用于增强植物胁迫耐受性的方法
【专利摘要】通过在植物中导入表达冷休克蛋白例如细菌冷休克蛋白的DNA提供了植物中增强的非生物胁迫耐受性。
【专利说明】用于增强植物胁迫耐受性的方法
[0001]本申请是申请日为2004年09月29日和发明名称为“用于增强植物胁迫耐受性的方法”的200480035385.X号发明专利申请的分案申请。
[0002]相关申请交叉参考
[0003]依据35USC§ 119(e)，本申请要求2003年9月29日提交的美国临时申请系列号60 / 506,717和2003年12月7日提交的系列号60 / 530453的优先权。[0004]序列表引入
[0005]两份序列表拷贝(序列表拷贝I和序列表拷贝2)以该序列表的计算机可读形式在此引入作为参考，这两份拷贝都在⑶-ROMs上，分别含有2004年9月28日创建的命名为CSP.ST25.txt的文件，文件大小约为98兆字节(在MS-DOS中测得)。
发明领域
[0006]本发明涉及植物中冷、旱、盐、冷发芽(cold germination)、热和其他非生物胁迫耐受性以及植物中病毒、真菌、细菌和其他非生物胁迫耐受性。具体来说，本发明涉及一种通过在植物细胞内表达冷休克蛋白增强所述植物生物和非生物胁迫耐受性的方法。
[0007]发明背景
[0008]种子和果实生产是数十亿美元的商品行业，对于美国许多州和世界上许多国家来说是其收入的主要来源。商业上有价值的种子包括，例如，低芥酸菜子(canola)、棉籽和向日葵籽，其备受珍视，因为从种子中可以榨取植物油。诸如豌豆、菜豆和小扁豆的豆科植物的种子由于它们富含蛋白质，因此在商业上也有价值，例如，就大豆来说，其含有40-45%的蛋白质及18%的脂类和油类。此外，咖啡亦是一种有价值的作物，由干燥并烘烤过的阿拉伯咖啡(Coffea arabica)植物的种子制成，而巧克力则由可可树种子或“豆”制成。同样地，许多果实和种子在商业上也有价值，包括，例如玉米、稻、小麦、大麦和其他谷类、坚果、豆类、西红柿和柑橘类水果。例如，玉米种子可制成多种食品或用于烹饪的物品，如玉米面豆卷壳、玉米油、玉米饼、玉米片、玉米面等。玉米也用作为许多产品生产的原料，包括但不限于，饲料和酒精生产。
[0009]由于生物和非生物胁迫，种子和果实生产固有地受之所限。例如，大豆(Glycinemax)是一种在贮藏期间遭受种子发芽损失并当土壤温度降低时无法发芽的作物(Zhang等，Plant Soill88:(1997))。这种现象实际上也存在于玉米和其他重要的农作物中。改善植物的非生物胁迫耐受性在农业上将有利于作物，使得生长增加和/或在冷、旱、洪涝、热、紫外线胁迫、臭氧增加、酸雨、污染、盐胁迫、重金属、矿化土壤和其他非生物胁迫下发芽。生物胁迫，例如真菌和病毒感染，在世界范围内也导致大量作物减产。
[0010]几世纪来，传统育种(将一种基因型的特定等位基因与另一种杂交)业已用于增强生物胁迫耐受性、非生物胁迫耐受性和产量。传统育种固有地受限于亲本植物中所存在的有限数量的等位基因。其又限制了以这种方式累积的遗传变异性的数量。分子生物学已容许本发明的发明人能广泛地寻找可改善植物胁迫耐受性的基因。我们的发明人寻求确定其他生物如何对胁迫环境起反应并耐受之。冷休克蛋白是为细菌和其他生物在冷和胁迫环境下生存所使用系统的一部分。本发明人提出将编码冷休克蛋白及其相关蛋白的基因导入植物中并表达，将能增强植物的冷、旱、热、水分和其他非生物胁迫耐受性以及植物的真菌、病毒、和其他生物胁迫耐受性。他们也相信使用与冷休克蛋白同源或具有序列相似性的基因，也将能增强生物和非生物胁迫耐受性。
[0011]经营农业者可使用本发明来减少它们因生物和非生物胁迫所造成的损失。
[0012]发明概述
[0013]本发明提供了一种在植物细胞中表达冷休克蛋白(Csp)的植物。冷休克蛋白的表达在所述植物中产生了更强的非生物胁迫耐受性。在一个实施方案中，编码冷休克蛋白的多核苷酸通过可操纵地连接到在植物中起作用的启动子和终止子而得到表达。
[0014]更具体地说，本发明提供了一种重组DNA分子，在5’至3’方向包含:包含在植物中起作用的启动子的第一 DNA多核苷酸，可操纵地连接到编码冷休克蛋白的第二 DNA多核苷酸，其可操纵地连接到提供多腺苷酸化位点的3’转录终止DNA多核苷酸。所述第一 DNA多核苷酸通常优选与第二 DNA多核苷酸异源。本发明也提供了一种具有在第一 DNA多核苷酸和第二 DNA多核苷酸之间插入内含子的重组DNA分子。本发明也提供了一种重组DNA分子，其中所述第二 DNA多核苷酸编码一种包含SEQ ID NO:3基序的蛋白。在本发明重组DNA的特定实施方案中，所述第二 DNA多核苷酸编码一种选自:
[0015](a)具有基本上同一于革兰氏阳性细菌冷休克蛋白氨基酸序列的氨基酸序列的蛋白，
[0016](b)来自枯草杆菌(Bacillus subtilis)的冷休克蛋白，
[0017](c)枯草杆菌冷休克蛋白B(CspB)同系物，
[0018](d)具有基本上同一于SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白，
`[0019](e)具有基本上同一于革兰氏阴性细菌冷休克蛋白氨基酸序列的氨基酸序列的蛋白，
[0020](f)包含来自大肠杆菌(Escherichia coli)冷休克蛋白的蛋白，
[0021](g)大肠杆菌冷休克蛋白A(CspA)同系物，
[0022](h)具有基本上同一于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白，
[0023](i)来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的冷休克蛋白，和
[0024](j)具有基本上同一于 SEQ ID NO:5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63 或 65 任一的氨基酸序列的蛋白。
[0025]本发明也提供了一种重组DNA分子，其中所述启动子选自由诱导型启动子、组成型启动子、时序调节型启动子、发育调节型启动子、组织优选型启动子、低温增强型启动子、低温特异性启动子、胁迫增强型启动子、胁迫特异性启动子、干旱诱导型启动子、缺水诱导型启动子和组织特异性启动子组成的组。
[0026]本发明也提供了在其基因组中包含上述重组DNA分子的植物细胞和植物以及繁殖体及由其产生的后代。植物包括，但不限于作物植物、单子叶植物和双子叶植物。更具体地说，这些植物可包括大豆、玉米、低芥酸菜子、稻、棉花、大麦、燕麦、草坪草、棉花和小麦。
[0027]本发明也提供了非生物胁迫耐受的转基因植物，其已用表达冷休克蛋白的重组DNA分子转化。这样的植物及其细胞和诸如种子的繁殖体在它们的基因组中包含表达冷休克蛋白的重组DNA分子。这样的植物具有一种或多种下列增强的性状:在限制相同种非转化植物生长的低温条件下更高的生长率，
[0028](a)在限制相同种非转化植物生长的高温条件下更高的生长率，
[0029](b)在限制相同种非转化植物生长的水分条件下更高的生长率，
[0030](c)在限制相同种非转化植物生长的土壤和/或水中增加的盐类或离子条件下更高的生长率，
[0031](d)在冷休克后较相同种未转化植物更大百分率的植物存活率，
[0032](e)当与相同种未转化植物相比时增加的产量，或
[0033](f)与相同种未转化植物相比对干旱的抗性。
[0034]本发明的一种方法包含繁殖本发明的植物，如，为了产生种子，仅通过将上述种子种植在土壤中并使之生长，如在胁迫环境下。更具体地说，本发明提供了一种生产的植物的方法，所述植物具有诸如非生物胁迫耐受性、增加的产量或增加的根群的增强的性状。所述方法包括步骤:
[0035]a)将包含编码冷休克蛋白DNA的重组DNA分子插入到植物细胞的基因组中，
[0036]b)获得转化的植物细胞，
[0037]c)从所述转化的植物细胞再生植物；和
[0038]d)择具有增强的性状的植物。
[0039]在本发明的一个方面，植物选自具有增强的非生物胁迫耐受性的植物，所述非生物胁迫耐受性选自:耐热性、耐盐性、耐旱性和冷休克后存活。
[0040]本发明也提供了分离的蛋白质，其是至少40%同一于具有选自SEQ ID NOS:5,7,9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63和65的氨基酸序列的蛋白质。在某些方面，可通过用具有较40 %同一性更高的同源性的蛋白质来取代冷休克蛋白以获得类似的性状。如，用与在此具体披露的冷休克蛋白具有至少50%、60%、70%、80%、90%或至少95 %同一性的蛋白质来取代。同样地，本发明也提供了一种编码冷休克蛋白基序的分离的核酸，其可与具有选自SEQ ID NOs =4,6,8,10,12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，90和92的DNA序列的核酸杂交。
[0041]本发明也具体提供了编码冷休克蛋白的分离的核酸，所述冷休克蛋白具有基本上同一于选自 SEQ ID NOs:5，7，9，29，31，33，35，37，39，41，43，53，55，57，59，61，63 和 65 序列的DNA序列。
[0042]本发 明也提供了包含上述重组DNA分子的繁殖体，当它们被种植或以其他方式发芽时，从所述繁殖体发芽的田间作物，如在上述繁殖体所播种的田地上。
[0043]本发明也提供了一种生产种子的方法，包括在土壤中种植权利要求59的种子；
[0044]b)从所述植物收获种子；因此生产得到种子。
[0045]也提供了一种生产转基因植物的方法，所述方法包括步骤:(i)将DNA分子导入植物细胞的基因组中，所述DNA分子包含至少40%同源于具有选自SEQ ID Nos =5,7,9,11,13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63和65的氨基酸序列的蛋白的DNA多核苷酸，或其片段、顺式元件，其中所述DNA多核苷酸可操纵地连接到启动子并且可操纵地连接到3’转录终止DNA多核苷酸；和(ii)选择所述转基因植物细胞；和(iii)在转基因植物中再生所述转基因植物细胞；也提供了通过该方法生产的植物。
[0046]特别地，本发明涉及以下各项:
[0047]1.一种重组DNA分子，其在5’到3’方向包含:
[0048]a)包含在植物中起作用的启动子的第一 DNA多核苷酸，其可操纵地连接到；
[0049]b)编码冷休克蛋白的第二 DNA多核苷酸，可操纵地连接到；
[0050]c)起多腺苷酸化序列作用的3’转录终止DNA多核苷酸。
[0051]2.第I项的重组DNA分子，其中在所述第一 DNA多核苷酸和所述第二 DNA多核苷酸之间插入植物DNA内含子。 [0052]3.第I项的重组DNA分子，其中所述第二 DNA多核苷酸编码包含SEQ ID NO:3的
氣基酸基序的蛋白。
[0053]4.第3项的重组DNA分子，其中所述第二 DNA多核苷酸编码选自下列的蛋白:
[0054](a)具有基本上同一于来自革兰氏阳性细菌冷休克蛋白的氨基酸序列的氨基酸序列的蛋白，
[0055](b)来自枯草杆菌的冷休克蛋白，
[0056](c)枯草杆菌冷休克蛋白B(CspB)同系物，
[0057](d)具有基本上同一于SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白，
[0058](e)具有基本上同一于来自革兰氏阴性细菌冷休克蛋白的氨基酸序列的氨基酸序列的蛋白，
[0059](f)包含来自大肠杆菌冷休克蛋白的蛋白，
[0060](g)大肠杆菌冷休克蛋白A(CspA)的同系物，
[0061](h)具有基本上同一于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白，
[0062](i)来自根癌农杆菌的冷休克蛋白，和
[0063](j)具有基本上同一于 SEQ ID NO:5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63 或 65 中任一的氨基酸序列的蛋白。
[0064]5.第I项的重组DNA分子,其中启动子选自:诱导型启动子、组成型启动子、时序调节型启动子、发育调节型启动子、组织优选型启动子、低温增强型启动子、低温特异性启动子、胁迫增强型启动子、胁迫特异性启动子、干旱诱导型启动子、缺水诱导型启动子和组织特异性启动子。
[0065]6.一种已用表达冷休克蛋白的DNA分子转化的耐非生物胁迫的转基因植物。
[0066]7.第6项的植物的繁殖体。
[0067]8.第6项的植物的后代。
[0068]9.第6项的植物，其是一种作物。
[0069]10.第6项的植物，其是一种单子叶植物。
[0070]11.第6项的植物，其是一种双子叶植物。
[0071]12.第6项的植物,其选自大豆、玉米、低芥酸菜子、稻、棉花、大麦、燕麦、草坪草、棉花和小麦。
[0072]13.第6项的植物，其具有:
[0073](a)在将限制相同种未转化植物生长的低温条件下更高的生长率，
[0074](b)在将限制相同种未转化植物生长的高温条件下更高的生长率，[0075](c)在将限制相同种未转化植物生长的水分条件下更高的生长率，
[0076](d)在将限制相同种未转化植物生长的土壤和/或水中增加的盐类或离子条件下更高的生长率，
[0077](e)在冷休克后较相同种未转化植物更大百分率的植物存活率，
[0078](f)当与相同种未转化植物相比时增加的产量，或
[0079](g)与相同种未转化植物相比对干旱的抗性。
[0080]14.第13项的植物的繁殖体，其是种子。
[0081]15.一种方法，其中将第14项的种子种植在土壤中并使之生长。
[0082]16.一种产生转基因植物的方法，所述方法包括下列步骤:
[0083]a)将第I项的重组DNA分子插入到植物细胞的基因组中；
[0084]b)获得含有所述重组DNA的转化植物细胞；
[0085]c)从所述的植物细胞再生植物；和
[0086]d)选择增强的非生物胁迫耐受性或增加的根生长的植物。
[0087]17.一种通过第16项的方法生产的胁迫耐受植物。
[0088]18.第16项的方法，其中所述非生物胁迫选自:耐热性、耐盐性、耐旱性和冷休克
后存活。`
[0089]19.一种分离的蛋白，其
[0090](a)是至少 40% 同一于选自 SEQ ID NO:5，7，9，29，31，33，35，37，39，41，43，53，55，57，59，61，63和65的至少一种蛋白，
[0091](b)在严谨条件下与选自 SEQ ID NO:4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，90 和 92 的核酸杂交，
[0092](c)具有基本上同一于 SEQ ID NO:5，7，9，29，31，33，35，37，39，41，43，53，55，57，59,61,63和65中任一的氨基酸序列。
[0093]20.一种农作物，其包含至少50%的从包含原核冷休克蛋白的繁殖体发育的植物。
[0094]附图简述
[0095]图1显示了 pM0N57396的质粒图。
[0096]图2显示了 pM0N23450的质粒图。
[0097]图3显示了 pM0N57397的质粒图。
[0098]图4显示了 pM0N57398的质粒图。
[0099]图5显示了 pM0N23450的质粒图。
[0100]图6显示了 pM0N57399的质粒图。
[0101]图7显示了 pM0N48421的质粒图。
[0102]图8显示了 pM0N56609的质粒图。
[0103]图9显示了 pM0N56610的质粒图。
[0104]图10显示了 pM0N73607的质粒图。
[0105]图11显示了 pM0N61322的质粒图。
[0106]图12显示了 pM0N73608的质粒图。
[0107]图13显示了 pM0N65154的质粒图。[0108]图14显示了 pM0N72472的质粒图。
[0109]图15显示了 pENTRl的质粒图。
[0110]图16显示了表达指示基因植物和对照植物的生长型，显示了所导入的基因提供了非生物胁迫耐受性。
[0111]图17显示了 PM0N42916的质粒图。
[0112]图18显示了 pM0N73983的质粒图。
[0113]图19显示了 pM0N73984的质粒图。
[0114]具体实施方案详述
[0115]本发明提供了一种对生物和非生物胁迫具有增强的耐受性的植物。由于在所述植物的细胞中表达了冷休克蛋白(csp)，所提供的植物具有增强的胁迫耐受性。本发明提供了几个实施方案的例子，并预计其他实施方案应能在本发明中起作用。
[0116]提供了下列定义和方法以便更好地定义本发明并指导本领域普通技术人员实践本发明。除非另作说明，术语将依照本领域普通技术人员之惯例进行理解。例如，分子生物学和分子遗传学的常用术语的定义可见于Lewin, Genes VII, Oxford University Pressand Cell Press,New York, 2000 ;Buchanan,等，Biochemistry and Molecular Biology ofPlants,Courier Companies,USA, 2000 ;Lodish,等，Molecular Cell Biology,W.H.Freemanand C0.,New York, 2000。遗传学的常用术语可见于在前的参考文献和Lynch,等,Geneticsand Analysis of Quant itative Traits, Sinauer and Associates, Sunderland, MA,1998 ;Hartwell,等，Genetics:From Genes to Genomes,McOraw-Hi11 Companies,Boston,MA,2000 ;Hartl,等，Genetics:Analysis of Genes and Genomes, Jones and BartlettPublishers, Sudbury,MA ;Strachan,等，Human Molecular Genetics,Johnffiley and Sons,New York,1999。
[0117]使用了 37CFR § 1.822所示的DNA碱基命名法。使用了标准的单字母和三字母氨
基酸残基命名法。
[0118]许多农学性状能影响“产量”。例如，这些性状可包括，不限于，株高、荚数、植物上荚位置、节间数量、荚裂倾角、粒度、根瘤和固氮作用效率、营养素同化作用效率、生物和非生物胁迫抗性、碳同化、植物结构、倒伏抗性、种子发芽率、幼苗活力以及幼株性状。例如，这些性状也可包括，不限于，发芽率(包括在胁迫条件下的发芽)、任一或所有植物部位的生长率(包括在胁迫条件下的生长率)、穗数量、每一穗的种子数量、种子粒度、种子成分(淀粉、油、蛋白质)、种子饱满特性。可用多种方法来测定产量，这些方法可包括容重、种子重量、每株植物种子数量、每株植物种子重量、每单位面积种子数量或重量(即每英亩种子数量或种子重量)、每英亩蒲式耳数、每英亩公吨数、每英亩美吨数、每公顷公斤数。在一个实施方案中，本发明植物表现了增强的性状，即为产量之一要素。
[0119]“核酸(序列)”或“多核苷酸(序列)”指基因组或合成来源的单链或双链DNA (脱氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)，即分别为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的多聚体，读码从5’ (上游)末端到3’ (下游)末端。所述核酸可为正义或互补(反义)链。
[0120]“天然的”指天然存在的(“野生型“)核酸序列。
[0121]“异源”序列指来源于外源或外来物种的序列，或者如果是相同来源的，则为来自其原型修饰的序列。例如，天然启动子可用来使相同或不同物种中的异源基因发生转录。[0122]植物“部位”包括植物的所有部位或部分，包括，但不限于，根、苗、叶、茎、花粉、种子、花、雄蕊、雌蕊、菌蕾、胚、花瓣、花丝、心皮(包括柱头、子房和花柱)、细胞或上述的任何部分。
[0123]“繁殖体”包括减数分裂和有丝分裂的所有产物，包括但不限于，种子和能繁殖为新植物的植物部位。例如，繁殖体包括苗、根或其他能生长为完整植物的植物部位。繁殖体也包括嫁接体，在此植物的一部分嫁接到不同植物(甚至是不同种的植物)的另一部分上以产生活的生物体。繁殖体也包括通过克隆、通过聚集减数分裂产物或使减数分裂产物聚集形成胚或受精卵(天然地或人为干预的)所产生的所有植物和种子。
[0124]“分离的”核酸序列是基本上分离或纯化的，不含其天然存在的生物体细胞中通常与之相关的其他核酸序列，即其他的染色体或DNA。该术语包括生物化学纯化的核酸，使得基本上除去污染的核酸和其他细胞组分。该术语也包括重组核酸和化学合成的核酸。
[0125]在此使用的“同一性”或“同一的”，当涉及在蛋白质或核酸之间比较时，指98%或更高的同一性。
[0126]如果第一核酸或蛋白质序列显示“基本上同一”或“基本上相似”于参照核酸序列或蛋白质，当与其他核酸(或其互补链)或蛋白质进行最优比对(在比较窗口内具有总和小于参照序列的20% 的适当的核苷酸或氨基酸插入或缺失)时，在至少20个核苷酸或氨基酸位置、优选至少50个核苷酸或氨基酸位置、更优选至少100个核苷酸或氨基酸位置、以及最优选在全长的第一核酸或蛋白质的比较窗口内有至少约60%核苷酸序列相等，更好为70%，优选至少约80%相等，更优选至少约85%相等，以及最优选至少约90%相等。用于比对比较窗口的最优比对可通过局部同源性算法来执行，优选通过使用计算机执行这些算法(可见于，例如，Wisconsin 遗传学软件包 7.0 版，Genetics Computer Group, 575ScienceDr.,Madison，WI)。所述参照核酸可以是全长分子或更长分子的一部分。换句话说，如果在严格条件下互相杂交，则两个核酸是基本上同一的。合适的杂交条件可根据经验来确定，或如果已知的话，可基于例如探针相对的G+C含量以及在探针和靶序列之间错配数量来估计。可通过改变例如杂交温度或盐浓度而自由地调整杂交条件(Sambrook等.，MolecularCloning.A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor Press,1989)。
[0127]当序列是如此排列使得第一核酸序列影响第二核酸序列的功能时，第一核酸序列是与第二核酸序列“可操纵地连接”。优选地，所述两个序列是单个连续核酸分子的一部分，更优选是相邻的。例如，如果在细胞中该启动子调节或介导该基因的转录，则其与该基因是可操纵地连接。例如，当所述终止子导致RNA聚合酶在该终止子处或附近终止含有所述基因的转录产物时，转录终止区域(终止子)与该基因是可操纵地连接。例如，增强子通常并不与其所作用的启动子相毗连，但是一般位于同一个核酸分子中。
[0128]通过人工组合两种不同的分离的序列片断制备得到“重组”核酸或DNA、或RNA分子，如，通过化学合成或通过基因工程技术操作分离的核酸片断。用于核酸操作的技术众所周知(参见，如.，Sambrook 等.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor Press, 1989)。例如，在 Beaucage 和 Carruthers, Tetra.Letts.22:1859-1862，1981，和 Matteucci 等，J.Am.Chem.Soc.103:3185,1981 中讨论了核酸化学合成所使用的方法，例如，可在商用寡核苷酸自动合成仪上进行核酸的化学合成。
[0129]基因“表达”指基因转录产生相应的mRNA以及该mRNA翻译生成相应的基因产物，即肽、多肽或蛋白。基因表达受调控元件控制或调节，所述调控元件包括诸如启动子的5’调控元件。
[0130]术语“重组DNA构建体”、“重组载体”、“表达载体”或“表达盒”指任何来源的，具有基因组整合或自主复制能力的所有介质，例如质粒、粘粒、病毒、BAC (细菌人工染色体)、自主复制序列、噬菌体、线状或环状单链或双链DNA或RNA核苷酸序列，其包含DNA分子，其中一个或多个DNA序列业以功能上可操作的方式连接。
[0131]“互补”指核酸序列通过碱基配对的天然结合。如果仅有一些核酸配对是互补的，则两个单链分子间的互补可以是部分的；或者如果所有的碱基对都是互补的，则上述单链分子间的互补是完全的。互补度影响了杂交和扩增反应的效率和强度。
[0132]“同源性”指核酸或氨基酸序列之间相似性水平，用核苷酸或氨基酸同一性或相似性词句，分别为序列相似性或同一性。同源性、同系物以及同源的也指在不同核酸或蛋白质之间具有相似功能性的概念。同系物包括定向进化同源和平行进化同源的基因。同系物可依所使用的基因编码序列来确定，以一种或多种下列方式披露在此或见于合适的数据库(例如NCBI或其他数据库)。对于蛋白质序列而言，序列应当使用算法进行比较(例如参见涉及“同一性”和“基本上同一”部分的内容)。对于核苷酸序列而言，一个DNA分子的序列可与已知或推定同源的序列以大致相同的方式进行比较。在分子(DNA、RNA或蛋白质分子)任何完整的实质(25个核苷酸或氨基酸，更优选50个核苷酸或氨基酸，更优选100个核苷酸或氨基酸，或最优选较短序列的全长)区域上，同系物具有至少20 %、更优选30 %、更优选40 %、更优选50 %、更优选60 %、更优选70 %、更优选80 %、更优选88 %、更优选92 %、最优选95%的同一性。
[0133]或者，如果具有相似功能的两条序列，或其中一条或两条序列的互补序列，在严谨条件下互相杂交，则两条序列，或编码或可编码氨基酸序列的DNA或RNA是同源的，或是同系物，或编码同源序列。因此，如果要确定两条蛋白质序列是否是同系物，则这两条序列都要进行在此描述的计算机作业，并创建所有可能的能编码蛋白质的核酸序列的简并密码序列，确定它们是否能在严谨条件下杂`交。促使DNA杂交的合适的严谨条件，例如，在约45°C下在6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，接着在50°C下用2.0x SSC洗涤，为本领域技术人员所熟知，或可见于 Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1 _6.3.6。例如，洗涤步骤中的盐浓度可从在50°C下约2.0x SSC的低严谨性到在50°C下约0.2x SSC的高严谨性中选择。此外，洗涤步骤的温度可从在约22°C的室温下的低严谨条件递增到约65°C的高严谨条件。温度和盐浓度都可以改变，或当温度和盐浓度中的一个变量改变时，另一个保持不变。在一个优选的实施方案中，编码本发明所述蛋白的核酸在高严谨条件下可与一个或多个核酸分子或其互补分子或两者的片段特异性杂交，例如在约65°C下在约2.0xSSC中。可通过本领域技术人员所熟知的多种方法检测探针与靶DNA分子的杂交，这些方法包括，但不限于，荧光标记、放射性标记、基于抗体的标记和化学发光标记。
[0134]“冷休克蛋白”(Csp (S)或CSP(s))是具有与大肠杆菌CspA蛋白(SEQ ID NO:1)或枯草杆菌CspB蛋白(SEQ ID N0:2)大于40%同一性的蛋白，或者，冷休克蛋白可通过使用在文献中所确定的保守结构域来发现。例如，在大肠杆菌CspA或枯草杆菌CspB全长范围中，在此使用的冷休克蛋白与大肠杆菌CspA或枯草杆菌CspB具有40 %同一性，更优选50%同一性，更优选60%同一性，更优选70%同一性，更优选80%同一性，更优选90%同一性，更优选95%同一性。可利用几个数据库，提供给本领域技术人员来确定是否新的或现有的蛋白包含冷休克结构域或是否为冷休克蛋白，包括从Genbank到用来提供确定蛋白相互关系和/或发现相关蛋白的蛋白质数据库。在此包括于该定义中的是所有已知的冷休克蛋白，包括但不限于来自大肠杆菌的CspA, CspB, CspC, CspD, CspE, CspF, CspG, CspH和CspI (美国专利 6，610，533)。
[0135]所述保守的冷休克结构域示于SEQ NO:3 ([FY]-G-F-1-x (6，7)-[DER]-LIVM]-F-x-H-x-[STKR] -x-[LIVMFY]) (Prosite 基序 PS00352 ；Bucher 和 Bairoch，(In) ISMB-94 ；Proceedings2nd International Conference on Intelligent Systems for MolecularBiology, Altman R.,Brutlag D.,Karp P., Lathrop R., Searls D.，编.,Menlo Park, 1994 ；Hofmann 等，Nucleic Acids Res.27:215,1999)中。或者，可使用 Sprint 数据库(一种相关的蛋白指纹图谱数据库)(Attwood 等.，Nucleic Acids Res.28:2000 ;Attwood,等.，Nucleic Acids Research, 30 (I),出版中，2002)来发现冷休克蛋白。或者,可使用基于描述的矩阵或Pfam来发现冷休克蛋白。Pfam是一种多重序列比对和包含许多常见蛋白结构域的隐马尔可夫模型的大集合(Bateman等,Nucleic Acids Research28:263, 2000)。在写操作下(2001年11月；Pfam第6版)，有3071个家族。包括冷休克蛋白，为PF00313。物种树显示了在Pfam数据库中所确定的冷休克蛋白的归类。
[0136]在此使用的“冷休克蛋白”也包括，但不限于，在使用冷休克蛋白作为使用NCBI的“Blink”(Blast Link)函数的数据库的询问序列的搜索中所发现的任何蛋白。“Blink”是一种快速搜索函数，用于寻找具有相似序列的蛋白质。该“冷休克蛋白”或“冷休克结构域”的定义除用于上述的那些之外，并不能代替所述的定义。冷休克蛋白或含有冷休克结构域的蛋白包括，但不限于 ，在公用和专用数据库中所有目前已知的蛋白，以及还要去发现的足以相似于所宣称的蛋白(例如，大肠杆菌CspA和枯草杆菌CspB)的那些，其在BlastLink(2001年11月I日)所普遍使用的标准blast搜索设定值下被“命中”。在写操作时，Blast2正运行,且Blast Link( “Blink”)运行缺省参数进行蛋白质-蛋白质blast搜索。在写操作时，我们认为Blink使用的缺省设定值如下:运行BL0SUM62矩阵，使用“nr”数据库，选择CD搜索，作为是基于统计学的组合，具有选作为“低复杂性”的复杂性，期望值为10，具有3的字长，缺口罚分是存在11和延伸I。表1所列的显示了使用这些标准设定值对大肠杆菌CspA最初的200个命中，但我们并不限制我们的权利要求在这最初的200个命中中。本领域技术人员应注意在这些相当严格的标准下，发现了 167个细菌来源的蛋白，但也发现了 28个多细胞动物蛋白和5个植物蛋白。这些蛋白包括来源广泛的与CspA同源的蛋白，发明人预计其在本发明中将发挥作用。该表决不是包括一切的列表，预计其他蛋白将在本发明中发挥作用。
[0137]表20.依据与大肠杆菌CspA相似性所发现的一些冷休克蛋白和含有冷休克结构域的蛋白。该列表是使用NCBI标准的Blast Link设定值所编辑的。显示了每个蛋白的Genbank ID和名称。注释:由于蛋白命名的方式，一些蛋白和序列将具有几个登录项，如蛋白、cDNAs、等位基因等。Genbank ID可被认为是每一登录项的特定标识符。登录项以与询
问序列比较得到的最高到最低同一性的大概次序排列。
[0138]
【权利要求】
1.一种产生耐干旱植物的方法，包括以下步骤: (a)将编码冷休克蛋白(Csp)的重组DNA插入到一个或多个植物细胞的基因组中以转化该植物细胞，所述冷休克蛋白具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的基本同一性且包含SEQ ID NO:3的冷休克结构域序列
[FY]-G-F-1-X(6,7)-[DER]-[LIVM]-F-χ-Η-χ-[STKR]-χ-[LIVMFY]； (b)从所述转化的植物细胞再生植物；和 (c)从所述再生的植物中选择表现出耐旱性的植物，其中所述选择的植物中所述冷休克蛋白(Csp)的表达赋予耐旱性。
2.根据权利要求1的方法，其中所述冷休克蛋白(Csp)在枯草杆菌CspB(SEQ ID NO:2)的整个长度上或在大肠杆菌冷休克蛋白CspA(SEQ ID NO:1)的整个长度上具有基本同一性。
3.根据权利要求1的方法，其中所述冷休克蛋白(Csp)在枯草杆菌CspB(SEQ ID NO:2)的整个长度上或在大肠杆菌冷休克蛋白CspA (SEQ ID NO: I)的整个长度上具有同一性。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述植物是玉米植物、大豆植物、棉花植物、小麦植物、大麦植物、油菜籽植物或水稻植物。
5.一种具有插入到其基因组中的重组DNA的植物细胞，其中所述重组DNA编码冷休克蛋白(Csp)，所述冷休克蛋白具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的基本同一性且包含SEQID NO:3的冷休克结构域序列
[FY] -G-F-1-X (6,7)-[DER] -[LIVM] -F-χ-Η-χ-[STKR] -χ-[LIVMFY]，且其中所述蛋白质的表达赋予所述植物细胞缺水耐受性。
6.一种具有插入到其基因组中的重组DNA的植物细胞，其中所述重组DNA编码冷休克蛋白(Csp)，所述冷休克蛋白具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的基本同一性且包含SEQID NO:3的冷休克结构域序列
[FY] -G-F-1-X (6,7)-[DER] -[LIVM] -F-χ-Η-χ-[STKR] -χ-[LIVMFY]，且其中所述蛋白质的表达赋予包含所述植物细胞的植物对干旱胁迫的抗性。
7.根据权利要求5或6的植物细胞，其中所述冷休克蛋白(Csp)在大肠杆菌冷休克蛋白CspA (SEQ ID NO:1)的整个长度上或在枯草杆菌CspB冷休克蛋白(SEQ ID NO:2)的整个长度上具有基本同一'I"生。
8.根据权利要求5或6的植物细胞，其中所述冷休克蛋白(Csp)在大肠杆菌冷休克蛋白CspA (SEQ ID NO: I)的整个长度上或在枯草杆菌CspB冷休克蛋白(SEQ ID NO:2)的整个长度上具有同一'I"生。
9.根据权利要求5或6的植物细胞，其中所述植物细胞是玉米植物细胞。
10.根据权利要求5或6的植物细胞，其中所述植物细胞是大豆植物细胞。
11.根据权利要求5或6的植物细胞，其中所述植物细胞是棉花植物细胞、小麦植物细胞、大麦植物细胞、油菜籽植物细胞或水稻植物细胞。
12.一种用于产生包含编码冷休克蛋白(Csp)的重组DNA的转基因种子的方法，该种子可用于产生具有增强的耐旱性的转基因植物作物，所述方法包括: (a)选择包含编码冷休克蛋白(Csp)的重组DNA的第一耐旱植物品系，其中所述冷休克蛋白(Csp)具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的基本同一性且包含SEQ ID NO:3的冷休克结构域序列[FY] -G-F-1-X (6,7)-[DER] -[LIVM] -F-χ-Η-χ-[STKR] -χ-[LIVMFY]，且其中所述冷休克蛋白质(Csp)的表达赋予所述第一植物品系的植物对干旱胁迫的抗性；和 (b)将所述重组DNA渗入不同的植物品系中。
13.根据权利要求12的方法，其中所述冷休克蛋白(Csp)在枯草杆菌CspB(SEQ ID NO:2)的整个长度上或在大肠杆菌冷休克蛋白CspA(SEQ ID NO:1)的整个长度上具有基本同一性。
14.根据权利要求12的方法，其中所述冷休克蛋白(Csp)在枯草杆菌CspB(SEQ ID NO:2)的整个长度上或在大肠杆菌冷休克蛋白CspA(SEQ ID NO:1)的整个长度上具有同一性。
15.一种在对于生长水分亚最佳和受限制的条件下生产大田作物的方法，所述方法包括培育具有插入到其基因组中的编码冷休克蛋白(Csp)的重组DNA的转基因植物，其中所述冷休克蛋白(Csp)具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的基本同一性且包含SEQ ID NO:3的冷休克结构域序列
[FY] -G-F-1-X (6,7)-[DER] -[LIVM] -F-χ-Η-χ-[STKR] -χ-[LIVMFY]，且其中所述冷休克蛋白质(Csp)的表达赋予所述植物对干旱胁迫的抗性。
16.根据权利要求15的方法，其中所述冷休克蛋白(Csp)在枯草杆菌CspB(SEQ ID NO:2)的整个长度上或在大肠杆菌冷休克蛋白CspA(SEQ ID NO:1)的整个长度上具有基本同一性。
17.根据权利要求15的方法，其中所述冷休克蛋白(Csp)在枯草杆菌CspB(SEQ ID NO:2)的整个长度上或在大肠杆菌冷休克蛋白CspA(SEQ ID NO:1)的整个长度上具有同一性。
18.根据权利要求12-17中任一项的方法，其中所述植物是玉米植物、大豆植物、棉花植物、小麦植物、大麦植物、油`菜籽植物或水稻植物。
19.一种用于产生耐旱植物的方法，包括以下步骤: (a)将编码冷休克蛋白(Csp)的重组DNA插入到一个或多个植物细胞的基因组中以转化该植物细胞，其中所述冷休克蛋白(Csp)由在50°C下2.0X氯化钠/柠檬酸钠的严格杂交条件下与SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:64杂交的DNA分子编码； (b)从所述转化的植物细胞再生植物；和 (c)从所述再生的植物中选择表现出耐旱性的植物，其中所述选择的植物中所述冷休克蛋白(Csp)的表达赋予耐旱性。
20.根据权利要求19的方法，其中所述植物是玉米植物、大豆植物、棉花植物、小麦植物、大麦植物、油菜籽植物或水稻植物。
21.—种具有插入到其基因组中的重组DNA的植物细胞，其中所述重组DNA编码冷休克蛋白(Csp)，所述冷休克蛋白由在50°C下2.0X氯化钠/柠檬酸钠的严格杂交条件下与SEQID NO:62或SEQ ID NO:64杂交的DNA分子编码，且所述蛋白质的表达赋予所述植物细胞缺水耐受性。
22.—种具有插入到其基因组中的重组DNA的植物细胞，其中所述重组DNA编码冷休克蛋白(Csp)，所述冷休克蛋白由在50°C下2.0X氯化钠/柠檬酸钠的严格杂交条件下与SEQID NO:62或SEQ ID NO:64杂交的DNA分子编码，且所述蛋白质的表达赋予包含所述植物细胞的植物对干旱胁迫的抗性。
23.根据权利要求21或22的植物细胞，其中所述植物细胞是玉米植物细胞。
24.根据权利要求21或22的植物细胞，其中所述植物细胞是大豆植物细胞。
25.根据权利要求21或22的植物细胞，其中所述植物细胞是棉花植物细胞、小麦植物细胞、大麦植物细胞、油菜籽植物细胞或水稻植物细胞。
26.一种用于产生包含编码冷休克蛋白(Csp)的重组DNA的转基因种子的方法，该种子可用于产生具有增强的耐旱性的转基因植物作物，所述方法包括: (a)选择包含编码冷休克蛋白(Csp)的重组DNA的第一耐旱植物品系，其中所述冷休克蛋白(Csp)由在50°C下2.0X氯化钠/柠檬酸钠的严格杂交条件下与SEQ ID NO: 62或SEQID NO:64杂交的DNA分子编码，且所述冷休克蛋白质(Csp)的表达赋予所述第一植物品系的植物对干旱胁迫的抗性；和 (b)将所述重组DNA渗入不同的植物品系中。
27.—种在对于生长水分亚最佳和受限制的条件下生产大田作物的方法，所述方法包括培育具有插入到其基因组中的编码冷休克蛋白(Csp)的重组DNA的转基因植物，所述冷休克蛋白(Csp)由在50°C下2.0X氯化钠/柠檬酸钠的严格杂交条件下与SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:64杂交的DNA分子编码，且其中所述冷休克蛋白质(Csp)的表达赋予所述植物对干旱胁迫的抗性。
28.根据权利要求26或27的方法，其中所述植物是玉米植物、大豆植物、棉花植物、小麦植物、大麦植物、油菜籽植·物或水稻植物。
【文档编号】C12N15/82GK103589749SQ201310491512
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2004年9月29日 优先权日:2003年9月29日
【发明者】M·费尔南德斯 申请人:孟山都技术有限公司