采用特异性引物pcr检测柴胡和狭叶柴胡的方法
【专利摘要】本发明提供了一种采用特异性引物PCR检测柴胡（北柴胡）和狭叶柴胡（南柴胡或红柴胡）的方法，其是基于柴胡、狭叶柴胡的ITS序列，设计出可快速检测柴胡、狭叶柴胡的特异性引物，并在此基础上建立了PCR检测体系，分别扩增出336bp和407bp的PCR片段，为柴胡、狭叶柴胡的药材鉴别提供了分子鉴定依据，可从多种中成药（蜜丸、水蜜丸）及药材中快速、准确地检测出是否含有柴胡或狭叶柴胡。根据该方法构建的检测试剂盒具有操作简便、特异性好、灵敏度高、无需测序等优点，可实现对柴胡、狭叶柴胡的茎、叶或植物其它部位以及药材和中成药（蜜丸、水蜜丸）的检测。
【专利说明】采用特异性引物PCR检测柴胡和狭叶柴胡的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及柴胡和狭叶柴胡的分子生物学检测，具体地说，涉及一种采用特异性引物PCR检测柴胡和狭叶柴胡的方法。
【背景技术】
[0002]柴胡，为伞形科(Umbelliferae)芳:亚科(Apioideae)柴胡属(BupleurumL.)植物，始载于《神农本草经》，列为上品，是我国常用的大宗中药材。味辛、苦，性微寒，归肝、胆、肺经，具有疏散退热、疏肝结语、升举阳气的功效，用于治疗感冒发热、寒热往来、胸胁胀痛、月经不调、子宫脱垂，脱肛等症。《中国药典》(2010版)收载的柴胡为柴胡(Bupleurumchinense DC.)、狭叶柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Willd.)的干燥根。现代药理研究表明，具有解热、抗炎、抗病毒、抗细菌内毒、抗肿瘤、保肝、降血脂、抗惊厥、提高免疫力等功效。柴胡在中药制药等方面有重要应用，其内含有皂苷、挥发油、多糖、黄酮类、柴胡醇等多种成分，在解热、抗病毒、提高免疫力等方面效果明显。但柴胡属植物种类繁多，全球有120种，我国有40种17变种，仅供药用的柴胡属植物就有近30种。而且遍布全国各地有很多的习用品以及混伪品，如西北地区已开发5种柴胡，云南也发展了 8种柴胡属植物为药用。
[0003]由于柴胡及狭叶柴胡的近似种以及混伪品过多，针对柴胡的基源和药材进行过深入的研究。传统的鉴定方法包括:基源鉴定、性状鉴定、显微鉴定以及理化鉴定等，现代的鉴别方法包括色谱法、质谱法、核磁共振法、差热分析法、扫描电镜技术、电泳等。柴胡及狭叶柴胡与柴胡属内其它种性状相似，形态学以及一些理化方法很难准确的鉴别其基源。而随着现代分子生物学研究的深入和发展，一些分子标记技术如限制性片段长度多态性(RFLP)分析、随机扩增多态DNA (RAPD)分析、间断简单序列重复(ISSR)标记、扩增片段长度多态性(AFLP)分析等技术得到了广泛的应用，但它们也存在着很多的不足。RFLP技术稳定、重复性强，但探针制备繁琐；RAPD方法可以很好的解释亲缘物种间的演化关系，但不稳定，受实验条件限制较大；ISSR标记具有`快速、简便、多态性高等优点，但其引物通用性差、扩增条件等需要针对性的设计；AFLP技术将RFLP和PCR技术完美结合，但其稳定性较差，且对操作者要求高、花费大。
[0004]本发明结合以上方法和技术的优点，依据分子标记技术的原理和原则，设计出一个特异性的引物，目的是提出一种特异性鉴定柴胡和狭叶柴胡的分子鉴别方法，为柴胡和狭叶柴胡的药材、中成药(蜜丸、水蜜丸)鉴定提供分子水平依据，并希望得到广泛的实际应用推广。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种可快速、准确地检测柴胡和狭叶柴胡的特异性引物及含有该引物的试剂盒。
[0006]本发明的另一目的是提供采用上述特异性引物PCR检测柴胡和狭叶柴胡的方法。[0007]为了实现本发明目的,本发明提供的一种柴胡(Bupleurum chinense DC.)的PCR检测特异性引物对，其包括上游引物上游引物Fl: 5’ -ATGCCTCCGCCCCGTTTGG-3，和下游引物Rl:5’ -TGCGTTTTCC GATCTCCGGT-3’。
[0008]为了实现本发明目的，本发明提供的一种狭叶柴胡(Bupleurumscorzonerifolium Willd.)的PCR检测特异性引物对，其包括上游引物F2:5^ -TGTCGTCGGCCTCGGCCTG-3’ 和下游引物 R2:5’ -ACGACGAGGCACGGGAGGT-3’。
[0009]本发明还提供含有上述PCR引物对的用于检测柴胡和狭叶柴胡的试剂盒。 [0010]前述试剂盒中还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液。
[0011 ] 更优选地，前述试剂盒还包括标准阳性模板。
[0012]本发明还提供所述试剂盒在检测柴胡和狭叶柴胡中的应用。
[0013]本发明进一步采用上述特异性引物PCR检测柴胡(或狭叶柴胡)的方法，包括以下步骤:
[0014]I)提取样品中的DNA ；
[0015]2)以步骤I)中提取的DNA为模板，使用上述引物Fl-Rl (或F2-R2)，进行PCR扩增反应；
[0016]3)分析PCR产物，即对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳检测结果判定样品中是否含有柴胡(或狭叶柴胡)。
[0017]其中，PCR扩增反应体系以25 μ I计为:
[0018]
模板DNA3 μL
ΙΟμΜ 引物 Fl (或 F2)I μ?
ΙΟμΜ 引物 Rl (或 R2)1 μΙ
2 X Easy Taq PCR SupcrMix12.5 μ?^
CidH2O7 VL
[0019]PCR 反应条件为:93 V 5min ；93 V 30s, 60 V 30s, 72 V 30s,共 35 个循环；72°C 5minn, 10°C IOmin0
[0020]扩增反应结束后，若电泳检测结果分别出现约336bp (或407bp)的DNA条带，则该样品中分别含有柴胡(或狭叶柴胡)。
[0021]本发明基于柴胡和狭叶柴胡的ITS序列，设计出可快速检测柴胡和狭叶柴胡的特异性引物，并在此基础上建立了 PCR检测体系，为柴胡和狭叶柴胡的鉴别提供了分子鉴定依据，可从多种药材、中成药(蜜丸、水蜜丸)中快速、准确地检测出柴胡和狭叶柴胡。根据该方法构建的检测试剂盒操作简便，特异性好，灵敏度高，可实现对柴胡、狭叶柴胡的茎、叶或植物其它部位，药材以及中成药的检测，适于广泛的推广使用。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1是利用柴胡和狭叶柴胡的ITS序列扩增条带的琼脂糖凝胶电泳图，其中:1为柴胡条带，336bp ；2为狭叶柴胡条带，407bp ;M为DNA marker, 2000bp ；K为阴性对照。
[0023]图2是利用柴胡Fl-Rl引物和狭叶柴胡F2-R2引物所扩增条带的琼脂糖凝胶电泳图，其中:1-5号是DNA稀释浓度为1.811,0.905,0.603,0.452,0.362ng/ μ I的柴胡条带，336bp ；6-9号是DNA稀释浓度为0.993,0.496,0.331,0.248ng/ μ I的狭叶柴胡条带，407bp ；M 为 DNA marker, 2000bp ；K 为阴性对照。
[0024]图3是利用柴胡Fl-Rl引物所扩增条带的琼脂糖凝胶电泳图，其中:1_5号是对应表1中1-5号药材的柴胡DNA扩增条带，336bp ；M为DNA marker, 2000bp ；K为阴性对照。
[0025]图4是利用柴胡Fl-Rl引物和狭叶柴胡F2-R2引物所扩增条带的琼脂糖凝胶电泳图，其中:1_5号是对应表2中成药的柴胡DNA扩增条带，336bp ；6-10号是对应表2中成药的狭叶柴胡DNA扩增条带，没有扩增成功；M为DNA marker, 2000bp ；K为阴性对照。
【具体实施方式】
[0026] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0027]若未特别指明，以下实施例均按照常规实验条件，如SambiOOk等分子克隆实验手册(New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件；所用原料均为市售商品。
[0028]实施例1用于检测柴胡和狭叶柴胡的PCR引物的合成
[0029]从GenBank中共获得柴胡、狭叶柴胡等柴胡属ITS序列12条，利用生物学软件DNAMAN version4.0对比上述序列，找出柴胡、狭叶柴胡所有不同于其他种的变异位点。根据变异位点的位置，分别在ITS序列的上、下游各设计约20个碱基的引物；利用生物学软件Primer5.0对设计的引物进行分析，最终分别确定柴胡合适的引物对，上游引物 Fl: 5 ’ -ATGCCTCCGCCCCGTTTGG-3，和下游引物 Rl: 5 ’ -TGCGTTTTCC GATCTCCGGT-3，；狭叶柴胡合适的引物对，上游引物F2:5’ -TGTCGTCGGCCTCGGCCTG-3’和下游引物R2:5，-ACGACGAGGCACGGGAGGT-3，。
[0030]引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
[0031]实施例2利用PCR引物检测柴胡的特异性和灵敏度分析
[0032]1.1样本来源
[0033]本实施例中采用的药材样品有:柴胡，采自山西浑源。
[0034]1.2DNA 提取
[0035]将上述样品，每个样品取约60mg，用液氮研磨成粉末，利用试剂盒法提取DNA。试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司，型号为=CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒(货号:DN14)，50 次。
[0036]1.3样品DNA的梯度稀释
[0037]检测上述提取的柴胡药材的DNA浓度，为181.1ng/μ I。将DNA样品进行梯度稀释，稀释后的浓度为 1.811,0.905,0.603,0.452,0.362ng/μ 1，于 _20°C保存备用。
[0038]1.4PCR 反应
[0039]反应体系(25μ I):
[0040]
【权利要求】
1.柴胡(Bupleurumchinense DC.)的PCR检测特异性引物对,特征在于其是:
2.狭叶柴胡(Bupleurumscorzonerifolium Willd.)的PCR检测特异性引物对,特征在于其是:
3.含有权利要求1所述引物对的用于检测柴胡的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+和PCR反应缓冲液。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
6.采用权利要求1所述的特异性引物PCR检测柴胡的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)提取样品中的DNA； 2)以步骤I)中提取的DNA为模板，使用权利要求1所述的引物Fl和R1，进行PCR扩增反应； 3)用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，确认是否为柴胡。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR扩增反应体系以25μ L计为:
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为:93°C5min ；93°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s，共 35 个循环；72°C 5minn, 10°C IOmin0
9.权利要求3-5任一项所述的试剂盒在检测柴胡中的应用。
10.含有权利要求2所述引物对的用于检测柴胡的试剂盒。
【文档编号】C12Q1/68GK103571956SQ201310533200
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月1日 优先权日:2013年11月1日
【发明者】张福生, 薛英, 李晓伟, 秦雪梅, 张丽增, 邢婕 申请人:山西大学