具有抗肿瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列及其氨基酸序列的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列及其氨基酸序列，属于医药生物工程领域。根据本发明的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列，可以从海蚯蚓的消化道组织中克隆该蛋白酶的编码基因。该编码基因通过基因重组技术，可以在原核表达系统中获得表达。本发明的重组海蚯蚓蛋白酶能够明显抑制肿瘤细胞增殖，具有研究开发前景。
【专利说明】具有抗肿瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列及其氨基酸序列
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种海蚯蚓蛋白酶，具体地说是一种具有抗肿瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列及其氨基酸序列，属于医药生物工程领域。
【背景技术】
[0002]蚯蚓，又名地龙，作为中国传统药物已应用2000多年。蚯蚓具有活血化瘀、清热解毒、提高机体免疫功能的作用，长期以来可用于细菌、病毒感染性疾病、免疫性疾病的治疗。近年来蚯蚓提取物的抑制血小板凝聚、溶解血栓的作用使其用于心血管疾病的临床治疗。另外，从蚯蚓中还提取到抗肿瘤活性的物质，多为蛋白酶组分，它能抑制肿瘤细胞生长，并且作为生物反应调节剂，具有辐射增效和化学增效作用。实验及临床研究证明蚯蚓提取物可以从多个方面抑制肿瘤的发生发展，有望成为新型抗肿瘤药物.海洋生物海艇蝴(Arenicola cristata)与艇蝴同属于环节动物门，但纲目科不同。海蚯蚓为多毛纲小头虫目沙蠣科，形似蚯蝴，生活于潮间带多沙地带，营管居生活，故名海蚯蚓，主要分布于我国渤海、黄海沿岸。海蚯蚓始载于《中国药用动物志》，用于痈疮肿毒，有清热解毒之功效。目前对海蚯蚓的研究方向主要集中在其形态结构、生理代谢、营养成分分析等方面。根据蚯蚓目前的研究状况，我们推测在海蚯蚓体内也存在多种蛋白酶，充分研究这些蛋白酶具有广阔的应用前景。但除了我们实验室报道了一个基因序列(ZL201210236225.8)外，尚没有其他海蚯蚓蛋白酶新基因序列的报道。我们对已报道的环节动物门Jfe丘蝴fetida DQ836917.Eisenia fetidaY^AVMSA八、Lumbricusrubellus U25647.1)和单环刺婦(CrecAi1S unicinctus HM623463.1) cDNA 序列进行多重比对，采用同源序列克隆法，通过3' RACE、5' RACE技术，获得了一种编码具有抗肿瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列。
【发明内容】
[0003]本发明提供一种具有抗肿瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列及其氨基酸序列。
[0004]为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案:
以来自海蚯蚓消化道上皮细胞的mRNA为模板，采用同源序列克隆法，通过3' RACE、5' RACE技术，获得了一种编码具有抗肿瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列。将该序列表达活性肽的部分克隆到表达载体上，在原核表达系统大肠杆菌中生产具有抗肿瘤活性的重组海蚯蚓蛋白酶。重组海蚯蚓蛋白酶具有抑制肿瘤细胞增殖的活性，可作为新型的基因工程药物。
[0005]海蚯蚓蛋白酶cDNA序列的克隆:
(I)设计引物:根据环节动物门蚯蚓和单环刺縊的蛋白酶较保守序列设计引物。
[0006](2)目的基因cDNA 3'端序列扩增及测序:由步骤(1)得到引物，和来自海蚯蚓消化道组织的总cDNA为模板，通过3' RACE (cDNA3/末端快速扩增技术)扩增海蚯蚓蛋白酶的基因cDNA 3'端序列。PCR产物胶回收后分别连TA克隆载体，转化细菌E.coli DH5 α，测序。
[0007](3)目的基因cDNA 5'端序列扩增及测序:根据获得的目的基因cDNA 3'端序列设计两对特异性引物，以来自海蚯蚓消化道组织的总cDNA为模板，采用5' RACECcDNA 5'末端快速扩增技术)，进行套式PCR，扩增海蚯蚓蛋白酶基因cDNA 5'端序列。PCR产物胶回收后分别连TA克隆载体，转化细菌E.coli DH5a，测序。 [0008](4)拼接:应用contigexpress软件对步骤(2)和(3)得到的目的基因cDNA 3'端和5'端序列进行拼接，获得本发明的海蚯蚓蛋白酶编码基因的DNA (mRNA)序列。
[0009](5)根据上述步骤(4)得到的DNA (mRNA)序列，使用DNAMAN软件，获得该海蚯蚓蛋白酶cDNA编码的氨基酸序列。
[0010]一种具有抗肿瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的编码基因序列，该序列如下:
IGGCCACGCGT CGACTAGTAC GGGGGGGGGG GGGGGGATCT TGCTGGATTG TTGACAACCA
61JGCTGAGGGC TGTTGTTTTC TCCTTGGTCC TGATCGGCAC CCTTGCCGAG GACAAATATG
121 CATACCAGAC CCGTTGGGAC TCAGATTGCG GTTATAGTCA GTTTGCTGAT GCTGGCCGTG 181 AACTGCCAGA CCCAGGTCCA GTCTGCCCAG GAAGGACTCC AGGAGAATAC ATTGTTTGTG 241 GGTGGGAGGC CCGAGTCCAT GAGTTCCCCT ACCAGGGACT GCTGTACTAT TTTGGAAGCC 301 TGAGATGTGG AGCTGTGCTG ATCACCCCTG ACTATGTTCT GACTGCTGCT CACTGCACCA 361 GTAATATTGG TGCCAGCAGC CTCCAGATTG GAATTGGTGA GCACCAAAGG AATTCTCCTC 421 CTAGTGAGAG GCAAATCTAC CAAGTTGCCC AGGTTATCAA CCACCCTAAC TACAGCCCCA 481 GCACCATCCA GCATGATATT GCTGTCCTCC GTCTCACCAC CAGTGTTGTT TATGGAGACC 541 ATGCAAACCC TGCCTGCCAA CCTGGTGGTG GTGGCAATGA GTATGCTGGT CAMCTTGCC 601 ATGTCAGTGG ATGGGGCAGC ACCCGCTCTG GAGGCTCTGT CACTCAGGAG CTTCGCTACA 661 CCAACMGCC AGTTATGAGC TATGCTGCCT GTCAAGCCTC TCAGTCTGGC ATCTTGTCTG 721 GTATGTTGTG TGCTGGAGAA CCCCCATATT ACAGGGATGC CTGCCAGGGT GACTCTGGTG 781 GCCCATTGGC TGTGAAAGTT AACGGAAAAC TGGAGGTTGT TGGTCTGGTG TCTTGGGGCT 841 ATGGCTGTGC TGGCTCTACT CCCGGAGTCT ACAATGAGGT CTACTCATAT GTTGACTGGG 901 TTAATAGCGT AATCGGTTAACATGGCAATG TTAACATGGC AATAAATGAA CTGCTGATCA 961 TGTAAAAAAA AAAAAAAAAA GTACTAGTCG ACGCGTGGCC 序列中划线黑体标示的ATG为起始密码子，划线黑体标示的TAA为终止密码子。
[0011]以上序列为编码海蚯蚓蛋白酶的原始cDNA序列，通过基因工程的方法可对其结构进行改造，得到海蚯蚓蛋白酶cDNA序列的衍生序列。该衍生序列包括新分离的具有与以上所述结构同样基本结构的基因序列以及使用体外DNA操作技术通过碱基的置换、插入、缺失获得的该基因序列的各种突变体。
[0012]根据海蚯蚓蛋白酶的原始cDNA序列，得到一种具有溶栓活性的海蚯蚓蛋白酶的氨基酸序列。该序列如下:
IMLRAVVFSLV LIGTLAEDKY AYQTRffDSDC GYSQFADAGR ELPDPGPVCP GRTPGEYIVC
61GWEARVHEFP YQGLLYYFGS LRCGAVLITP DYVLTAAHCT SNIGASSLQI GIGEHQRNSP
121 PSERQIYQVA QVINHPNYSP STIQHDIAVL RLTTSVVYGD HANPACQPGG GGNEYAGQTC 181 HVSGffGSTRS GGSVTQELRY TNKPVMSYAA CQASQSGILS GMLCAGEPPY YRDACQGDSG241 GPLAVKVNGK LEVVGLVSffG YGCAGSTPGV YNEVYSYVDff VNSVIG划线标示部分(MLRAVVFSLV LIGTLA)为该蛋白酶的信号肽序列。黑体⑶SGGP为丝氨酸蛋白酶家族的高度保守序列。
[0013]该序列为海蚯蚓蛋白酶的原始氨基酸序列，通过改构可得到一种具有抗肿瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的氨基酸序列的衍生序列，包括在原始氨基酸序列基础上进行单个或多个氨基酸的置换、插入、缺失等形成的各种变构体。
[0014]本发明的有益效果是:根据本发明的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列，可以从海蚯蚓消化道组织总cDNA中克隆该酶的编码基因。通过基因重组技术，使该酶的编码基因在原核表达系统(如大肠杆菌)或真核表达系统(如酵母细胞或动物细胞)中表达。重组海蚯蚓蛋白酶具有抑制肿瘤细胞增殖的活性，可作为潜在的新型抗肿瘤药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为海艇蚓蛋白酶全长cDNA序列克隆的实验步骤流程图。
[0016]图2为环节动物门蚯蚓和单环刺縊蛋白酶的较保守序列一引物设计区。
[0017]图3为海蚯蚓蛋白酶重组蛋白表达纯化及活性测定的实验步骤流程图。
[0018]图4为海蚯蚓蛋白酶编码序列在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE分析图。
[0019]图5为纯化的重组海蚯蚓蛋白酶的SDS-PAGE分析图。
[0020]图6为表1重组海蚯蚓蛋白酶的抗肿瘤活性测定。
【具体实施方式】
[0021]以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0022]实施例1
海蚯蚓蛋白酶全长cDNA的克隆及序列测定。
[0023]实验材料:
1.海蚯蚓，采自烟台市近海；
2.Trizol试剂、3' RACE试剂盒、5 ' RACE试剂盒(北京吉百特)，反转录试剂盒(fermentas 公司)，T_A Easy 试剂盒、Wizard 纯化 DNA 试剂盒、DNase、Rnase H (Promega公司)，高保真Taq酶(大连宝生物)。
[0024]实验方法:如图1所示，包括以下步骤:
1.设计引物序列:3R为含接头引物序列的反转录引物；3R1为3'端接头引物；3F1是根据环节动物门蚯蚓和单环刺縊蛋白酶的较保守序列(如图2:1，2，3，4分秘% Eiseniafetida DQ836917.\、Eisenia /e^io{3DQ418454.1Xumbricus rubellus U25647.\、Urechisunicinctus HM623463.1)设计的引物。5R为 oligodT 反转录引物。5R1、5R2 是根据:V RACE获得的3'端序列设计的特异性引物；5F1为含5'端接头引物序列的引物；5F2为5'端接头引物。
【权利要求】
1.一种具有抗肿瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列，其特征在于，此序列由1000个碱基对组成，此核苷酸序列为:
2.根据权利要求1所述的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列，其编码蛋白质的特征在于:由286个氨基酸组成，其氨基酸序列如下:
【文档编号】C12N9/64GK103525845SQ201310521130
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月30日 优先权日:2013年10月30日
【发明者】鞠吉雨 申请人:潍坊医学院