一种季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物及其制备，所述修饰物由SOD分子上的自由氨基与TMC分子的氨基通过二硫键结合；一分子SOD分子与1～20分子TMC结合。本发明还涉及该季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物的制备方法。本发明所述的TMC-SOD修饰物与天然SOD相比，保留了SOD分解超氧阴离子的活性，整合了TMC的良好特性，使其具有稳定性高、半衰期长、免原性低的特性，具有更好的使用效果和应用范围。
【专利说明】一种季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物及其制备
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物及其制备，属于生物医药【技术领域】。
【背景技术】
[0002]超氧化物歧化酶(S0D)是一类重要的超氧阴离子自由基清除剂，可用于防治过量超氧阴离子自由基引起的疾病和机体损伤，如辐射损伤、缺血再关注损伤、自身免疫性疾病等。但天然来源的超氧化物歧化酶存在有一定的抗原性、体内半衰期短和稳定性差等缺点，限制了其应用。对其分子进行化学修饰是克服超氧化物歧化酶缺点的有效方法，常采用的修饰剂有聚乙二醇(PEG)、右旋糖苷、低分子肝素、壳聚糖等，修饰后的S0D免疫原性降低、体内半衰期延长、稳定性增加。
[0003]壳聚糖是目前发现的自然界存在的唯一一种阳离子多糖，具有清除自由基，抗炎等作用，季铵化能改善其水溶性并进一步提高其带正电荷的能力。Liu JF等(参见Journalof drug targeting, 2009.17 (3): 216-224.)采用 1-(3- 二甲氨基丙基)~3~ 乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HC1)缩合法使季铵化壳聚糖(TMC)的自由氨基与S0D分子的羧基形成酰胺键得修饰产物，研究表明TMC修饰的S0D衍生物具有稳定性高、体内半衰期长和显著的细胞靶向性等优点，是一种有研究和开发价值的S0D衍生物。
[0004]但由于S0D分子羧基数量较少导致反应效率较低，同时修饰物活性保持率不够高，制约了季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物的应用。
【发明内容】
[0005]针对现有技术的不足，本发明提供一种季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶(TMC-S0D)修饰物，并提供该修饰物的制备方法。
[0006]术语说明
[0007]自由氨基:伯胺基团(即一NH2)，亦称一级胺基。
[0008]季铵化壳聚糖:壳聚糖的葡萄糖胺的自由氨基全部或部分被季铵基团(一N(CH3)3+)取代得到的衍生物。
[0009]本发明的技术方案如下:
[0010]一种季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物，是超氧化歧化酶(S0D)分子上的自由氨基与季铵化壳聚糖(TMC)分子的氨基通过二硫键结合，一分子超氧化歧化酶(S0D)与1~20分子铵化壳聚糖(TMC)结合，结构式如下:
[0011]-S0D-S-S-(TMC)η ；
[0012]式中，η=1~20 ；S0D的分子量为32000Da ；TMC的分子量为2000Da以上，自由氨基摩尔含量为5%~80%。
[0013]优选的，所述n=l~6，即一分子S0D与1~6分子TMC共价结合形成修饰物；TMC的分子量为5000Da~100000Da，自由氨基摩尔含量为15%~50%。[0014]一种季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物的制备方法，包括如下步骤:
[0015](1)称取季铵化壳聚糖(TMC)溶于10mM PBS缓冲液，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，制得季铵化壳聚糖溶液，加入3- (2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(STOP)，使季铵化壳聚糖中自由氨基与3- (2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为(1~100): 1，震荡反应，除去未反应的3- (2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和中间产物，制得TMC功能化产物；
[0016](2)将超氧化歧化酶溶于10mM PBS缓冲液，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，制得超氧化歧化酶溶液，加入3- (2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)，使超氧化歧化酶与3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1:(0.1~50)，震荡反应，除去未反应的3- (2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和中间产物，制得活化的SOD ；
[0017](3)取步骤(1)制得的TMC功能化产物溶液，加入二硫苏糖醇(DTT)，室温震荡反应，除去过量的二硫苏糖醇和中间产物，得到巯基活化的TMC (TMC-SH)，然后，加入步骤(2)制得的活化的S0D，使TMC功能化产物与活化的S0D的摩尔比为(0.5~20): 1，置于10mMPBS缓冲液中，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，0~60°C保温反应lh~48h，经纯化后，制得季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物。
[0018]所述的TMC可按照现有技术制备。如参见Eur J Pharm Biopharm, 2004, 57:77-83,具体制备方法如下:
[0019]取1.0g壳聚糖 ，2.4g Na1、10mll5%Na0H加入40ml N_甲基吡咯烷酮，60°C搅拌保温20min。然后加入6ml CH31,60°C通氮气避光搅拌回流15min~90min以得到自由氨基含量不同的TMC。反应液用无水乙醇沉淀，真空干燥，用Dowex阴离子交换树脂柱进行离子交换，收集样品峰，并及时用稀盐酸将收集得到的样品调至中性，冷冻干燥得TMC，NMR测定其季铵化度。
[0020]优选的，
[0021]所述步骤(1)中的季铵化壳聚糖溶液中季铵化壳聚糖的浓度为3mg/ml~20mg/ml，季铵化壳聚糖中自由氨基与3- (2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为(4 ~12): 1。
[0022]所述步骤(1)和步骤(2)中的震荡反应的温度为室温，反应时间为lh。
[0023]所述步骤(1)和步骤(2)中除去未反应的SPDP和中间产物的方法为凝胶过滤柱层析或膜分离技术。
[0024]所述步骤(2)中的超氧化歧化酶溶液中超氧化歧化酶的浓度为0.5mg/ml~5mg/ml，超氧化歧化酶与3- (2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1: (1~15)。
[0025]所述步骤(3)中的二硫苏糖醇(DTT)按摩尔量计为步骤(1)中季铵化壳聚糖中自由氨基的0.5~3倍；进一步优选的，所述步骤(3)中TMC功能化产物与活化的S0D的摩尔比为(1~10): 1。
[0026]所述步骤(3)中的室温震荡反应时间为30min ;除去过量的二硫苏糖醇和中间产物的方法为凝胶过滤柱层析或膜分离技术。
[0027]所述步骤(3)中的保温反应温度为30°C~40°C，时间为10h~20h ;所述的纯化为采用弱阴离子交换柱层析纯化。
[0028]本发明一种季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物的制备方法，优选的制备步骤如下:
[0029](1)称取季铵化壳聚糖(TMC)50mg溶于10mM PBS缓冲液中，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，制得季铵化壳聚糖溶液，TMC的浓度为5.0mg/ml ;加入3_( 2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SH)P)3.5mg,室温反应lh，采用1.6cmX50cm的S印hadexG-10葡聚糖凝胶色谱柱除去未反应的SPDP和中间产物，用10mM的PBS缓冲液洗脱，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，流速为1.0ml/min，制得TMC功能化产物；
[0030](2)将超氧化歧化酶(SOD)溶于10mM PBS缓冲液中，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，制得超氧化歧化酶溶液，超氧化歧化酶的浓度为lmg/ml (0.03125 μ mol/ml);将30 μ 1 SPDP溶液加入到35ml超氧化歧化酶溶液中，温室下震荡反应lh ;采用
1.6cmX 50cm的Sephadex G-10葡聚糖凝胶色谱柱除去未反应的SPDP和中间产物，用10mM的PBS缓冲液洗脱，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，流速为1.0ml/min，制得活化的SOD ；
[0031](3)取步骤(1)制得的含TMC功能化产物50mg溶液，加入25mg 二硫苏糖醇(DTT)，室温震荡反应30min,采用1.6cmX50cm的Sephadex G-10葡聚糖凝胶色谱柱除去未反应的SPDP和中间产物，用10mM的PBS缓冲液洗脱，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，流速为1.0ml/min，得到巯基活化的TMC(TMC-SH)，加入步骤(2)制得的活化的SOD溶液，使TMC功能化产物与活化的SOD的摩尔比为3: 1，置于10mM PBS缓冲液中，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，40°C保温反应16h，产物经DEAE Sepharose FF离子交换柱层析纯化，于10mM PBS缓 冲液中以0至1.0M NaCl线性梯度洗脱，收集样品峰制得季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物。
[0032]以上制备方法中没有特别说明的均按照现有技术。
[0033]有益效果
[0034]本发明的TMC-S0D修饰物与天然SOD相比，保留了 S0D分解超氧阴离子的活性，整合了 TMC的良好特性，使其具有稳定性高、半衰期长、免原性低的特性，具有更好的使用效果和应用范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1是实施例3的季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物的Native-PAGE电泳鉴定结果;
[0036]其中，泳道1、TMC与S0D的混合物；泳道2、TMC-S0D修饰物；泳道3、天然S0D ;泳道 4、TMC。
[0037]图2是TMC-S0D修饰物与天然S0D的性能比较柱状图；
[0038]其中，纵坐标为酶比活，单位为U/mg蛋白质，横坐标为不同的处理方式。
【具体实施方式】
[0039]为了更好地说明本发明的内容，下面将描述本发明的几个实施例，但这些实施例绝不是对本发明的任何限制。[0040]原料来源
[0041]壳聚糖，普通市售产品，粘均分子量5k_20kDa ；
[0042]超氧化歧化酶，普通市售产品。
[0043]实施例1
[0044]季铵化壳聚糖的制备
[0045]取1.0g壳聚糖，2.4g Na1、10mll5%Na0H加入40ml N_甲基吡咯烷酮，60°C搅拌保温20min。然后加入6ml CH3I，60°C通氮气避光搅拌回流40min。反应液用无水乙醇沉淀，真空干燥，用Dowex阴离子交换树脂柱进行离子交换，用蒸馏水进行洗脱，收集样品峰，并用稀盐酸将收集得到的样品调至中性，冷冻干燥制得TMC/H NMR测定其季铵化度，1H-NMR上季铵基团甲基氢信号位位于3.3ppm左右，而叔胺甲基氢信号位位于3.0ppm左右。根据各氢信号的比例计算其自由氨基含量为32.2%。
[0046]实施例2
[0047]一种季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物的制备方法，制备步骤如下:
[0048](1)称取自由氨基含量为32.2%的季铵化壳聚糖(TMC) 50mg溶于10mM PBS缓冲液中，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，制得季铵化壳聚糖溶液，TMC的浓度为5.0mg/ml ;加入3- (2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(STOP) 3.5mg(NH2:SPDP=8:1),室温反应lh,采用1.6cmX50cm的Sephadex G-10葡聚糖凝胶色谱柱除去未反应的SPDP和中间产物，用10mM的PBS缓冲液洗脱，PBS缓冲液中含有质量百分比为
0.9%的NaCl，流速为1.0ml/min,制得TMC功能化产物；
[0049](2)将超氧化歧化酶(S0D)`溶于10mM PBS缓冲液中，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，制得超氧化歧化酶溶液，超氧化歧化酶的浓度为lmg/ml (0.03125 μ mol/ml);将30μ1 SPDP溶液加入到35ml超氧化歧化酶溶液中(SOD: SH)P=1:3)，温室下震荡反应lh ;采用1.6cmX50cm的Sephadex G_10葡聚糖凝胶色谱柱除去未反应的SPDP和中间产物，用10mM的PBS缓冲液洗脱，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，流速为
1.0ml/min,制得活化的S0D ；
[0050](3)取步骤(1)制得的含TMC功能化产物50mg的溶液，加入25mg 二硫苏糖醇(DTT),室温震荡反应30min,采用1.6cmX 50cm的Sephadex G_10葡聚糖凝胶色谱柱除去未反应的SPDP和中间产物，用10mM的PBS缓冲液洗脱，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，流速为1.0ml/min，得到巯基活化的TMC(TMC-SH)，加入步骤(2)制得的活化的S0D溶液，使TMC功能化产物与活化的S0D的摩尔比为3: 1，置于10mM PBS缓冲液中，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，40°C保温反应16h，产物经DEAE Sepharose FF离子交换柱层析纯化，于10mM PBS缓冲液中以0至1.0M NaCl线性梯度洗脱，收集样品峰制得季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物。
[0051]采用Native-PAGE电泳鉴定，结果如图1所示，表明绝大部分S0D均通过_S_S被TMC修饰，S0D分子的修饰率大于85%。
[0052]实施例3
[0053]一种季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物的制备方法，制备步骤如下:
[0054](1)称取自由氨基含量为32.2%的季铵化壳聚糖(TMC) 50mg溶于10mM PBS缓冲液中，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，制得季铵化壳聚糖溶液，TMC的浓度为5.0mg/ml ;加入3- (2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(STOP) 1.5mg(ΝΗ2:5Η)Ρ=18:1),室温反应lh,采用1.6cmX50cm的Sephadex G-10葡聚糖凝胶色谱柱除去未反应的SPDP和中间产物，用10mM的PBS缓冲液洗脱，PBS缓冲液中含有质量百分比为
0.9%的NaCl，流速为1.0ml/min,制得TMC功能化产物；
[0055](2)将超氧化歧化酶(SOD)溶于10mM PBS缓冲液中，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，制得超氧化歧化酶溶液，超氧化歧化酶的浓度为2mg/ml (0.0625 μ mol/ml);将30μ1 SPDP溶液加入到5ml超氧化歧化酶溶液中(SOD: SH)P=1:10)，温室下震荡反应lh ;采用1.6cmX50cm的Sephadex G_10葡聚糖凝胶色谱柱除去未反应的SPDP和中间产物，用10mM的PBS缓冲液洗脱，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，流速为
1.0ml/min,制得活化的SOD ；
[0056](3)取步骤(1)制得的含TMC功能化产物50mg的溶液，加入15mg 二硫苏糖醇，室温震荡反应30min,采用1.6cmX 50cm的Sephadex G-10葡聚糖凝胶色谱柱除去未反应的SPDP和中间产物，用10mM的PBS缓冲液洗脱，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，流速为1.0ml/min，得到巯基活化的TMC (TMC-SH)，加入步骤(2)制得的活化的S0D，使TMC功能化产物与活化的SOD的摩尔比为7: 1，置于10mM PBS缓冲液中，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，40°C保温反应16h，产物经DEAE Sepharose FF离子交换柱层析纯化，于10mM PBS缓冲液中以0至1.0M NaCl线性梯度洗脱，收集样品峰制得季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物。
[0057]采用Native-PAGE电泳鉴定，表明绝大部分S0D均通过_S_S被TMC修饰，S0D分子的修饰率大于70%。
[0058]实施例4
[0059](1)称取自由氨基含量为17.6%的季铵化壳聚糖(TMC) 50mg溶于10mM PBS缓冲液中，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，制得季铵化壳聚糖溶液，TMC的浓度为
5.0mg/ml ;加入3-(2-吡啶二巯基)丙酸^羟基琥珀酰亚胺酯(3?0?)511^(順2:3?0?=3:1)，室温反应lh,采用1.6cmX50cm的Sephadex G-10葡聚糖凝胶色谱柱除去未反应的SPDP和中间产物，用10mM的PBS缓冲液洗脱，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，流速为1.0ml/min,制得TMC功能化产物；
[0060](2)将超氧化歧化酶(SOD)溶于10mM PBS缓冲液中，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，制得超氧化歧化酶溶液，超氧化歧化酶的浓度为lmg/ml (0.03125 μ mol/ml);将30μ1 SPDP溶液加入到35ml超氧化歧化酶溶液中(SOD: SH)P=1:3)，温室下震荡反应lh ;采用1.6cmX50cm的Sephadex G-10葡聚糖凝胶色谱柱除去未反应的SPDP和中间产物，用10mM的PBS缓冲液洗脱，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，流速为1.0ml/min,制得活化的SOD ；
[0061](3)取步骤(1)制得的含TMC功能化产物50mg，加入15mg 二硫苏糖醇(DTT)，室温震荡反应30min,采用1.6cmX 50cm的Sephadex G-10葡聚糖凝胶色谱柱除去未反应的SPDP和中间产物，用10mM的PBS缓冲液洗脱，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，流速为1.0ml/min，得到巯基活化的TMC (TMC-SH)，加入步骤(2)制得的活化的S0D，使TMC功能化产物与活化的SOD的摩尔比为5: 1，置于10mM PBS缓冲液中，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，40°C保温反应16h，产物经DEAE Sepharose FF离子交换柱层析纯化，于10mM PBS缓冲液中以0至1.0M NaCl线性梯度洗脱，收集样品峰制得季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物。
[0062]采用Native-PAGE电泳鉴定，表明绝大部分SOD均通过_S_S被TMC修饰，S0D分子的修饰率大于50%。
[0063]对比例
[0064]采用现有的EDC缩合法制备季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物
[0065]称取上述实施例2所用的TMC200mg、S0D40mg,分别溶于ρΗ7.4的(λ lmol/L的Na2HP04-NaH2P04缓冲液10ml中，将TMC溶液缓慢加入到S0D溶液中，在25°C缓慢搅拌反应，于30min分别加入EDC.HC148mg, 4°C暗处反应过夜,4°C透析，DEAE Sepharose FF纯化。
[0066]Native-PAGE电泳鉴定表明S0D分子的修饰率仅为30%。
[0067]试验例
[0068]TMC-S0D修饰物与天然S0D性能比较
[0069]活性测定采用国际通用的"连苯三酚自氧化法，实验过程如下:
[0070]向多个试管中加入pH8.2、50mmol/L Tris-HCl缓冲液，并在25°C水浴20min，然后分别向各试管中加入25°C的50mmol/L的连苯三酚，在对照管加入等量10mmol/L的HC1。混匀后，迅速进行紫外分光光度检测，在反应前4min，每隔30s读一次A325nm数值，调整连苯三酚加入量将其自氧化速度控制为0.07A/min。
[0071]样品酶活测定时，先在各盛有缓冲液的试管内加入预热至25°C的样品溶液，然后按上述方法操作。通过调整样品加入量将连苯三酚自氧化速度控制在30%~70%之间，将
最终测得的数据代入下列公式计算酶活性:
[0072]
【权利要求】
1.一种季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物，其特征在于，是超氧化歧化酶(SOD)分子上的自由氨基与季铵化壳聚糖(TMC)分子的氨基通过二硫键结合，一分子超氧化歧化酶(SOD)与1~20分子铵化壳聚糖(TMC)结合，结构式如下:
-SOD-S-S-(TMC)η ； 式中，η=1~20 ；S0D的分子量为32000Da ；TMC的分子量为2000Da及以上，自由氨基摩尔含量为5%~80%。
2.如权利要求1所述的季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物，其特征在于，所述n=l~6，即一分子超氧化歧化酶与1~6分子季铵化壳聚糖共价结合形成修饰物；季铵化壳聚糖的分子量为5000Da~lOOOOODa，自由氨基摩尔含量为15%~50%。
3.一种季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)称取季铵化壳聚糖(TMC)溶于10mMPBS缓冲液，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，制得季铵化壳聚糖溶液，加入3- (2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)，使季铵化壳聚糖中自由氨基与3- (2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为(1~100): 1，震荡反应，除去未反应的3- (2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和中间产物，制得TMC功能化产物； (2)将超氧化歧化酶溶于10mMPBS缓冲液，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，，制得超氧化歧化酶溶液，加入3-( 2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)，使超氧化歧化酶与3- (2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1: (0.1~50)，震荡反应，除去未反应的3- (2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和中间产物，制得活化的SOD ；` (3)取步骤(1)制得的TMC功能化产物，加入二硫苏糖醇(DTT)水溶液，室温震荡反应，除去过量的二硫苏糖醇和中间产物，得到巯基活化的TMC (TMC-SH)，然后，加入步骤(2)制得的活化的S0D，使TMC功能化产物与活化的SOD的摩尔比为(0.5~20): 1，置于10mMPBS缓冲液中，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，，0~60°C保温反应lh~48h，经纯化后，制得季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物。
4.如权利要求3所述的季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物，其特征在于，所述步骤(1)中的季铵化壳聚糖溶液中季铵化壳聚糖的浓度为3mg/ml~20mg/ml，季铵化壳聚糖中自由氨基与3- (2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为(4~12): 1。
5.如权利要求3所述的季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(2)中的震荡反应的温度为室温，反应时间为lh。
6.如权利要求3所述的季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(2)中除去未反应的SPDP和中间产物的方法为凝胶过滤柱层析或膜分离技术。
7.如权利要求3所述的季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物，其特征在于，所述步骤(2)中的超氧化歧化酶溶液中超氧化歧化酶的浓度为0.5mg/ml~5mg/ml，超氧化歧化酶与3- (2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1: (1~15)。
8.如权利要求3所述的季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物，其特征在于，所述步骤(3)中的二硫苏糖醇(DTT)按摩尔量计为步骤(1)中季铵化壳聚糖中自由氨基的1~5倍；进一步优选的，所述步骤(3)中TMC功能化产物与活化的SOD的摩尔比为(1~10): 1 ；
9.如权利要求3所述的季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物，其特征在于，所述步骤(3)中的室温震荡反应时间为30min ;除去过量的二硫苏糖醇和中间产物的方法为凝胶过滤柱层析或膜分离技术； 进一步优选的，所述步骤(3)中的保温反应温度为30°C~40°C，时间为10h~20h ;所述的纯化为采用弱阴离子交换柱层析纯化。
10.一种季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物的制备方法，其特征在于，制备步骤如下: (1)称取季铵化壳聚糖(TMC)50mg溶于10mM PBS缓冲液中，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，制得季铵化壳聚糖溶液，TMC的浓度为5.0mg/ml ;加入3- (2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SH)P)3.5mg,室温反应lh，采用1.6cmX50cm的S印hadexG-10葡聚糖凝胶色谱柱除去未反应的SPDP和中间产物，用10mM的PBS缓冲液洗脱，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，流速为1.0ml/min，制得TMC功能化产物； (2)将超氧化歧化酶(SOD)溶于10mMPBS缓冲液中，PBS缓冲液中含有质量百分比为`0.9%的NaCl，制得超氧化歧化酶溶液，超氧化歧化酶的浓度为lmg/ml (0.03125 μ mol/ml )；将30 μ 1 SPDP溶液加入到超氧化歧化酶溶液中，温室下震荡反应lh ;采用1.6cmX50cm的Sephadex G_10葡聚糖凝胶色谱柱除去未反应的SPDP和中间产物，用10mM的PBS缓冲液洗脱，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，流速为1.0ml/min，制得活化的SOD ； (3)取步骤(1)制得的含TMC功能化产物50mg的溶液，加入25mg二硫苏糖醇，室温震荡反应30min,采用1.6cmX50cm的Sephadex G-10葡聚糖凝胶色谱柱除去未反应的SPDP和中间产物，用10mM的PBS缓冲液洗脱，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，流速为1.0ml/min，得到巯基`活化的TMC (TMC-SH)，加入步骤(2)制得的活化的S0D，使TMC功能化产物与活化的SOD的摩尔比为3: 1，置于10mM PBS缓冲液中，PBS缓冲液中含有质量百分比为0.9%的NaCl，40°C保温反应16h，产物经DEAE Sepharose FF离子交换柱层析纯化，于10mM PBS缓冲液中以0至1.0M NaCl线性梯度洗脱，收集样品峰制得季铵化壳聚糖-超氧化歧化酶修饰物。
【文档编号】C12N9/02GK103555703SQ201310538326
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月4日 优先权日:2013年11月4日
【发明者】刘纯慧, 王凤山, 宋春霞, 曹吉超, 李忠堂 申请人:山东大学