Il-10基因实时荧光pcr检测引物和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种IL-10基因实时荧光PCR检测引物，正向引物（SEQIDNO:1）:5-GGTTGTCGTCTCATTCTGAAAGA-3；反向引物（SEQIDNO:2）:5-GGTAGAGGACCCAAGTTCGTTAAGA-3；还提供了利用上述引物进行检测的试剂盒和方法。本发明采用SYBRGreenI实时荧光PCR检测方法，对IL-10基因进行鉴定，具有检测实时性和高效性。
【专利说明】IL-10基因实时荧光PCR检测引物和试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术检测领域，尤其是涉及IL-10基因表达检测技术。
【背景技术】
[0002]白介素10 (IL-10)，是一种负免疫因子，主要有T细胞分泌，能够已知T细胞克隆IL-12和IFNr的合成，又命名为细胞因子合成抑制因子。树突状细胞，B细胞，细胞毒性T细胞，Y S T细胞，NK细胞，肥大细胞以及中性粒细胞和嗜酸性细胞也能合成IL-10，这些细胞分泌IL-10主要决定于特定的刺激，受损组织类型和某种免疫反应时间点
IL-10是一种多功能负性调节因子，发挥下调炎症反应，拮抗炎性介质的作用。在感染流感病毒A的过敏性体质患者中，外周血IL-10水平明显减少；肾小球疾病患者IL-10水平上调，慢性肾衰尿毒症患者IL-10明显升高，且透析后较透析前明显增加，可能对尿毒症患者肾功能改善有意义；HIV感染早期患者、Ommen综合征患者血中IL-10水平明显高于正常人；自身免疫性脑炎的急性期IL-4、IFN-Y水平升高，病情好转时IL-10增加。 目前，IL-10的检测方法主要是通过ELISA的方式进行检测，但是价格较贵，其中所用抗体要求较高并较贵，实验周期长，并利用大范围的使用，尤其是在县级医院的广泛使用，急需一种方便快捷并价格便宜的检测IL-10的检测方法。
【发明内容】
[0003]为了解决上述现有技术的不足，本发明目的在于提供一种用于检测IL-10基因表达的实时荧光PCR检测引物和试剂盒。
[0004]本发明所采用的技术方案如下:
IL-10基因实时荧光PCR检测引物:
正向引物(SEQ ID NO:1):5-GGTTGTCGTCTCATTCTGAAAGA-3 反向引物(SEQ ID NO: 2): 5-GGTAGAGGACCCAAGTTCGTTAAGA-3。
[0005]利用上述引物进行检测的试剂盒，其包括一种检测溶液，检测溶液含有:含SYBRPremix Ex Taq(2X)、正向引物 10 μ M、反向引物 10 μ M、Rox Dye (50Χ )；
IL-10基因实时荧光PCR检测的方法，具体步骤是:
I)提取待检测样品的RNA，并反转录cDNA溶液。
[0006]2)反应体系:取2ul步骤I)中所得的DNA溶液，并与上述试剂盒中的检测溶液14ul进行混合，并加入无菌超纯水至反应体积20ul ;加入到实时荧光反应管中，进行离心；
3)将步骤2)的反应体系按照下述条件进行实时荧光PCR检测:
预变性94°C /120s, I次循环；变性95°C /60s，延伸66°C /120s,40次循环。
[0007]本发明采用SYBR Green I实时荧光PCR检测方法，对IL-10基因进行鉴定，具有检测实时性和高效性，并可以对早期IL-10基因表达进行检测，针对IL-10基因表达的胞外区RNA为检测对象进行设计引物，检测早期IL-10分泌形式的基因表达，用于早期判断免疫异常，包括早期的HIV的感染等，另外可以对病人进行个性诊断和治疗过程中，IL-10的基因表达情况的检测，用于个性治疗的參考生化指标。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1是实施例1的实时荧光PCR检测曲线。
【具体实施方式】
[0009]具体结合实施例对本发明作进ー步的说明。
[0010]实施例1
根据IL-10基因的mRNA进行设计IL-10基因实时荧光PCR检测引物:
正向引物(SEQ ID NO:1):5-GGTTGTCGTCTCATTCTGAAAGA-3 反向引物(SEQ ID NO:2): 5-GGTAGAGGACCCAAGTTCGTTAAGA-3。
[0011]利用上述引物进行检测的试剂盒，其包括一种检测溶液，检测溶液含有:含SYBRPremix Ex Taq(2X)、正向引物 10 u M、反向引物 10 u M、Rox Dye (50X)。
[0012]IL-10基因实时荧光PCR检测的方法，具体步骤是:
I)提取mRNA并反转录为cDNA ;取正常人3例血液标记为1_3，和病人3例血液，自身免疫性脑炎病人2例，标记4和5，其中HIV感染病人I例，标记6。
[0013]2)反应体系20微升:
取步骤I)中所述的cDNA 2微升 ，并加入检测溶液14微升，加入无菌水配置到20微升。
[0014]3)实时荧光PCR，反应条件如下:
预变性94°C /120s, I次循环；变性95°C /60s，延伸66°C /120s,40次循环。
[0015]如图1所示，其中曲线从上向下，依次为5、4、1、3、2、6。其中自身免疫性脑炎2例，4和5中所得的IL-10基因表达较正常人高。HIV感染病人IL-10基因表达与正常人无明显区另1J。
【权利要求】
1.1L-1O基因实时荧光PCR检测引物，其特征是: 正向引物(SEQ ID NO:1):5-GGTTGTCGTCTCATTCTGAAAGA-3 反向引物(SEQ ID NO:2):5-GGTAGAGGACCCAAGTTCGTTAAGA-3。
2.1L-10基因实时荧光PCR检测的试剂盒，其特征是:其包括一种检测溶液，检测溶液含有:含 SYBR Premix Ex Taq (2X)、正向引物 IOii M、反向引物 IOii M、Rox Dye (50X )； 所述的引物为权利要求1所述的引物。
3.1L-10基因实时荧光PCR检测的方法，其特征是，具体步骤是: .1)提取待检测样品的RNA，并反转录cDNA溶液； .2)反应体系:取2ul步骤I)中所得的DNA溶液，并与上述试剂盒中的检测溶液14ul进行混合，并加入无菌超纯水至反应体积20ul ;加入到实时荧光反应管中，进行离心； .3)将步骤2)的反应体系按照下述条件进行实时荧光PCR检测: 预变性94°C /120s, I次循环；变性95°C` /60s，延伸66°C /120s,40次循环。
【文档编号】C12N15/11GK103498006SQ201310503206
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年10月24日 优先权日:2013年10月24日
【发明者】唐余龙 申请人:唐余龙