一种溶菌酶联合超声波清洗仪破碎法测定革兰氏阳性细菌胞内铬价态的方法
【专利摘要】本发明涉及一种溶菌酶联合超声波清洗仪测定革兰氏阳性细菌胞内的铬价态的方法。该方法是将在铬中生长的蜡样芽孢杆菌离心收集，通过与实验室中常规的细胞破碎法-超声波法进行比较，肯定了本发明方法对胞内铬价态测定影响小的优势，并进一步对其涉及的影响参数进行了正交分析，最终确定其最佳破碎参数为溶菌酶浓度4mg/mL、溶菌酶处理时间15min、超声波破碎功率70%、超声波处理时间45min。结果表明该方法对胞内铬价态的影响小于6%，且操作简便、处理量大、成本低。
【专利说明】一种溶菌酶联合超声波清洗仪破碎法测定革兰氏阳性细菌胞内铬价态的方法【技术领域】[0001]本发明涉及一种溶菌酶联合超声波清洗仪测定革兰氏阳性细菌胞内的铬价态的方法，属于微生物领域。
【背景技术】[0002]铬(Chromium)是生物体所必需的微量元素之一，于1797年首次被法国化学家 Lvauquelin发现，是一种用途广泛而又对人体危害较大的重金属元素之一。自然环境中主要存在的两种价态Cr3+和Cr6+，他们有着几乎相反的性质:适量的Cr3+可以降低人体血浆中的血糖浓度，提闻人体膜岛素的活性，促进糖和脂肪的代谢，提闻人体的应激反应能力等； 而Cr6+则是一种强氧化剂，具有强致癌变、致畸变、致突变作用，对生物体伤害较大。研究发现很多微生物都能对六价铬进行胞内还原，以达到铬污染环境的修复目的，这种微生物活体修复技术以其投资小、运行费用低、无二次污染等优点引起了广泛关注。因此找到一种简便又快捷的测定微生物胞内铬价态的方法，具有重要意义。[0003]目前，常见的微生物胞内产物释放是通过细胞破碎的方法达到的，主要分为两大类:一为机械法，包括超声波破碎法、珠磨法、压榨法、高压匀浆法等；二为非机械法，包括酶溶法、化学裂解法等。近年来，一些研究人员还发现用激光破碎细胞、高速相向流撞击法、 冷冻-喷射法和低电压细胞破碎等方法来对细胞进行破碎处理，收到了很好的成效。在实际生产中，必须根据细胞膜和细胞壁的化学组成成分和结构选择合适的方法破碎细胞，才能最大程度的对细胞进行破碎，减小破碎方式对胞内金属离子的价态影响。[0004]超声波细胞破碎法是实验室常用细胞破碎法，是一种液相剪切破碎法。经试验研究发现，在20kHz左右的超声波作用于细胞悬浮液一定时间，细胞膜和细胞壁会受到破坏， 但是增加超声波的频率却对细胞的破碎程度没有明显的影响，说明超声波的细胞破碎效率与超声波的声频、处理时间、细胞浓度以及细胞种类有关。这种细胞破碎方法主要面临的问题是超声波在细胞破碎处理过程中会不断产生热量而使温度不断升高，因此在生产使用中还需要加大投入来控制操作温度，而不至于影响胞内金属价态的改变；同时该破碎方法一次只能处理一个样品，操作耗时；另外还需要控制好待破碎细胞的浓度，这样才能保证声波更好的传递，才能更好的让细胞得到破碎。[0005]溶酶法是现在普遍应用的一类细胞破碎方法之一，利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。肽聚糖是细菌细胞壁的主要成分，由N-乙酰葡萄糖胺与N-乙酰胞壁酸借β_1，4糖苷键连接为聚糖骨架，再与四肽侧链及五肽交联桥共同构成。溶菌酶则可通过破坏细菌特别是革兰氏阳性细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的 β -1, 4糖苷键破碎细胞，但存在破碎不够彻底的缺点。
【发明内容】
[0006]针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种能够最大程度的破碎细胞， 最小程度的影响胞内重金属的价态测定的方法。[0007]本发明的上述目的是通过如下技术方案实现的:一种溶菌酶联合超声波清洗仪测定革兰氏阳性细菌胞内的铬价态的方法，包括如下步骤:1)将革兰氏阳性细菌在含铬的NA(Nutrient Agar)培养基中培养后，取出离心，取上清测定六价铬和总铬的浓度，作为细胞外的铬浓度；不加菌的作为对照组，测得的总铬浓度即为初始总铬浓度；2)取菌液沉淀先后经过溶菌酶处理和超声波清洗仪处理，离心后取上清液，分别测定其中的六价铬和总铬的浓度，作为细胞内的铬浓度。[0008]在本发明中，所述革兰氏阳性细菌是指将细菌作革兰氏染色，染后菌体呈紫色的细菌。包括但不限于葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)、肺炎双球菌(Pneumococcus)、炭疽杆菌(Bacillus anthraci) > 白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、破伤风杆菌(Clostridium tetani)、腊样芽胞杆菌(Bacillus cereus)等。[0009]在本发明中，所述NA培养基为蛋白胨、牛肉膏、NaCl、纯净水、琼脂配制而成，其 pH=7.0。在一个具体的实例中，所述NA培养基为蛋白胨10g、牛肉膏3g、NaC15g、纯净水 lOOOmL、琼月旨 25g。[0010]所述溶菌酶处理是指将菌液沉淀加入离心管中，并加入溶菌酶溶液，水浴保温；其溶菌酶溶液是将溶菌酶溶于纯水中制备得到，其浓度为l-10mg/ml，更优选为4_10mg/ml ； 所述水浴温度为37°C，保温时间为10-30min。[0011]本发明中使用的超声波清洗仪，一般用于物件全面清洗，特别对深孔，盲孔，凹凸槽清洗是最理想的设备。同时在生化、物理、化学、医学、科研及大专院校的实验中可作细胞粉碎、提取、脱气、混匀、纳米分解之用。其原理在于:超声波作用于液体中时，液体中每个气泡的破裂瞬间会产生能量极大的冲击波，相当于瞬间产生几百度的高温和高达上千个大气压，这种现象被称之为“空化作用”，超声波清洗正是用液体中气泡破裂所产生的冲击波来达到清洗和冲刷工件内外表面的作用。本发明中使用的超声波清洗仪的破碎功率为 50-75%，破碎处理时间为30-60min。[0012]本发明中，离心处理条件一般优选为5000rpm离心IOmin。[0013]本发明中，采用溶菌酶联合超声波清洗仪的方式对革兰氏阳性细菌进行破碎，其中溶菌酶浓度、溶菌酶处理时间、超声波破碎功率和超声波处理时间等因素是影响破碎效果的关键因素。发明人通过进行4因素3水平的正交法进行细胞破碎方案的优化，如表1。[0014]表1溶菌酶联合超声波清洗仪的破碎方案优化
【权利要求】
1.一种溶菌酶联合超声波清洗仪测定革兰氏阳性细菌胞内的铬价态的方法，包括如下步骤:1)将革兰氏阳性细菌在含铬的NA(Nutrient Agar)培养基中培养后，取出离心，取上清测定六价铬和总铬的浓度，作为细胞外的铬浓度；不加菌的作为对照组，测得的总铬浓度即为初始总铬浓度；2)取菌液沉淀先后经过溶菌酶处理和超声波清洗仪处理，离心后取上清液，分别测定其中的六价铬和总铬的浓度，作为细胞内的铬浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述革兰氏阳性细菌选自葡萄球菌 (Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)、肺炎双球菌(Pneumococcus)、炭疽杆菌(Bacillus anthraci)、白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、破伤风杆菌 (Clostridium tetani)、腊样芽胞杆菌(Bacillus cereus)。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述NA培养基由蛋白胨、牛肉膏、NaCl、纯净水、 琼脂配制而成，其pH=7.0。
4.如权利要求4所述方法，其中NA培养基由蛋白胨10g、牛肉膏3g、NaC15g、纯净水 lOOOmL、琼脂25g配制而成。
5.如权利要求1或2所述的方法，所述溶菌酶处理是将菌液沉淀加入离心管中，并加入溶菌酶溶液，水浴保温；所述溶菌酶溶液是将溶菌酶溶于纯水中制备得到，其浓度为 l-10mg/ml,更优选为4-10mg/ml ;所述水浴温度为37°C,保温时间为10_30min。
6.如权利要求1或2所述的方法，所述超声波清洗仪处理中超声波清洗仪的破碎功率为50-75%，破碎处理时间为30-60min。
7.如权利要求1或2所述的方 法，所述溶菌酶处理优选溶菌酶浓度4mg/mL、溶菌酶处理时间15min ;超声波清洗仪处理优选超声波破碎功率70%、超声波处理时间45min。
【文档编号】C12R1/07GK103555816SQ201310515897
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月28日 优先权日:2013年10月28日
【发明者】张娥, 陈晓明, 罗学刚, 王丹, 唐运来 申请人:西南科技大学