进行EcoR I和Xho I双酶切，即得钙调素结合蛋白EDF-1的编码基因。[0020]实施例6
将蟾蜍清洗处死，取其背部皮肤剪成小块后投入液氮中速冻14h，再称取一小块蟾蜍背部皮肤，按RNA提取试剂盒说明提取其总RNA,用Quantscript RT kit合成其皮肤第一链cDNA，然后根据其他两栖类EDF-lcDNA序列设计上、下游引物，取第一链cDNA 0.8 μ L，加灭菌超纯水至20.5 μ L，加入与第一链cDNA等量的上、下游引物，在98°C循环实施PCR63min。反应结束后，取一部分PCR产物与pUCm-T连接，转化至E.coli感受态细胞DH5，然后取2mL转化液均匀涂布于LB琼脂盘上。并在37°C恒温培养15.5h。挑取白色菌落接种于14mLLB培养基中，实施菌落PCR。将通过菌落PCR确定为阳性的菌落0.2mL接种于2.8mL含100mg/mL氨苄青霉素-的LB培养液中，再次37°C恒温振荡培养14h，然后使用试剂盒进行质粒回收并对其进行EcoR I和Xho I双酶切，即得钙调素结合蛋白EDF-1的编码基因。[0021 ] 以下通过试验进一步说明本发明的有益试验结果。
[0022]试验一:
中华大蟾蜍钙调素结合蛋白EDF-1的克隆:
一)中华大蟾蜍皮肤总RNA的制备及其第一链cDNA的合成
从一 70°C 超低温冰箱中取一小块中华大蟾蜍背部皮肤，称重，然后按RNA提取试剂盒说明提取其总RNA，琼脂糖电泳检测RNA的完整性，用紫外分光光度计检测RNA溶液的浓度和纯度。用Quantscript RT kit合成其皮肤第一链cDNA。
[0023]二)引物设计及中华大蟾蜍皮肤及F-7 cDNA的克隆
根据其他两栖类EDF-1 cDNA序列设计上、下游引物Pl (5 ; -TAGAAGGCGAAACATGG-3')和 P2 (5' -GAGCACCGATTTCGAGGCT-3 ')。然后，以中华大蟾蜍皮肤第一链cDNA为模板实施PCR。反应体系:2XPCR PrimeStar Max Premix 10.0 μ L，上、下游引物各I UL (2 pmol/mL)，中华大蟾蜍皮肤第一链cDNA 1.0 μ L，加灭菌超纯水至20 μ L15PCR程序:98°C/2 min, (98°C /10 s,50°C /15 s,72°C /10 s) X 35 循环。反应结束后，将 PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测及DNA凝胶回收。然后对PCR产物进行加A反应，并取一部分PCR产物与pUCm-T连接，转化至万.co7i感受态细胞DH5，再将转化产物均匀涂布于蓝白斑筛选用的LB琼脂盘上(含氨节青霉素Ampicilin: 100 μ g 异丙基-3-D-硫代半乳糖苷 IPTG: 24 μ g*mL-l，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 Χ-gal: 40 μ g *mL-l) ?次日选取白色菌落实施菌落PCR以筛选阳性菌落。
[0024]三)中华大蟾蜍及F-7 ORF的克隆及其编码蛋白理化性质分析
以Pl和P2为引物，以中华大蟾蜍皮肤第一链CDNA为模板实施PCR，结果得到略小于500 bp的PCR产物(图1的A)。将PCR产物进行连接、转化并进行阳性菌落筛选和重组质粒回收及限制性内切酶消化(图1的B)。将确定为阳性的重组质粒委托公司进行测序。
测序结果分析表明，该PCR产物的ORF为447 bp，编码由148个氨基酸残基构成的蛋白质(如图2所示)。其编码蛋白的氨基酸序列与日本蟾蜍编码蛋白具仅3个氨基酸残基不同，对应于日本蟾蜍EDF-1 Ser22、Gln39和Lys88对应的中华大蟾蜍的氨基酸是Ala22、Glu39和Arg88，故命名该克隆为中华大蟾蜍EDF-1。
【权利要求】
1.一种用于抑制内皮细胞分化的蟾皮钙调素结合蛋白EDF-ι编码基因的克隆方法，其特征在于包括以下步骤: I)将蟾蜍清洗处死，取其背部皮肤剪成小块后投入液氮中速冻9-15h，置于-70°C超低温冰箱保存备用； 2)称取步骤I)中一小块蟾蜍背部皮肤，按RNA提取试剂盒说明提取其总RNA，用Quantscript RT kit合成其皮肤第一链cDNA,备用； 3)根据蟾蜍其他两栖类EDF-lcDNA序列设计上、下游引物，取步骤2)中第一链cDNA 0.8-1.5 μ L，加灭菌超纯水至18-22 μ L，加入与第一链cDNA等量的上、下游引物，在50-98°C循环实施PCR60-80min ;反应结束后，取一部分PCR产物与pUCm-T连接，转化至E.coli感受态细胞DH5，然后取2-5mL转化液均匀涂布于LB琼脂盘上，并在37°C恒温培养14-18h，挑取白色菌落接种于10-15mL LB培养基中，实施菌落PCR，将通过菌落PCR确定为阳性的菌落0.2-05mL接种于2-4mL含100mg/mL氨苄青霉素-的LB培养液中，再次37°C恒温振荡培养14_18h，然后使用试剂盒进行质粒回收并对其进行EcoR I和Xho I双酶切，SP可。
2.如权利要求1所述的一种用于抑制内皮细胞分化的蟾皮钙调素结合蛋白EDF-1编码基因的克隆方法，其特征在于蟾蜍皮肤液氮中速冻时间为10-14h，优选为ll-13h。
3.如权利要求1所述 的一种用于抑制内皮细胞分化的蟾皮钙调素结合蛋白EDF-1编码基因的克隆方法，其特征在于PCR的温度为60-90°C，优选65-80°C ;PCR的时间为65-75min，优选 68_72min。
4.如权利要求1所述的一种用于抑制内皮细胞分化的蟾皮钙调素结合蛋白EDF-1编码基因的克隆方法，其特征在于转化液均匀涂布于LB琼脂盘上后在37°C恒温培养15-16h。
5.如权利要求1所述的一种用于抑制内皮细胞分化的蟾皮钙调素结合蛋白EDF-1编码基因的克隆方法，其特征在于菌落振荡培养时间为15_16h。
【文档编号】C12N15/12GK103540597SQ201310489681
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年10月18日 优先权日:2013年10月18日
【发明者】杨仙玉, 方琦璐 申请人:浙江农林大学