海水芽孢杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株海水芽孢杆菌（Bacillusaquimaris）SWJS44及其液体发酵产蛋白酶的应用。该菌于2013年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7389。经单因素实验优化了海水芽孢杆菌（Bacillusaquimaris）SWJS44产蛋白酶的条件，其培养、发酵条件简单，遗传性质稳定。
【专利说明】海水芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及深海中微生物筛选及发酵领域，具体涉及海水芽孢杆菌aquimaris) SWJS44及其液体发酵产蛋白酶的方法。
【背景技术】
[0002]蛋白酶(PiOtease)属于水解酶类，是最重要的三大工业用酶之一，销售额约占全球酶制剂市场的60%。蛋白酶在食品、酿造、医药、纺织、皮革、日用化学、洗涤剂、饲料以及水产加工等多个行业有广泛应用，对国民经济的发展起着重要的作用。随着发酵技术的进步及基因工程的崛起和广泛应用，利用微生物产酶成为了商品酶制剂生产的主要方法。首先，微生物生长繁殖速度快，产酶量较高；其次，微生物无处不在，几乎在所有的环境中都有微生物存在，由于环境的不同，微生物的种类以及所产酶也不尽相同，从而不同类型以及特性的酶制剂几乎都能从微生物中获得，如高温酶、中温酶、低温酶、耐高盐酶、耐碱酶等；再次，微生物培养条件容易控制，可进行连续的发酵，并且可以大批量生产，不仅能降低生产成本，而且能保证酶制剂的供应量。
[0003]海洋中低温、高盐、高压环境使得海洋中的微生物及其所产的胞外酶具有陆生微生物所不具备的特性。海洋微生物所产酶具有作用PH范围宽，最适pH和反应温度适中，温度对蛋白酶活力影响小等特点。然而，目前已鉴定出的海洋微生物还不到总量的5%，已发现的活性物质只占总数的1%。从深海海泥中筛选出产特异性蛋白酶的微生物菌株，并研究了其蛋白酶酶学特性，以期为深海微生物蛋白酶的开发利用提供理论指导。
【发明内容】
[0004]本发明目的之一是提供了一种海水芽孢杆菌aquimaris)。
[0005]本发明目的之二是提供了一种海水芽孢杆菌(Bacillus aquimaris) SWJS44在液体发酵生产蛋白酶的应用。
[0006]本发明中可生产蛋白酶的深海菌株，为海水芽孢杆菌(BaciIlus aquimaris)SWJS44，该菌于2013年4月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中科院微生物研究所，保藏编号为CGMCCN0.7389。
[0007]对保藏号为CGMCC N0.7389的菌株进行形态学及生理生化鉴定，有以下特征:(I)菌落形态:橙色，呈椭圆形，表面光滑，低凸起，不透明，边缘整齐；(2)细胞形态:直杆状，链状排列，周生鞭毛，革兰氏阳性；(3):生理生化特征:生长温度为4-40°C，好氧，能耐受7%(wt)氯化钠，能水解明胶、淀粉、酪素，能利用硫酸铵、硝酸铵，可利用果糖、葡萄糖、甘露醇为碳源，不能利用木糖，吲哚反应为阴性性，甲基红试验、接触酶和氧化酶试验为阳性，不产过氧化氢、硫化氢。
[0008]保藏号为CGMCC N0.7389菌株经16S rDNA鉴定，测得基因片段长度为1295bp，具体基因序列见序列表。将获得的基因序列输入Genbank,应用Blast程序将获得的基因序列与数据库中基因序列进行对比。结果显示与海水芽孢杆菌aquimaris池16SrDNA序列的同源性为99%。将此结果结合菌株形态学及生理生化鉴定特征，确定该菌为海水芽抱杆菌aquimaris)。
[0009]保藏号为CGMCC N0.7389菌株通过单因素试验对其液体发酵产蛋白酶条件进行了优化。
[0010]本发明公开了海水芽孢杆菌(Bacillus产蛋白酶的条件,其培养、发酵条件简单，遗传性质稳定。由于该菌株来源于深海，所分泌蛋白酶具有特殊的性质，并且关于该菌株的文献报道较少，在开发新型深海菌株及酶制剂的研究中，具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为不同种子液培养时间对海水芽孢杆菌aquimaris) SWJS44产蛋白酶的影响曲线。
[0012]图2为不同装液量对海水芽孢杆菌(Bacillus aquimaris) SWJS44产蛋白酶的影响曲线。
[0013]图3为不同发酵温度对海水芽孢杆菌(Bacillus aquimaris) SWJS44产蛋白酶的影响曲线。
[0014]图4为不同发酵时间对海水芽孢杆菌产蛋白酶的影响曲线。
具体实施例
[0015]富集及种子培养基:蛋白胨5g，酵母膏lg，硫酸铁0.lg，人工海水1L，pH7.6-7.8。
[0016]酪蛋白培养基:酪蛋白10g，牛肉浸粉3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2g，琼脂15g，去尚子水 L, pH7.3~7.5。
[0017]发酵培养基:麦芽糖5g，酵母粉10g，氯化钙2.8g，氯化钠lg，SE 170 1.5g，去离子水 1L，pH7.5。
[0018]编号CGMCC N0.7389菌株的分尚、筛选
细菌的富集:取少许海泥于含无菌去离子水的锥形瓶中，加入几粒无菌玻璃珠，37°C、150rpm摇床中分散30min。吸取Iml上清液接种于富集培养基中(25ml/250ml)，37°C、150rpm摇床中培养24h。
[0019]初筛:取Iml富集液适当稀释后涂布于酪蛋白培养基上。若细菌产蛋白酶，在菌落周围出现透明水解圈，根据水解圈直径(D)与菌落直径(d)的比值(D / d)大小确定产蛋白酶能力较强的菌株。
[0020]分离纯化:挑取D / d比值较大的菌株，连续划线分离三次以上，得纯培养物。将其于接种于斜面上，4°C保藏。
[0021]复筛:将上述保藏的菌株接种于种子培养基中，37°C，150r/min，活化12h后，以1%的接种量接种于发酵培养基中(25ml/250ml)，发酵培养48h。将发酵完成液于4°C，1000Or/min条件下高速离心lOmin，过滤得上清液，即粗酶液。采用福林-酚法测发酵液中性蛋白酶酶活，筛选出酶活较高的菌株。
[0022]编号CGMCC N0.7389菌株的鉴定将活化的编号CGMCC N0.7389的菌株接种于L-B培养基中，37°C，150r/min培养12h，经L-B培养液传代培养2-3次后，取1.5mL对数生长末期的菌体培养物，4°C，10000r/min离心5min，收集菌体，去尽培养液。菌体经SDS及蛋白酶K裂解、酚-氯仿-异戊醇抽提、转移上清、0.6倍体积异丙醇析出DNA沉淀后短暂离心、70%乙醇洗涤、TE溶解模板DNA。电泳检测后采用通用引物进行PCR (正向引物:5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物:5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。
[0023]扩增总反应体系为(20 μ L):模板基因DNA 0.5yL;上下游引物(20μηιο1/1)各l.0yL ；Taq DNA 聚合酶 0.2 μ L ； 10 X buffer 2.0 μ L ;4 种脱氧核苷酸混合物 dNTP (各 2.5mmol/L) 1.6 μ L, 25 mmol/L MgCl2 1.6 μ L，双蒸水(ddH20) 12.1 μ L。PCR 扩增条件:95°C5 min ；95°C 30 s ；55°C 30 s ；72°C 1.5 min ；72°C 10 min ;1(TC，共 30 个循环。PCR产物纯化后完成测定的16S rDNA基因基因片段长度为1295bp,与aquimaris strain相似性最高，同源性达99%，具体序列见序列表。结合菌株形态学、生理生化特征，判定编号CGMCC N0.7389 的菌株为海水芽抱杆菌aquimaris)。
[0024]海水芽孢杆菌CGMCC N0.7389液体发酵产蛋白酶条件优化
种龄的优化:将菌株接种于种子液中，37°C，150r/min，分别培养4h、8h、12h、16h、24h后，接种于发酵培养基发酵48h，测定其酶活。结果见图1。种龄对发酵液中蛋白酶活的高低无显著影响。
[0025]摇瓶装液量的优化:采用250ml锥形瓶进行摇瓶发酵，装液量分别为10%、20%、30%、40%、60%、80%，在37°〇，1501'/1^11条件下发酵4811。测定发酵液中蛋白酶酶活，结果如图2，装液量为10%时酶活最高，随着装液量的增加，蛋白酶酶活迅速降低。
[0026]发酵温度的优化:将发酵液分别置于25°C、30°C、37°C、40°C、45°C、5(rCT，150r/min，装液量为10%，发酵培养48h。测其发酵液中蛋白酶酶活，结果如图3，在37°C下发酵，发酵液中蛋白酶活较高。
[0027]发酵时间优化:将接种后的装液量为10%的发酵液放于37°C，150r/min，培养72h，每隔6h取样，测其蛋白酶酶活。结果如图4，蛋白酶活在48h时达到最大，随着时间延长，酶活有较小幅度下降。
[0028]编号CGMCC N0.7389菌株的遗传稳定性
将保藏的编号CGMCC N0.7389菌株连续传代培养，并测其酶活，以酶活力作为评价遗传稳定性的指标。结果如表1，传代8次，蛋白酶力保持在300U/ml左右，表明菌株有较好的遗传稳定性。
[0029]表1
【权利要求】
1.一株海水芽孢杆菌TifeciBw1S该菌于2013年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.7389。
2.权利要求1所述海水芽孢杆菌在液体发酵生产蛋白酶的应用。
【文档编号】C12R1/07GK103740605SQ201310528188
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年10月31日 优先权日:2013年10月31日
【发明者】崔春, 赵谋明, 钟泓波, 赵强忠, 苏国万 申请人:华南理工大学