一种快速检测青枯菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测青枯菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。本发明针对青枯菌16srRNA特异性靶基因设计和筛选了一套特异性检测引物组以及含有该检测引物组的检测试剂盒和利用该检测试剂盒通过环介导等温扩增的检测方法，进而确定待检测样品中是否存在青枯菌的检测方法。本发明的检测试剂盒和检测方法具有灵敏度高、特异性强、准确率好、检测时间短的优点，从样品处理到报告结果只需花4h不需要PCR仪和电泳仪，操作过程简单，比其他PCR技术具有更高的特异性。特别适合林业部门和企业自检使用。
【专利说明】一种快速检测青枯菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法
【技术领域】:
[0001]本发明属于生物检测领域，具体涉及一种快速检测青枯菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。
【背景技术】:
[0002]植物青枯病是由青枯菌Ralstoniasolanacearum(Smith)Yabuuchi et al 引起的一种维管束病害，可侵染多种植物如花生、桉树、木麻黄等，给农业和林业生产造成了很大的经济损失。青枯病不仅可通过发病植株传播,也可通过潜伏侵染植株传播。与发病植株比起来，潜伏侵染植株的传播作用更加有威胁。发病植物从外观上容易辨认，可通过加强植物检疫进行防控，然而，处在青枯病潜伏期的植物从外观上很难与正常植株分开，所以潜伏期植物对青枯病的传播作用应该更加引起重视。
[0003]目前，植物组织中青枯菌的检测主要沿用传统的分离培养方法，需要进行纯培养和生化鉴定等多个步骤，检测周期长，灵敏性低，不能实现大批量植物组织的快速检测，特别是组培苗的快检。近年来发展的PCR技术虽能提高检测效率，但是需要专用PCR仪和专业操作人员和电泳观测结果，在基层的林业部门难以大规模推广应用。
[0004]LAMP技术是2000年Notomi等开发的一种新型核酸扩增技术，针对待测靶基因的
6个区域设计4-6条特异性引物，在BstDNA聚合酶的作用下，在65°C左右等温条件Ih内可以进行特异高效快速的核酸扩增，达到IO9拷贝，扩增结果可直接观察焦磷酸镁沉淀或者加入显色剂进行判断。LAM P方法与PCR技术相比，检测时间短，具有更高的灵敏度和特异性，操作简单，仅仅需要普通水浴锅就可以完成检测。近年来已广泛用于各种病原检测。尽管已有针对青枯菌Flic基因建立LAMP方法的文献报道，但是由于仅用于水样品，且灵敏度有限，以此建立的LAMP方法在实际应用中具有一定的局限性。
【发明内容】
:
[0005]本发明的目的是提供一种快速、特异好、灵敏高的利用环介导等温扩增检测青枯菌的检测引物组，利用该检测引物组可以特异性的检测青枯菌。
[0006]本发明的利用环介导等温扩增检测青枯菌的检测引物组，其特征在于，由下列引物组成:
[0007]上游外引物F3 (5，-3，):GGATTAATTCGATGCAACGC (如 SEQ ID N0.1 所示)；
[0008]下游外引物B3 (5，-3，):CTTCCTCCGGTTTGTCAC (如 SEQ ID N0.2 所示)；
[0009]上游内引物FIP (5 ’ -3 ’ ):GCAGCACCTGTGTCCACTTACATGCCACTAACGAAGC (如 SEQ IDN0.3所示)；
[0010]下游内引物BIP (5，-3’):CAGCTCGTGTCGTGAGATGTTCGTAGCAACTAGAGACAAGG (如SEQ ID N0.4 所示)。
[0011]本发明的第二个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的青枯菌的检测方法，其特征在于，提取样品中的细菌DNA，然后通过环介导等温扩增的方法用上述检测引物组对细菌DNA进行选择性扩增，确认是否存在有扩增产物。
[0012]所述的样品可以为植物组织或者细菌培养物。
[0013]所述的通过环介导等温扩增的方法用上述检测引物组对细菌DNA进行选择性扩增具体为:环介导等温扩增体系为体系总体积25 μ L,包括2.5 μ LlO X Thermopol反应缓冲液、0.4 μ LlOmM dNTPs、0.5 μ LlOuM 上游外引物 F3、0.5 μ LlOuM 下游外引物 Β3、1 μ L40uM上游内引物？1卩、14 1^011]\1下游内引物81?、0.64 1^001111 MgS04、12.5 μ L2M 甜菜碱、4 μ L 灭菌双蒸水ddH20，I μ L8U/ μ L Bst DNA聚合酶和I μ L细菌DNA模板，反应条件为在温度为60 ~65°C 鮮育 45 ~60min。
[0014]所述的确认是否存在有扩增产物可以利用电泳检测、荧光显色检测或浊度检测环介导等温扩增反应产物是否具有扩增产物，优选用荧光显色检测，具体是在80°C终止反应I~2min,在扩增反应管中加入SYBR Green I显色剂，I~5min后观察结果,如果颜色为橙色，则样品青枯菌阴性，无青枯菌，如果颜色为绿色，则样品青枯菌阳性，含有青枯菌。
[0015]所述的lOXThermopol反应缓冲液是现有技术中的物质，可以从试剂公司购买至丨J，其含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、100mmol/L氯化钾(KCl)、100mmol/L 硫酸铵(NH4) 2S04、20mmol/L 硫酸镁(MgSO4)和 1% 曲拉通 X-100(TtitonX-100)，余量为水。
[0016]本发明的第三个目的是提供一种青枯菌的检测试剂盒，包括环介导等温扩增试剂和检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组由下列引物组成:
[0017]上游外引物F3 (5，-3，):GGATTAATTCGATGCAACGC (如 SEQ ID N0.1 所示)；
[0018]下游外引物B3 (5，-3，):CTTCCTCCGGTTTGTCAC (如 SEQ ID N0.2 所示)；
[0019]上游内引物FIP (5 ’ -3 ):GCAGCACCTGTGTCCACTTACATGCCACTAACGAAGC (如 SEQ IDN0.3所示)；
[0020]下游内引物BIP (5，-3’):CAGCTCGTGTCGTGAGATGTTCGTAGCAACTAGAGACAAGG (如SEQ ID N0.4 所示)。
[0021]本发明针对青枯菌16srRNA特异性靶基因设计和筛选了一套特异性检测引物组以及含有该检测引物组的检测试剂盒和利用该检测试剂盒通过环介导等温扩增的检测方法，进而确定待检测样品中是否存在青枯菌的检测方法。本发明的检测试剂盒和检测方法具有灵敏度高、特异性强、准确率好、检测时间短的优点，从样品处理到报告结果只需花4h不需要PCR仪和电泳仪，操作过程简单，比其他PCR技术具有更高的特异性。特别适合林业部门和企业自检使用。
【具体实施方式】:
[0022]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0023]1、样品增菌液(TTC-LB增菌液)
[0024]样品增菌液包括培养基和抑菌剂两部分。其中，培养基为LB肉汤，抑菌剂为TTC(氯代三苯基四氮唑)。
[0025]配制方法:
[0026](I) TTC抑菌剂配制[0027]称取15mg TTC干粉，加入IOmL纯水溶解，0.22um膜过滤除菌。
[0028](2)培养基配制[0029]称取21g LB培养基干粉，用1000mL蒸馏水，搅拌加热煮沸至充分溶解，分装三角瓶，每瓶IOOmL, 121 °C高压灭菌15min，冷却至40°C，加入ImL TTC抑菌剂，由此得到样品增菌液。
[0030]2、LAMP快速检测系列试剂
[0031](I)环介导等温扩增反应液:含有IOXThermopol反应缓冲液、300_500uM dNTP s(四种脱氧核苷酸的混合物)、4-6mL硫酸镁(MgS04)、0.1-0.3uM外引物(F3/B3)，l_2uM内引物(FIP/BIP)、0.8-1M 甜菜碱。
[0032]其中IOXThermopol缓冲液含有200mM pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、IOOmM 氯化钾(KCl)、IOOmM 硫酸铵(NH4) 2S04、20mM 硫酸镁(MgSO4)和 1% 曲拉通 X-100 (TtitonX-ΙΟΟ)，余量为水。
[0033]检测引物组:
[0034]上游外引物F3 (5，-3，):GGATTAATTCGATGCAACGC (如 SEQ ID N0.1 所示)；
[0035]下游外引物B3 (5，-3，):CTTCCTCCGGTTTGTCAC (如 SEQ ID N0.2 所示)；
[0036]上游内引物FIP (5 ’ -3 ’ ):GCAGCACCTGTGTCCACTTACATGCCACTAACGAAGC (如 SEQ IDN0.3所示)；
[0037]下游内引物BIP (5，-3’):CAGCTCGTGTCGTGAGATGTTCGTAGCAACTAGAGACAAGG (如SEQ ID N0.4 所示)。
[0038](2) Bst DNA聚合酶:每微升含有8个活性单位(8U/ μ L)
[0039](3)显色剂:10%的荧光染料SYBR GREEN I
[0040]上述环介导等温扩增(LAMP)反应液每管23 μ L的最佳组成为:
2.5 μ LlOXThermopol 反应缓冲液、0.4 μ L10mMdNTPs、0.5 μ LlOuM 上游外引物为 F3、
0.5 μ LlOuM下游外引物为B3、lyL40uM上游内引物为FIP、I μ L40uM下游内引物为BIP、
0.6 μ LlOOmM MgSO4' 12.5 μ L2M 甜菜碱、4 μ L 灭菌双蒸水 ddH20。
[0041]实施例1:感病桉树组织中青枯菌的检测
[0042]1、植物组织处理
[0043]取5g维管束组织加入IOmL无菌水，研碎，得到样品处理液，进行细菌DNA提取。
[0044]2、细菌DNA的提取
[0045]取11^样品处理液120001'/111；[11离心5111；[11,弃上清，收集菌体,加入5(^ LTE充分悬浮混匀，于100°C水浴IOmin,冰浴3min, 12000r/min离心5min,取上清备用，得到待检测模板 DNA。
[0046]3、LAMP 扩增
[0047]环介导等温扩增(LAMP)反应液每管25 μ L的组成为:2.5 μ LlOXThermopol反应缓冲液、0.4 μ LlOmM dNTPs、0.5 μ LlOuM上游外引物F3、0.5 μ LlOuM下游外引物Β3、
Iμ L40uM 上游内引物 FIP、I μ L40uM 下游内引物 BIP,0.6 μ LlOOmM MgSO4' 12.5 μ L2M 甜菜碱、I μ L BstDNA聚合酶、I μ L待检测模板DNA和4 μ L灭菌双蒸水ddH20，于恒温水浴锅上60°C孵育60min，80°C终止反应l_2min，取出反应管。
[0048]以不加DNA作为阴性对照，以加青枯菌的DNA的作为阳性对照。[0049]4、显色剂观察
[0050]在反应管中加入I μ L显色剂(10%的SYBR Green I显色剂)，直接用肉眼观察颜色变化，待检测样品反应管颜色变为绿色，阴性对照反应管颜色变为橙色，阳性对照反应管颜色变为绿色，由此说明待检测样品(感病桉树组织)中含有青枯菌。该结果与传统生化鉴定方法检测结果吻合，证明此方法数据可靠。
[0051]实施例2:健康木麻黄植物组织青枯菌检测
[0052]1、植物组织处理
[0053]取5g维管束组织加入IOmL无菌水，无菌研碎，得到样品处理液。
[0054]2、细菌DNA的提取
[0055]将样品处理液加入到100ml TTC-LB增菌液中37°C培养6_8h，取Iml增菌培养液，12000r/min离心5min，弃上清，收集菌体，加入50 μ L TE充分悬浮混匀，于10(TC水浴IOmin,冰浴3min, 12000r/min离心5min,取上清备用，得到待检测模板DNA。
[0056]3、LAMP 扩增
[0057]环介导等温扩增(LAMP)反应液每管25 μ L的组成为:2.5 μ LlOXThermopol反应缓冲液、0.4 μ LlOmM dNTPs、0.5 μ LlOuM上游外引物F3、0.5 μ LlOuM下游外引物Β3、
Iμ L40uM 上游内引物 FIP、I μ L40uM 下游内引物 BIP,0.6 μ LlOOmM MgSO4' 12.5 μ L2M 甜菜碱、I μ L BstDNA聚合酶、I μ L待检测模板DNA和4 μ L灭菌双蒸水ddH20，于恒温水浴锅上65°C孵育45min，80°C终止反应l_2min，取出反应管。
[0058]以不加DNA作为阴性对照，以加青枯菌的DNA的作为阳性对照。
[0059]4、显色剂观察
[0060]在反应管中加入I μ L显色剂(10%的SYBR Green I显色剂)，直接用肉眼观察颜色变化，待检测样品(健康木麻黄植物组织)反应管颜色变为橙色，阴性对照反应管颜色变为橙色，阳性对照反应管颜色变为绿色，由此说明待检测样品中不含有青枯菌。该结果与传统生化鉴定方法检测结果吻合，证明此方法数据可靠。
[0061]实施例3:特异性实验
[0062]收集青枯菌及非青枯菌41株(试验菌株见表1 )，将菌株分别在营养肉汤(NB)30°C培养24h后，取11^菌液，于120001'/11^11离心51^11，弃上清，收集菌体，加入5(^1^ TE充分悬浮混匀，于100°C水浴IOmin,冰浴3min, 12000r/min离心5min,取上清备用，得到待检测模板DNA。
[0063]环介导等温扩增(LAMP)反应液,每管25 μ L的组成为:2.5 μ LlOXThermopol反应缓冲液、0.4 μ LlOmM dNTPs、0.5 μ LlOuM上游外引物F3、0.5 μ LlOuM下游外引物Β3、
Iμ L40uM 上游内引物 FIPU μ L40uM 下游内引物 BIP,0.6 μ LlOOmM MgSO4'12.5 μ L2M 甜菜碱、I μ LBst DNA聚合酶、I μ L待检测模板DNA和4 μ L灭菌双蒸水ddH20，于恒温水浴锅上63°C孵育50min，80°C终止反应l_2min，取出反应管。
[0064]反应管中加入I μ L显色剂(10%的SYBR Green I显色剂)，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为橙色，则样品青枯菌阴性，无青枯菌，如果颜色为绿色，则样品青枯菌阳性，含有青枯菌。结果如表1所示。
[0065]表1:试验所用菌株及测试结果
[0066]
【权利要求】
1.一种利用环介导等温扩增检测青枯菌的检测引物组，其特征在于，由下列引物组成: 上游外引物 F3:GGATTAATTCGATGCAACGC ； 下游外引物 B3:CTTCCTCCGGTTTGTCAC ； 上游内引物 FIP:GCAGCACCTGTGTCCACTTACATGCCACTAACGAAGC ； 下游内引物 BIP:CAGCTCGTGTCGTGAGATGTTCGTAGCAACTAGAGACAAGG。
2.一种非疾病的诊断和治疗目的的青枯菌的检测方法，其特征在于，提取样品中的细菌DNA，然后通过环介导等温扩增的方法用权利要求1所述的检测引物组对细菌DNA进行选择性扩增，确认是否存在有扩增产物。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的样品为植物组织或者细菌培养物。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的通过环介导等温扩增的方法用权利要求1所述的检测引物组对细菌DNA进行选择性扩增具体为:环介导等温扩增体系为体系总体积25μ L，包括2.5 μ LlOXThermopol反应缓冲液、0.4 μ LlOmM dNTPs、0.5 μ LlOuM上游外引物F3、0.5 μ LlOuM下游外引物Β3、1 μ L40uM上游内引物FIP、lyL40uM 下游内引物 ΒΙΡ、0.6 μ LlOOmM MgS04、12.5 μ L2M 甜菜碱、4 μ L 灭菌双蒸水，1μ L8U/ μ L Bst DNA聚合酶和I μ L细菌DNA模板，反应条件为在温度为60~65°C孵育45 ~60min.
5.一种青枯菌的检测试剂盒，包括环介导等温扩增试剂和检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组由下列引物组成: 上游外引物 F3:GGATTAATTCGATGCAACGC ； 下游外引物 B3:CTTCCTCCGGTTTGTCAC ； 上游内引物 FIP:GCAGCACCTGTGTCCACTTACATGCCACTAACGAAGC ； 下游内引物 BIP:CAGCTCGTGTCGTGAGATGTTCGTAGCAACTAGAGACAAGG。
【文档编号】C12R1/01GK103602727SQ201310511792
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年10月25日 优先权日:2013年10月25日
【发明者】王胜坤, 康丽华, 马海宾, 陆俊锟, 江业根 申请人:中国林业科学研究院热带林业研究所