一种提取景天科植物细胞液泡的方法

一种提取景天科植物细胞液泡的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提取景天科植物细胞液泡的方法，包括原生质体提取、液泡粗提和液泡纯化，所述液泡纯化包括：将粗提的液泡重悬于质量体积比浓度为0～5%的密度梯度介质溶液中，往该重悬液下层加入质量体积比浓度为7～10%的密度梯度介质溶液，进行密度梯度离心，获取纯化的液泡。本发明在进行液泡纯化时，先在离心管中利用浓度较小的密度梯度介质溶液重悬粗提液泡，再沿着离心管壁往离心管底部慢慢加入浓度较大的密度梯度介质溶液，此时离心管中溶液分为两层，然后再进行密度梯度离心，由此获得的液泡膜完整性高，液泡数量多，纯度高。
【专利说明】一种提取景天科植物細胞液泡的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物细胞液泡提取【技术领域】，具体涉及ー种提取景天科植物细胞液泡的方法。
【背景技术】
[0002]东南景天是中国本土发现的少数几种镉超积累植物之一，属景天科，对锌铅也有很强的耐性和积累能力，在我国重金属污染土壌植物修复领域具有很大的应用前景。对东南景天超积累特性和生理机制的研究，不仅能促进该植物在污染环境修复领域的直接应用，更有助于探明植物超积累重金属这ー现象，为推动污染土壌植物修复技术的改良与优化提供可靠理论基础。鉴于此，东南景天作为亚洲地区的ー种多金属积累特异植物，其相关研究已引起了不少国外同行 的关注。
[0003]前期研究发现，镉超积累植物东南景天根系可主动吸收镉，通过高效的运输系统转运到植物地上部并大量积累。作为ー种生物非必需元素，镉在普通植物细胞内过多积累通常会产生严重的毒害作用。可见，东南景天地上部必然存在着一套针对大量镉元素的稳态平衡机制。
[0004]通常认为，重金属在植物地上部的稳态网络调控有赖于特定细胞或细胞器(如细胞壁、液泡等)的区_作用(Sequestration)和某些有机化合物的螯合作用(Chelation)。
[0005]植物细胞中的液泡膜具有特殊的选择透性，使液泡具有高渗性质，引起水分向液泡内运动，对调节细胞渗透压、維持膨压有很大关系，并且能使多种物质在液泡内贮存和积累。有关东南景天的前期研究结果暗示，东南景天地上部对镉的超积累机制关键可能在于液泡的区隔作用。通过LA-1CP-MS和同步辐射XRF两种不同分析技术，对东南景天茎叶中镉的分布特征进行原位分析，皆表明镉的主要区隔场所是皮层、髓和叶肉组织等薄壁组织。可见，含大量液泡的薄壁细胞在东南景天对镉的区隔化过程中占主导地位，这与其他超积累植物上发现的镉主要存在于表皮细胞中大为不同，但还有待进ー步研究证实，而液泡的提取对进ー步明确液泡在超积累植物中对镉的区隔作用及其相关机理尤为重要。
[0006]液泡提取的方法一般包括裂解细胞提取原生质体，再裂解原生质体提取液泡。由于不同植物细胞的细胞结构有差异，且液泡的膜结构极易受外界环境影响而破裂，因此提取液泡的方法也不尽相同。对于遏蓝菜叶片的液泡的提取已有相关报道(Ma，J.F.，et al., Subcellular localisation of Cd and Zn inthe leaves of a Cd-hyperaccumulating ecotype of Thlaspi caerulescens.Planta, 2005.220(5):731-736)。但该方法在液泡纯化过程中，先将粗提液泡重悬于浓度较大的聚蔗糖溶液中，再在该重悬液的上层加ー层浓度较小的聚蔗糖溶液进行密度梯度离心，提取液泡的效率较低，甚至无法得到完整、纯度较高的液泡。

【发明内容】

[0007]本发明提供了一种提取景天科植物细胞液泡的方法，利用该方法能够简便有效地从景天科植物细胞提取到完整且纯度较高的液泡。
[0008]一种提取景天科植物细胞液泡的方法，包括原生质体提取、液泡粗提和液泡纯化，所述液泡纯化包括:
[0009]将粗提的液泡重悬于质量体积比浓度为0~5%的密度梯度介质溶液中，得到重悬液；往该重悬液下层加入质量体积比浓度为7~10%的密度梯度介质溶液，进行密度梯度离心，获取纯化的液泡。
[0010]密度梯度离心一般在容积较小的离心管中进行。 申请人:利用质量体积比浓度较小的密度梯度介质溶液重悬粗提液泡，再沿着离心管壁往离心管底部慢慢加入浓度较大的密度梯度介质溶液，此时离心管中溶液分为两层，然后再进行密度梯度离心，在两层溶液中会出现ー个粉红色层，该粉红色层内即为纯化的液泡。
[0011]与高浓度的密度梯度介质溶液(下层，粘度大)相比，重悬在低浓度的密度梯度介质溶液(上层，粘度小)中的液泡更易往两层密度梯度介质溶液的分界面聚集；并且，在高浓度的密度梯度介质溶液中，较难去除原生质体破裂时粘附在液泡表面的原生质体膜，难以获得纯度较高的液泡。
[0012]由于密度梯度离心在离心管中进行，当沿着离心管壁往底部慢慢加入下层密度梯度介质溶液时，该溶液与重悬液之间的接触面是由小变大的，使得两者之间的分界面较为清晰；假如先在离心管中加下层密度梯度介质溶液，再在上层加重悬液，两者之间的接触面从ー开始就较大，加液完成后两者之间的分界面稍嫌模糊，不利于液泡的纯化。
[0013]如未作特殊说明，本发明中，质量体积比浓度以g/100mL为单位，0~5%相当于
0~5g/100mL (0 ~50g/L)，7 ~10% 即相当于 7 ~10g/100mL (70 ~100g/L)。
[0014]本发明中，所述景天科植物细胞优选为薄壁组织细胞，更优选为叶肉组织细胞。薄壁组织角质化程度较低，预处理较为便捷。所述景天科植物优选为东南景天。便于为东南景天中镉的超积累机制提供技术手段。
[0015]具体地，本发明提取景天科植物细胞液泡的方法包括:
[0016](I)原生质体提取:取东南景天叶片，将其切成宽度为I~2mm的细条状后浸入细胞裂解液中，经裂解、过滤、离心清洗后获得原生质体；
[0017]优选取用幼嫩叶片进行切片，切片前先撕去叶片的上表皮或/和下表皮，再以与叶脉垂直的方向进行切片，以提高原生质体的提取效率。
[0018]所述细胞裂解液优选为由以下成分组成的水溶液:1-1.5% (w/v)纤维素酶，0.2-0.4% (w/v)离析酶，0.35~0.45M甘露醇，18~22mM氯化钾，18~22mM —水吗啉こ磺酸，8~12mM CaCl2氯化钙,4~6mM P -巯基こ醇；更优选为由以下成分组成的水溶液:1-1.5% (w/v)纤维素酶，0.2-0.4% (w/v)离析酶，0.4M甘露醇，20mM氯化钾，20mM—水吗啉こ磺酸，IOmM CaCl2氯化钙，5mMP -巯基こ醇。
[0019]离析酶用于将叶肉组织离析为单细胞，纤维素酶用于降解细胞壁，(6-巯基こ醇用于防止氧对原生质体的损伤，其他物质作为渗透压调节剂，維持原生质体内渗透压平衡，防止原生质体破裂。
[0020]裂解后经过滤除去叶肉组织，获得粗提的原生质体并对其进行离心清洗。离心清洗的转速优选为80~100g，时间优选为8~12min，温度优选为4~10°C ;离心清洗可视情况重复I~2次，低速低温的离心条件有利于使原生质体膜保持完整。[0021]离心清洗步骤应在原生质体保护液中进行，该原生质体保护液可采用以下成分配制:150~155mM氯化钠，120~125mM氯化钙，4~6mM氯化钾，I~2mM —水吗啉こ磺酸。
[0022](2)液泡粗提:采用原生质体裂解液裂解原生质体，离心后获得粗提的液泡，所述离心的转速为300~600g,时间为5~8min。
[0023]原生质体裂解时间优选为30~60min,更优选为30min。
[0024]所述原生质体裂解液优选为由以下成分组成的水溶液:0.45~0.46M甘露醇，
0.45~0.46mM乙二醇双(2-氨基乙基醚四こ酸)，0.90~0.91mM3_[ (3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸和18.18~18.19mM—水吗啉こ磺酸，113.60~113.70mM氯化钙，
4.50~4.60mM氯化钾；pH为8.0 ;更优选为:0.455M甘露醇，0.455mM乙二醇双(2-氨基こ基醚四こ酸)，0.909mM3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1_丙磺酸和18.182mM—水吗啉こ磺酸，113.64mM氯化钙，4.505mM氯化钾；pH为8.0。
[0025]3-[(3_胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸用作表面活性剂以使原生质体破裂，乙二醇双(2-氨基乙基醚四こ酸)用作与钙离子螯合，保持液泡内钙离子浓度在合适水平，其他物质用于維持液泡的渗透压平衡，防止液泡破裂。
[0026]作为优选，所述离心的转速为500~600g，时间为5~6min。对粗提液泡进行离心时也应在低温(4~10°C)条件下进行。为获得纯度较高的液泡，在进行液泡纯化前可用液泡保护液对粗提液泡进行I~2清洗，所述液泡保护液优选为由以下成分组成的水溶液:18~22mM —水吗啉こ磺酸，0.6~1.0M甘露醇，113.60~113.70mM氯化钙，4.50~
4.60mM氯化钾；pH8.0 ;更优选为由以下成分组成的水溶液:20mM—水吗啉こ磺酸，0.8M甘露醇，113.64mM氯化钙，4.55mM氯化钾；pH8.0。
[0027](3)液泡纯化:将粗提的液泡重悬于质量体积比浓度为0~5%的密度梯度介质溶液中，往该重悬液下层加入质量体积比浓度为7~10%的密度梯度介质溶液，进行密度梯度离心，获取纯化的液泡。
[0028]在上述浓度范围内，上层密度梯度介质溶液与下层密度梯度介质溶液中密度梯度介质的质量体积比浓度差相差越大，对液泡的纯化效果越好，优选上层密度梯度介质溶液不含密度梯度介质，而下层密度梯度介质溶液含10%的密度梯度介质。
[0029]上层密度梯 度介质溶液与下层密度梯度介质溶液的体积比没有要求，只要两层分界面清晰可见即可。
[0030]本发明中，所述密度梯度介质溶液为溶解有密度梯度介质的液泡保护液，所述液泡保护液的成分同上所述。
[0031]所述密度梯度介质可选用聚蔗糖、氯化铯或蔗糖。
[0032]优选地，所述密度梯度离心的转速为800~1500g，时间为5~45min ;更优选地，所述密度梯度离心的转速为1000~1500g，时间为10~30min。一般IOmin左右即可，离心效果欠佳时，可适当延长离心时间。
[0033]若无特殊说明，本发明中各溶液均采用超纯水配制。
[0034]与现有技术相比，本发明的有益效果体现在:
[0035]本发明在进行液泡纯化时，先在离心管中利用浓度较小的密度梯度介质溶液重悬粗提液泡，再沿着离心管壁往离心管底部慢慢加入浓度较大的密度梯度介质溶液，此时离心管中溶液分为两层，然后再进行密度梯度离心，由此获得的液泡膜完整性好，液泡数量多，纯度高。
【专利附图】

【附图说明】
[0036]图1为东南景天叶片经细胞裂解液处理后的状态图；
[0037]图2为提取的原生质体形态图；
[0038]图3为原生质体中液泡被染色的形态图；
[0039]图4为粗提液泡的形态图；
[0040]图5为实施例1液泡纯化结果图；
[0041]图6为实施例2液泡纯化结果图；
[0042]图7为实施例3液泡纯化结果图；
[0043]图8为实施例4液泡纯化结果图；
[0044]图9为实施例5 液泡纯化结果图；
[0045]图10为实施例6利用文献记载的原生质体裂解液裂解原生质体的结果图；
[0046]图11为实施例6利用文献记载的原生质体裂解液的6/5倍稀释液裂解原生质体的结果图；
[0047]图12为实施例7利用含2/3倍CHAPS的浓度的原生质体裂解液裂解原生质体的结果图；
[0048]图13为实施例1利用含4/3倍CHAPS的浓度的原生质体裂解液液裂解原生质体的结果图。
【具体实施方式】
[0049]实施例1
[0050]I溶液配制
[0051](I)细胞裂解液:15g纤维素酶，4g离析酶，72.88g甘露醇，1.49g氯化钾，4.264g一水吗啉こ磺酸，1.1lg氯化钙，0.39065g@-巯基こ醇，溶于超纯水中并定容至IL ；
[0052](2)原生质体保护液:0.1543g氯化钠，13.875g氯化钙，0.373g氯化钾，0.426g 一水吗啉こ磺酸，溶于超纯水中并定容至IL ；
[0053](3)原生质体裂解液:0.083g甘露醇，0.173g乙二醇双2_氨基乙基醚(EGTA)，
0.559g3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS )，3.876g—水吗啉こ磺酸，12.614g氯化钙，0.339g氯化钾，溶于950mL超纯水中，用2M的Tris溶液调节pH至8.0，再定容至IL ；；
[0054](4)液泡保护液:4.264g 一水吗啉こ磺酸，145.76g甘露醇，12.614g氯化钙，
0.339g氯化钾，溶于950mL超纯水中，用2M的Tris溶液调节pH至8.0，再定容至IL ;；
[0055](5)10%聚蔗糖溶液:10(^聚蔗糖-400，4.264g—水吗啉こ磺酸，145.76g甘露醇，12.614g氯化钙，0.339g氯化钾，溶于950mL超纯水中，用2M的Tris溶液调节pH至8.0，再定容至IL ；；
[0056](6)中性红溶液:0.1g中性红，200 ii L 1%的こ酸，50 ii L的氯仿，超纯水定容至
IOOmL，4 °C避光保存。
[0057]2液泡提取[0058](I)样品准备
[0059]取幼嫩的东南景天叶片4g，用镊子撕去其上表皮或者下表皮，用薄刀片以与叶脉垂直的方向将其切成宽度为I~2mm的细条状，备用。
[0060](2)原生质体提取
[0061]①取30mL细胞裂解液于50mL离心管中，50°C预热lOmin，转移至250mL可抽真空长颈瓶中冷却；
[0062]②将切好的细条状叶片浸入冷却至室温(25°C)的细胞裂解液中，抽滤IOmin后放置于恒温震荡箱(28-30°C)左右，45-65r/min震荡2_2.5h ；
[0063]③待细条状叶片基本呈白色透明漂浮在液面上时(图1)，用150目过滤膜将原生质体过滤到50mL离心管中，并用5mL原生质体缓冲液清洗长颈瓶和滤膜两次；
[0064]④将装有原生质体的离心管置于离心机(型号:beCkman j2_hs)中离心，转速80g，温度10°C,时间IOmin,弃上清；
[0065]⑤取30mL原生质体保护液重悬浮沉淀后再次离心，转速80g，温度10°C，时间lOmin，弃上清；所得沉淀即为浓度较高的原生质体(图2)。
[0066](3)液泡粗提
[0067]①取15mL原生质体裂解液重悬浮步骤(2)得到的原生质体，加入75 U L中性红溶液，轻微颠倒混匀3min, 对液泡进行染色(图3)；
[0068]②染色完成后静置离心管，使原生质体裂解30min，期间用5mL移液器反复吹打液面5~8次；
[0069]③将离心管置于离心机(型号:Thermo-S00264)离心，选择慢启动慢减速的3档或4档，转速600g，时间5min，温度I (TC，弃上清；
[0070]④取15mL液泡保护液重悬浮沉淀再次离心,选择慢启动慢减速的3档或4档,转速600g，时间5min，温度10°C，弃上清；所得沉淀即为粗提的液泡(图4)。
[0071]由图3可见原生质体内的液泡被中性红染成红色，红色液泡外围包裹叶绿体；由图4可见，经离心后大部分原生质体已裂解，可见边缘透明的红色液泡，有一部分破裂的原生质体膜仍粘附在液泡表面。
[0072](4)液泡纯化
[0073]①取IOmL液泡保护液重悬浮粗提的液泡,沿着离心管壁往底部慢慢加入10%聚鹿糖溶液2mL，这时离心管内形成了 2个分层；
[0074]②将离心管置于离心机(型号:Thermo_S00264)中，进行密度梯度离心，转速1500g，时间lOmin，温度10°C ;在重悬液与10%聚蔗糖溶液中间形成一粉红色层，取粉红色层液体镜检(图5)。
[0075]由图5可见，视野中仅见边缘透明的红色液泡，未见原生质体和其他杂质。
[0076]实施例2
[0077]利用与实施例1相同的方法和试剂进行液泡提取，但纯化液泡时在离心管底部加7%聚蔗糖溶液，进行密度梯度离心，取重悬液与7%聚蔗糖溶液中间的过渡层(未形成明显粉红色层)液体镜检，镜检结果见图6。
[0078]由图6可见，只有少量边缘透明的红色液泡，多数为原生质体或表面粘附有破裂原生质体膜的液泡，液泡纯化程度不高。[0079]实施例3
[0080]利用与实施例1相同的方法和试剂进行液泡提取，但纯化液泡时在离心管底部加4%聚蔗糖溶液，进行密度梯度离心，取重悬液与4%聚蔗糖溶液中间的过渡层(该层极不明显)液体镜检，镜检结果见图7。
[0081]图7中只见生质体或表面粘附有破裂原生质体膜的液泡，未见边缘透明的红色液泡。
[0082]实施例4
[0083]利用与实施例1相同的方法和试剂进行液泡提取，但纯化液泡时，采用又 献(Ma，J.F.，et al., Subcellular localisation of Cd and Zn in the丄eaves of a Cd-hyperaccumulating ecotype of Thlaspi caerulescens.Planta, 2005.220(5):731-736)中记载的，用2mL10%聚蔗糖溶液重悬浮粗提的液泡，再在重悬液上层加IOmL液泡保护液，然后进行密度梯度离心。对出现在重悬液和液泡保护液之间的粉红色层(该层不明显)液体镜 检，镜检结果见图8。
[0084]图8中可见少数原生质体，大部分为表面粘附有破裂原生质体膜的液泡，未见边缘透明的红色液泡。
[0085]实施例5
[0086]利用与实施例1相同的方法和试剂进行液泡提取，但纯化液泡时，先在离心管中加2mL10%聚蔗糖溶液，再取IOmL用液泡保护液重悬浮的粗提液泡，加到10%聚蔗糖溶液上层，然后进行密度梯度离心。对出现在重悬液和液泡保护液之间的粉红色层液体镜检，镜检结果见图9。
[0087]图9中可见少数原生质体，大部分为表面粘附有破裂原生质体膜的液泡，未见边缘透明的红色液泡。
[0088]实施例6
[0089]利用与实施例1相同的方法和试剂进行液泡提取，但粗提液泡吋，采用又 献(Ma，J.F.，et al., Subcellular localisation of Cd and Zn in the丄eaves of a Cd-hyperaccumulating ecotype of Thlaspi caerulescens.Planta, 2005.220(5):731-736)中记载的原生质体裂解液(配方为:0.5M甘露醇，ImMこ二醇双2-氨基乙基醚，0.5mM3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]_1_丙磺酸，20mM 一水吗啉こ磺酸，pH8.0)、该原生质体裂解液的6/5倍稀释液对原生质体进行裂解，对获得的粗提液泡进行镜检，镜检结果见图10、图11。
[0090]由图10可见，利用文献记载的原生质体裂解液裂解原生质体获得的粗提液泡，液泡膜有皱缩，说明还该原生质体裂解液浓度过大。
[0091]由图11可见，利用文献记载的原生质体裂解液的6/5倍稀释液裂解原生质体获得的粗提液泡，其数量较少，说明裂解程度不够。
[0092]实施例1中原生质体裂解液相当于文献记载配方的11/10倍稀释液，裂解程度适宜，且液泡不会产生皱缩。
[0093]实施例7
[0094]利用与实施例1相同的方法和试剂进行液泡提取，但粗提液泡时，采用的原生质体裂解液中CHAPS的浓度分别是实施例1原生质体裂解液的2/3倍和4/3倍，对获得的粗提液泡进行镜检，镜检结果见图12、图13。
[0095]由图12可见，利用含2/3倍CHAPS的浓度的原生质体裂解液对原生质体的裂解效果不佳，多数原生质体未裂解。
[0096]由图13可见，利用含4/3倍CHAPS的浓度的原生质体裂解液对原生质体的裂解作用太強，原生质体基本破裂，液泡也破碎了很多。
【权利要求】
1.一种提取景天科植物细胞液泡的方法，包括原生质体提取、液泡粗提和液泡纯化，其特征在于，所述液泡纯化包括: 将粗提的液泡重悬于质量体积比浓度为O~5%的密度梯度介质溶液中，得到重悬液；往该重悬液下层加入质量体积比浓度为7~10%的密度梯度介质溶液，进行密度梯度离心，获取纯化的液泡。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在干，将粗提的液泡重悬于质量体积比浓度为0%的密度梯度介质溶液中，往该重悬液下层加入质量体积比浓度为10%的密度梯度介质溶液，进行密度梯度离心。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述密度梯度介质溶液为溶解有密度梯度介质的液泡保护液，所述液泡保护液为由以下成分组成的水溶液:18~22mM—水吗啉こ磺酸，0.6 ~1.0M 甘露醇，113.60 ~113.70mM 氯化钙，4.50 ~4.60mM 氯化钾；pH8.0。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在干，所述密度梯度介质为聚蔗糖，氯化铯或蔗糖。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述密度梯度离心的转速为800~1500g，时间为5~45min。
6.如权利要求1~5任一所述的方法，其特征在于，采用原生质体裂解液裂解原生质体,离心后获得粗提的液泡,所述离心的转速为300~600g,时间为5~8min。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述原生质体裂解液为由以下成分组成的水溶液:0.45~0.46M甘露醇 ，0.45~0.46mM乙二醇双(2-氨基乙基醚四こ酸)，0.90~0.91mM3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸和18.18~18.19mM—水吗啉こ磺酸，113.60 ~113.70mM 氯化钙，4.50 ~4.60mM 氯化钾;pH 为 8.0。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，原生质体裂解时间为30~60min。
【文档编号】C12N5/04GK103589678SQ201310532489
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年10月31日 优先权日:2013年10月31日
【发明者】卢玲丽, 廖星程, 田生科, 谢若瀚, 韦燕燕 申请人:浙江大学