检测dhfr的c829t单核苷酸多态性的引物和方法
【专利摘要】本发明公开了检测DHFR的C829T单核苷酸多态性的引物，其特征在于，所述引物包括特异性扩增引物SEQNO.1、SEQNO.2，其序列为：SEQNO.1：ACTAAGTGCTTCTCCAAGACC，SEQNO.2：Biotin-AATGTCAAGGACTGGCAAGAG。所述引物进一步还包括特异性测序引物SEQNO.3，其序列为：SEQNO.3：AGTCCCCAGCACCTG。本发明通过特异性引物扩增目的区域，并利用焦磷酸测序分析鉴定多态性，不但保证了一定的准确性及灵敏度，同时相对Sanger测序法具备了较短的检测周期，具有灵敏度高，操作简单、成本低等优点。
【专利说明】检测DHFR的C829T单核苷酸多态性的引物和方法
[0001]本申请是申请号为201210331289.6、申请日2012年9月10日的中国专利申请的
分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明属生命科学和生物【技术领域】，特别是一种DHFR的C829T单核苷酸多态性检测试剂盒，采用基因测序技术，可以对DHFR (C829T)多态性位点进行检测。
【背景技术】
[0003]骨髓抑制限制了多种化疗药物的应用，使之难以达到治愈或抑制肿瘤生长的效果，而一些耐药基因是产生骨髓抑制的分子基础，如二氢叶酸还原酶基因
(dihydrofolate reductase, DHFR)。
[0004]DHFR是细胞内叶酸代谢的关键酶，分子量为22KD。在还原型辅酶II (NADPH)的参与下，DHFR能催化叶酸变成二氢叶酸，而后者为合成胸嘧啶核苷及嘌呤核苷输送了碳元素，因此DHFR是DNA、RNA及蛋白质等物质合成的其中一种关键酶。此外，DHFR也是抗代谢类抗肿瘤药物氨甲嘌呤(MTX)的靶酶。MTX是一种叶酸类似物，在临床上常用来治疗乳腺癌、急性白血病、淋巴瘤等多种肿瘤。其作用原理是通过竞争性与DHFR的活性位点紧密结合而使其失活，从而导致细胞中四氢叶酸含量下降，细胞DNA合成异常，造成细胞死亡。但是在治疗过程中一些肿瘤细胞很快对其产生耐药性，骨髓抑制的毒副作用也较严重、限制了其疗效。
[0005]DHFR基因的SNP是导致肿瘤细胞对MTX产生耐药的一种因素。虽然MTX可以竞争性地抑制DHFR，但是当MTX和DHFR亲和力下降时，MTX抑制该酶的作用就会明显下降。诸多研究表明在一些耐药细胞中，由于DHFR基因中第829号核苷酸会发生T代替C的突变，即产生CC型(野生纯合型)、CT型(杂合型)、TT型(突变纯合型)三种基因型，而后两者导致了 DHFR蛋白质结构的改变，进而影响DHFR与MTX结合的空间结构，最终引起DHFR和MTX亲和力的下降，提高了细胞的抗药性。吴瑞琼等将含突变mDHFR的逆转录病毒上清转染脐血CD34+细胞之 后进行细胞抗MTX分析，结果发现转导mDHFR耐药基因的脐血干细胞集落形成数明显高于对照组，同时对MTX的抗性提高了约2倍。另有资料显示将转导有人的突变mDHFR基因的小鼠骨髓移植到荷瘤小鼠后，再使用大剂量MTX治疗，结果表明转导有突变mDHFR基因的小鼠骨髓能耐受大剂量化疗的冲击治疗，并使44%的小鼠肿瘤完全消退，而对照组小鼠全部死亡。终上所述，正是由于DHFR中一个氨基酸的改变从而使细胞具有对MTX的耐受性。
[0006]因此，检测肿瘤患者中DHFR (C829T)的基因型，有助于临床医生制定更具针对性的个体治疗方案，获得较佳效果的同时也减轻患者的经济与身体负担。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于，提供一种DHFR的C829T单核苷酸多态性检测试剂盒，可用于检测DHFR(C829T)位点是否发生突变。
[0008]一种DHFR的C829T单核苷酸多态性检测试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、PCR试剂、单链纯化试剂和测序试剂，其特征在于:
PCR试剂包括特异性扩增引物SEQ N0.1、SEQ N0.2，其序列为:
SEQ N0.1:ACTAAGTGCTTCTCCAAGACC,
SEQ N0.2 =Biotin- AATGTCAAGGACTGGCAAGAG ；
测序试剂包括特异性测序引物SEQ N0.3，其序列为:
SEQ N0.3:AGTCCCCAGCACCTG。
[0009]进一步地，所述PCR 试剂包括 2*PCR BufferUOmM dNTP、5U/yl Taq 酶、特异性扩增引物SEQ N0.1和SEQ N0.2、灭菌水；所述单链纯化试剂包括链亲和素包被的磁珠、70%(V/V)乙醇、变性液、I XWash Buffer、结合缓冲液、退火缓冲液；所述测序试剂包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物APS、荧光素及dNTP。
[0010]所述试剂盒的使用方法包括如下步骤:
(1)提取样本中的DNA
(2)以DNA为模板， 依据所述的特异性扩增引物(SEQN0.1、SEQ N0.2)进行PCR扩增；
(3)将步骤(2)所得的PCR产物以所述的标记生物素的引物序列进行单链纯化；
(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行测序；
(5)结果分析。
[0011]进一步地，步骤(2)的PCR反应按以下条件进行扩增:94°C 2min预变性；98°C10s、58°C 30s,68°C 30s，40 个循环；68°C 5min。
[0012]步骤(3)单链纯化的具体步骤为:将得到的50 μ I PCR产物与3μ I 链亲和素包被的磁珠及47 μ I结合缓冲液混合,室温孵育l(Tl5min，期间震荡2~3次，然后使用Vaccuum prep tool吸取磁珠,将带有磁珠的Vaccuum prep tool先后放进70% (V/V)乙醇、变性液、IXWash Buffer中清洗IOs左右，再将Vaccuum prep tool放入含有49μ I 退火缓冲液及I μ I测序引物(SEQ Ν03)的96孔板中，释放磁珠，将该96孔板放置于80°C2min，再冷却至室温，即得到测序反应所需的单链纯化产物。
[0013]步骤(5)结果分析的具体方法是将测序结果与标准序列对比，得到DHFR (C829T)位点的碱基类型。DHFR 部分标准序列为:ACTCTTGTCTCTATCAGATA CCATTTATGAGACATTCTTGCTATAACTAAGTGCTTCTCCAAGACCCCAACTGAGTCCCCAGCACCTGCTACAGTGAGCTGCCATTCCACACCCATCACATGTGGCACTCTTGCCAGTCCTTGACATTGTCGGGCTTTTCACATGTTGGTAATATTTAT。其中下划线部分为829位点。
[0014]本发明的有益效果:目前，对于检测DHFR (C829T)多态性的最可靠的方法就是进行测序，而本发明通过特异性引物扩增目的区域，并利用焦磷酸测序分析鉴定多态性。该方法不但保证了一定的准确性及灵敏度，同时相对Sanger测序法具备了较短的检测周期，具有灵敏度高，操作简单、成本低等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是样本A测序图。测序结果为:CTA￡AGTGAG，该样本是CC型(野生型)，图中红框部分是样本A基因型的判断区。[0016]图2是样本B测序图。测序结果为:CTAC (T)AGTGAG,该样本是CT型(杂合型)，图中红框部分是样本B基因型的判断区。
[0017]图3是样本C测序图。测序结果为:CTAIAGTGAG，该样本是TT型(突变纯合型)，图中红框部分是样本C基因型的判断区。
[0018]图4飞分别是样本A、B、C的sanger测序图谱。目的是为验证图广3的结果，最终发现两种测序检测结果一致。
【具体实施方式】
[0019]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法:譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
[0020]实施例1 检测DHFR的C829T单核苷酸多态性检测试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、PCR试剂、单链纯化试剂和测序试剂，其中:
(i)PCR 扩增试剂:2氺PCR BufferUOmM dNTP、5U/ii I Taq 酶、扩增引物(SEQ N0.1、SEQ N0.2)及灭菌水；SEQ NOUSEQ NO 2的序列为:
SEQ N0.1:ACTAAGTGCTTCTCCAAGACC,
SEQ N0.2 =Biotin- AATGTCAAGGACTGGCAAGAG ；
(ii)单链纯化试剂:链亲和素bead、70%(V/V)乙醇、变性液、I X Wash Buffer、结合缓冲液、退火缓冲液；
(iii)测序试剂=DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物APS、荧光素及 dNTP CdNTP 即 dATP、dTTP、dCTP、dGTP)及测序引物(SEQ N0.3)。SEQ N0.3序列为:AGTCCCCAGCACCTGo
[0021]上述试剂盒的使用方法包括如下步骤:
(1)提取样本中的DNA
(2)以DNA为模板，依据所述的特异性扩增引物(SEQN0.USEQ N0.2)进行PCR扩增；
(3)将步骤(2)所得的PCR产物以所述的标记生物素的引物序列进行单链纯化；
(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行测序；
(5)结果分析。
[0022]通过几百例临床受检样本用本试剂盒中的引物(SEQ N0.1、SEQ N0.2、SEQ N0.3)进行实时荧光定量PCR，发现其具有较高的扩增稳定性、特异性、灵敏度；同时使用Sanger测序法对相同的受检样本进行测序，结果两类方法的检测结果完全一致，说明本试剂盒具有极高的检测准确性。
[0023]实施例2:
本发明试剂盒的具体使用方法:
1、DNA提取
I)抽取300 u I血液加入900 u I红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。1000Orpm离心I分钟(若离心机最高转速不允许,可3000rpm离心5min),吸去上清，留下白细胞沉淀，加200 Ul缓冲液GA，振荡至彻底混匀。[0024]2)加入20 U I蛋白酶K溶液，混匀后加入200 U I缓冲液GB，充分颠倒混匀，70°C放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
[0025]3)加人200 U I无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
[0026]4)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000 rpm (13, 400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
[0027]5)向吸附柱CB3中加入500 U I缓冲液⑶(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000 rpm (13，400 Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0028]6)向吸附柱CB3中加入700 U I漂洗液PW (使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000 rpm (13，400 Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0029]7)向吸附柱 CB3 中加入 500 U I 漂洗液 PW，12，000 rpm (13，400 X g)离心 30秒，倒掉废液。
[0030]8)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000 rpm(13, 400Xg)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0031]9)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加IOOu I洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12，000 rpm (13，400Xg)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
[0032]2、PCR 扩增
一例样本的总 PCR 体系为 50 ii I:2*PCR Buffer 25 u I UOmM dNTP IOu 1、引物 SEQN0.1 和 SEQ N0.2 各 1.75 ii I ,5U/u I Taq 酶 I y 1、灭菌水 9 y 1、DNA 模板 2.5 y I。
[0033]PCR 反应程序:94°C 2min 预变性；98°C 10s，58°C 30s，68°C 30s，38 个循环；68 °C 5min。
[0034]3、单链纯化
将得到的50 ill PCR产物与3 ill链亲和素磁珠(bead)及47 ill结合缓冲液混合，室温孵育l(Tl5min,期间震荡2~3次，以免bead下沉。然后使用Vaccuum prep workstation中的 Vaccuum prep tool 吸取 bead,将带有 bead 的 Vaccuum prep tool 先后放进 70%(V/V)乙醇、变性液(Denaturation Solution)、I Xffash Buffer 中清洗 10s 左右，再将 Vaccuumprep tool放入含有49 ii I退火缓冲液及Iyl测序引物(SEQ N03)的96孔板中，释放bead，将该96孔板放置于80°C 2min，再冷却至室温，即得到测序反应所需的单链纯化产物。
[0035]4、结果分析。
[0036]具体方法为:测序结果与标准序列对比，得到DHFR(C829T)位点的碱基类型。DHFR部分标准序列为:ACTCTTGTCTCTATCAGATACCAITTATGAGACAITCTT GCTATAACTAAGTGCTTCTCCAAGACCCCAACTGAGTCCCCAGCACCTGCTACAGTGAGCTGCCATTCCACACCCATCACATGTGGCACTCTTGCCAGTCCTTGACATTGTCGGGCTTTTCACATGTTGGTAATATTTATo 其中下划线部分为 829 位点。
[0037]实施例3 临床样品检测
取待检的临床样品A、B、C，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。
[0038]PCR产物纯化后进行测序，将所得序列与标准序列比对，判断结果。[0039]样品A的测序结果图如图1所示，测序结果为:CTA￡AGTGAG，该样本是CC型(野生型)，图中红框部分是样本A基因型的判断区。
[0040]样品B的测序结果图如图2所示，测序结果为:CTAC(T)AGTGAG,该样本是CT型(杂合型)，图中红框部分是样本B基因型的判断区。
[0041]样品C的测序结果图如图3所示,测序结果为:CTAIAGTGAG，该样本是TT型(突变纯合型)，图中红框部分是样本C基因型的判断区。
[0042]图4飞分别是样本A、B、C的sanger测序图谱。目的是为验证图广3的结果，最终发现两种测序检测结果一致。
【权利要求】
1.检测DHFR的C829T单核苷酸多态性的引物，其特征在于，所述引物包括特异性扩增引物SEQ N0.USEQ N0.2，其序列为:
SEQ N0.1:ACTAAGTGCTTCTCCAAGACC,
SEQ N0.2 =Biotin- AATGTCAAGGACTGGCAAGAG。
2.如权利要求1所述的检测DHFR的C829T单核苷酸多态性的引物，其特征在于，所述引物还包括特异性测序引物SEQ N0.3，其序列为:
SEQ N0.3:AGTCCCCAGCACCTG。
3.检测DHFR的C829T单核苷酸多态性的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)提取样本中的DNA (2)以DNA为模板，用特异性扩增引物(SEQN0.1、SEQ N0.2)进行PCR扩增；
SEQ N0.1:ACTAAGTGCTTCTCCAAGACC,
SEQ N0.2 =Biotin- AATGTCAAGGACTGGCAAGAG ； (3)将步骤(2)所得的PCR产物以所述的标记生物素的引物序列进行单链纯化； (4)将步骤(3)得 到的单链纯化产物进行测序，测序引物为SEQN0.3 ；
SEQ N0.3:AGTCCCCAGCACCTG ； (5)结果分析。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)的PCR反应按以下条件进行扩增:940C 2min 预变性；98°C 10s,58°C 30s,68°C 30s，40 个循环；68°C 5min。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)单链纯化的具体步骤为:将得到的50ul PCR产物与3ul链亲和素包被的磁珠及47ul结合缓冲液混合，室温孵育l(Tl5min，期间震荡2~3次,然后使用Vaccuum prep tool吸取磁珠,将带有磁珠的Vaccuum preptool先后放进70% (V/V)乙醇、变性液、IXWash Buffer中清洗IOs左右，再将Vaccuumprep tool放入含有49ul退火缓冲液及Iul测序引物(SEQ N0.3)的96孔板中，释放磁珠，将该96孔板放置于80°C 2min，再冷却至室温，即得到测序反应所需的单链纯化产物。
【文档编号】C12N15/11GK103695534SQ201310528732
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2012年9月10日 优先权日:2012年9月10日
【发明者】陈奕磊, 徐建成, 王淑一, 孙翠莲 申请人:济南艾迪康医学检验中心有限公司