从血液中分离高纯度循环肿瘤细胞的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从血液中分离高纯度循环肿瘤细胞的方法，该方法包括如下步骤：A、在微流控芯片的微通道的表面负载单链多核苷酸，通过该多核苷酸与抗体-标记单链多核苷酸复合物中的标记单链多核苷酸特异性结合使微通道表面负载抗体；B、将血液样品与微流控芯片的微通道表面负载的抗体接触，并通过抗体与血液中循环肿瘤细胞表面特异性抗原的结合将循环肿瘤细胞从血液中分离出来；C、通过将多核苷酸链切断实现抗体以及被其捕获的循环肿瘤细胞从微通道表面释放，从而分离得到高纯度的循环肿瘤细胞。本发明的方法能够分离较高纯度的循环肿瘤细胞。若释放后的细胞再经过针对白细胞的负选芯片，可以获得具有极高纯度的循环肿瘤细胞。
【专利说明】从血液中分离高纯度循环肿瘤细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物与医学检测，涉及一种从混合细胞群体中分离高纯度稀有细胞的方法，特别涉及一种从血液中分离高纯度循环肿瘤细胞的方法。
【背景技术】
[0002]稀有细胞是指生物样本中存在的数量稀少却具有重要生物学功能或临床检测意义的细胞，如人外周血中的循环肿瘤细胞、循环内皮细胞、被病毒感染的细胞，以及实体肿瘤中的肿瘤干细胞等。由于稀有细胞数量极其稀少，对其检测犹如大海捞针，而对其进一步的分析就更加困难，因此急需发展能够高效、快速的将稀有细胞从复杂生物样本中分离出来的方法与工具。[0003]人外周血中的循环肿瘤细胞(CTC)是一类具有代表性的稀有细胞，它是指自发或因诊疗操作由肿瘤病灶播散进入外周血循环的肿瘤细胞，并在一定条件下可发展为肿瘤转移性病灶(Racila E, Euhus D, Weiss AJ, et al.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.1998,95, 4589-4594 ；Pantel K，Brakenhoff RH，Nat.Rev.Cancer2004，4，448-456 ；Zhe XN,Cher ML, Bonfil RD，Am.J.Cancer Res.2011，1，740-751 ；Butler TP，Gullino PM, CancerRes.1975，35，512-516)。由于超过90%的癌症死亡是由转移造成的(MehlenP，PuisieuxA，Nat.Rev.Cancer2006，6，449-458)，而循环肿瘤细胞是肿瘤转移灶的直接来源(DawoodS，Cristofanilli M，Curr.Treat Options Oncol.2007，8，89-95 ;Fidler IJ, Nat.Rev.Cancer2003，3，453-458)，因此从血液中检测循环肿瘤细胞越来越引起人们的重视。目前已有证据显示检测外周血中的循环肿瘤细胞数目可用于实体瘤患者的预后以及预测化疗的有效性，包括乳腺癌(Cristofanilli M，Budd T，Ellis MJ, et al.N.Engl.J.MecL 2004，351，781-791 ;Smerage JB，Hayes DF, Cancer Invest.2008，26，109-114)、前列腺癌(Moreno JG,Miller MC,Gross S，et al.Urology2005，65，713-718 ;De BonoJS,Scher HI，Montgomery RB,et al.Clin.Cancer Res.2008,14,6302-6309 ；Scher HI,Jia XY,De BonoJS, et al.Lancet Oncol.2009，10，233-239)、结肠癌(Sastre J，Maestro ML, Puente J，et al.Ann.0ncol.2008，19，935-938)、肾细胞癌(Bluemke K，Bilkenroth U，Meye A，etal.Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.2009，18，2190-2194)，黑色素瘤(Palmieri G，Satriano SM，Budroni M，et al.BMC Cancer.2006，6，266 ；Mocellin S，Hoon D，AmbrosiA，et al.Clin.Cancer Res.2006，12，4605-4613)等。进一步运用循环肿瘤细胞负荷作为潜在预测指标来指导实体瘤患者的病程分期和复发监控已成为癌症研究中一个活跃而重要的课题(Pachmann KiDengler R, Lobodasch K, et al.J.Cancer Res.Clin Oncol, 2008,134,59-65)ο
[0004]循环肿瘤细胞在外周血中含量极少，每IOml血液可能仅含几个到几十个循环肿瘤细胞，却有多达约I亿个白细胞和500亿个红细胞(Zhe XN, Cher ML, Bonfil RD，Am.J.CancerRes.2011，1，740-751)，因此从外周血中快速、高效的分离或捕获具有较高纯度、较高活性的循环肿瘤细胞对于循环肿瘤细胞的计数、后续的分子、功能分析形成了重大挑战。目前循环肿瘤细胞的捕获方法主要可分为两类。一类是基于循环肿瘤细胞与血液中其他细胞物理性质的差异，如密度(Rosenberg R, Gertler R, FriederichsJ, et al.Cytometry2002,49,150-158) > 大小(Vona G, Sabile A, Louha M, et al.Am.J.Pathol.2000，156，57-63 ;Zheng S, Lin H, Liu J-Q, et al.J.Chromatogr.A.2007,1162，154-161 ;Tan SJ, Yobas L，Lee GYH, et al.2009，11，4，883-892 ;美国专利申请20060254972 ;美国专利7，846，393)等的不同从而实现循环肿瘤细胞与其他细胞的分离。然而血液中的血细胞数量巨大，其密度、大小的分布很宽，而循环肿瘤细胞又具有较大的异质性，因此通过细胞物理性质差异进行的循环肿瘤细胞分选往往会混入大量的白细胞，获得的样品纯度很低，难以进行后续分析。另一类循环肿瘤细胞捕获方法主要基于循环肿瘤细胞表面的特异性抗原，通过针对循环肿瘤细胞表面特异性抗原的抗体或核算适配体实现循环肿瘤细胞的捕获并与血液中其他细胞分离。目前可选择的抗原包括上皮细胞抗原EpCAM，器官特异性标志物(如PSA、CEA和HER-2)，EMT标志物等(Trzpis M，McLaughlin PM, De Leij LM, Harmsen MC，Am.J.Pathol.2007，171，386-395 ;美国专利申请 20130209493)，这一方法的富集效率可达(1-20) X IO4 倍(Paterlin1-Brechot P,Benali NL, Cancer Lett.2007，253，180-204)，同时也存在可用于捕获循环肿瘤细胞的核算适配体(美国专利申请20130035630)。其中最具代表性的技术是已被美国FDA批准应用于检测转移性乳腺癌、前列腺癌及结直肠癌患者外周血中循环肿瘤细胞的CellSearchTM系统(Cristofanilli M, Budd T, Ellis MJ, et al.N.Engl.J.Med.2004, 351, 781-791 ；Riethdorf S, Fritsche H, Muller V, et al.Clin.Cancer Res.2007,13,920-928 ；CohenSJ, Punt CJA, Iannotti N，et al.J.Clin.0ncol.2008，26，3213-3221)，这一系统运用标记有针对EpCAM抗体的磁性颗粒进行血液中循环肿瘤细胞的捕获，但其捕获效率较低，血液中的较多循环肿瘤细胞没有被有效捕获，存在血细胞的非特异性吸附，且这一方法捕获的循环肿瘤细胞已丧失活性，难以进行信号通路与功能性分析，无法对其进行体外培养。近年来通过将微流控芯片技术与抗体捕获相结合发展出了一系列的循环肿瘤细胞芯片捕获技术，通过特殊几何设计的微通道大大增加了细胞与负载有抗体的捕获表面的碰撞几率以提高循环肿瘤细胞的捕获效率，如微柱阵列芯片(Nagrath S, Sequist LV, Maheswaran S, etal.Nature2007,450,1235-1239 ；Maheswaran S, Sequist LV, Nagrath S, et al.N.Engl.J.Med.2008，359，366-377)、具有周期性表面凹凸结构的“鱼骨型”芯片(Stott SL, HsuC-H, Tsukrov DI, et al.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.2010，107，18392-18397)等，同时保持了循环肿瘤细胞的活性。
[0005]但这些方法除了捕获效率仍有待于提高外，还存在着严重的非特异性吸附的问题，即使通过裂解、离心分离或通过其他微流控芯片技术方法去除血液中的红细胞，剩余的白细胞仍然会大量的非特异性吸附在捕获表面，导致捕获到的细胞中循环肿瘤细胞纯度较低，必须通过后期的免疫染色将非特异性吸附的白细胞与循环肿瘤细胞逐个区分开，需耗费大量的时间和人力，且容易被假阳性或假阴性的染色结果干扰导致判断错误，从而影响检测结果和基于此的癌症的预后判断。此外，基于微流控芯片技术与表面负载抗体进行捕获的方法将从血液样品中捕获到的循环肿瘤细胞固定在芯片中负载了抗体的表面上，这些循环肿瘤细胞难以被取出进行进一步分析或体外培养。
【发明内容】
[0006]本发明的目的，是提供了一种从混合细胞群体中分离高纯度稀有细胞的方法，特别是提供了一种从血液中分离高纯度循环肿瘤细胞的方法。
[0007]为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案:
[0008]方案一、一种从血液中分离高纯度循环肿瘤细胞的方法，包括如下步骤:
[0009]A、在微流控芯片的微通道的至少一个表面负载单链多核苷酸,该单链多核苷酸能够与抗体-标记单链多核苷酸复合物中的标记单链多核苷酸特异性结合，该抗体-标记单链多核苷酸复合物能够与循环肿瘤细胞表面独特抗原特异性结合，通过微通道表面的单链多核苷酸与标记单链多核苷酸的特异性结合形成多核苷酸双链使微通道表面负载抗体，其中单链多核苷酸中存在能够被切断的化学基团或核酸序列；
[0010]B、将血液样品与微流控芯片微通道表面负载的抗体接触，并通过微通道表面负载的抗体与循环肿瘤细胞表面特异性抗原的结合将循环肿瘤细胞从血液样品中分离出来并固定在微通道表面上；
[0011]C、通过将单链多核苷酸切断实现抗体以及被其捕获的循环肿瘤细胞从微通道表面释放，从而获得高纯度的循环肿瘤细胞。
[0012]方案二、一种从血液中分离高纯度循环肿瘤细胞的方法，包括如下步骤:
[0013]A、在微流控芯片的微通道的至少一个表面负载单链多核苷酸,该单链多核苷酸能够与抗体-标记单链多核苷酸复合物中的标记单链多核苷酸特异性结合，该抗体-标记单链多核苷酸复合物能够与循环肿瘤细胞表面独特抗原特异性结合，其中单链多核苷酸中存在能够被切断的化学基团或核酸序列；
[0014]B、将血液样品与抗体-标记单链多核苷酸复合物混合与孵育后，与微流控芯片微通道表面负载的单链多核苷酸接触，通过微通道表面负载的单链多核苷酸与和循环肿瘤细胞表面特异性抗原结合的抗体-标记单链多核苷酸复合物中的标记单链多核苷酸的特异性结合形成多核苷酸双链，将循环肿瘤细胞从血液样品中分离出来并固定在微通道表面上；
[0015]C、通过将单链多核苷酸切断实现抗体以及被其捕获的循环肿瘤细胞从微通道表面的释放，从而获得高纯度的循环肿瘤细胞。
[0016]上述方法中，所述的血液样品是指经过抗凝处理的全血样本，其体积为I毫升至10毫升,所用抗凝剂包括EDTA、柠檬酸或肝素。
[0017]上述方法中，所述抗体-标记单链多核苷酸复合中的标记单链多核苷酸与负载于芯片微通道表面的单链多核苷酸能够特异性结合并形成稳定的双链结构，两种单链多核苷酸中至少有连续的10个核苷酸互补，或至少有连续的20个核苷酸互补。
[0018]上述方法中，所述抗体-标记单链多核苷酸复合物中的标记单链多核苷酸通过共价键与抗体直接相连，或者抗体与标记单链多核苷酸通过共价键或其他作用力共同连接在纳米粒子上。
[0019]上述方法中，所述能够特异性结合循环肿瘤细胞表面独特抗原的抗体-标记单链多核苷酸复合物可以是一种，也可以是针对不同抗原的多种不同的抗体-标记单链多核苷酸复合物。
[0020]上述方法中，所述能够被切断的化学基团为可被特定波长紫外光切断的光敏基团。
[0021]上述方法中，所述能够被切断的核酸序列为可被限制性内切酶切断的核苷酸序列。
[0022]上述方法中，其后可以串联一个能够特异性捕获白细胞的芯片，用于去除释放细胞中的白细胞，从而进一步提高分离循环肿瘤细胞的纯度。
[0023]与现有技术相比，本发明具有以下的优点和特点:
[0024]I)本发明解决了在表面负载抗体捕获血液样品中循环肿瘤细胞时表面非特异性吸附细胞的问题，从而能够获得较高纯度的循环肿瘤细胞。具体来说，首先通过针对循环肿瘤细胞表面特异性抗原的抗体捕获血液样品中的循环肿瘤细胞，微通道表面捕获到的细胞除循环肿瘤细胞以外还包括了非特异性吸附在基底上的白细胞，然后通过紫外光或酶的剪切作用将基底表面所固定的抗体释放，抗体连同所捕获的循环肿瘤细胞一起被释放到溶液中而基底表面非特异性吸附的白细胞不会被释放，因此可以获得较高纯度的循环肿瘤细胞。
[0025]若从捕获表面释放后的细胞再经过针对其中除了循环肿瘤细胞以外其他细胞(即白细胞)的负选芯片，可以获得具有极高纯度的循环肿瘤细胞。
[0026]2)本发明中，分离 得到的循环肿瘤细胞没有被固定在表面，而是悬浮于溶液中，非常便于进行后续分析。
[0027]3)本发明中采用紫外光切断多核苷酸链，曝光面积大，切断效率高，且操作简单。
[0028]4)本发明中采用限制性内切酶切断多核苷酸链，对细胞影响较小，而且不同的限制性内切酶能够选择性切割不同的核酸序列。由于稀有细胞存在异质性，可以通过其表面标志物的不同进行进一步分选。通过构建不同的抗体-标记单链多核苷酸复合物，其中的抗体针对循环肿瘤细胞表面的多种标志物，而其中的标记单链多核苷酸中包含可被不同限制性内切酶切断的核酸序列。因此可以通过不同的限制性内切酶选择性切断特定的多核苷酸链，从而释放与该多核苷酸相连的抗体上被捕获的具有某种表面标志物表达的循环肿瘤细胞。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1是本发明从混合细胞群体中分离高纯度稀有细胞的方法的原理示意图。【具体实施方式】
[0030]本发明从混合细胞群体中分离高纯度稀有细胞的方法包括以下两个方案:
[0031]方案一包括如下步骤:
[0032]A、在微流控芯片的微通道的至少一个表面负载单链多核苷酸,该单链多核苷酸能够与抗体-标记单链多核苷酸复合物中的标记单链多核苷酸特异性结合，该抗体-标记单链多核苷酸复合物能够与循环肿瘤细胞表面独特抗原特异性结合，通过微通道表面的单链多核苷酸与标记单链多核苷酸的特异性结合形成多核苷酸双链使微通道表面负载抗体，其中单链多核苷酸中存在能够被切断的化学基团或核酸序列；
[0033]B、将血液样品与微流控芯片微通道表面负载的抗体接触，并通过微通道表面负载的抗体与循环肿瘤细胞表面特异性抗原的结合将循环肿瘤细胞从血液样品中分离出来并固定在微通道表面上；
[0034]C、通过将单链多核苷酸切断实现抗体以及被其捕获的循环肿瘤细胞从微通道表面释放，从而获得高纯度的循环肿瘤细胞。
[0035]方案二包括如下步骤:
[0036]A、在微流控芯片的微通道的至少一个表面负载单链多核苷酸,该单链多核苷酸能够与抗体-标记单链多核苷酸复合物中的标记单链多核苷酸特异性结合，该抗体-标记单链多核苷酸复合物能够与循环肿瘤细胞表面独特抗原特异性结合，其中单链多核苷酸中存在能够被切断的化学基团或核酸序列；
[0037]B、将血液样品与抗体-标记单链多核苷酸复合物混合与孵育后，与微流控芯片微通道表面负载的单链多核苷酸接触，通过微通道表面负载的单链多核苷酸与和循环肿瘤细胞表面特异性 抗原结合的抗体-标记单链多核苷酸复合物中的标记单链多核苷酸的特异性结合形成多核苷酸双链，将循环肿瘤细胞从血液样品中分离出来并固定在微通道表面上；
[0038]C、通过将单链多核苷酸切断实现抗体以及被其捕获的循环肿瘤细胞从微通道表面的释放，从而获得高纯度的循环肿瘤细胞。
[0039]图1是本发明从混合细胞群体中分离高纯度稀有细胞的方法的原理示意图，其中，I为被抗体捕获的循环肿瘤细胞，2为捕获抗体-标记单链多核苷酸复合物,3为捕获抗体-标记单链多核苷酸复合物中可被切断的基团或序列，4为负载在微通道表面的单链多核苷酸，5为非特异性吸附在微通道表面的细胞，6为能够负载多核苷酸的微通道表面。图中左边所示为循环肿瘤细胞被抗体捕获，并通过多核苷酸的特异性结合将循环肿瘤细胞从血液样品中分离并固定在表面，同时在存在其他细胞在表面的非特异性吸附，箭头右边所示为切断抗体-标记单链多核苷酸后，循环肿瘤细胞被释放脱离表面(中间图符所示)，而非特异性吸附的细胞仍然留在表面(右侧图符所示)。
[0040]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
[0041]实施例1通过光敏基团与紫外光照射释放循环肿瘤细胞
[0042]M:AAAAAAAAAAGTCGAGGATTCTGAACCTGT ；
[0043]M，-PC-NH2:
[0044]5， -NH2-AAAAA-PCspacer-AAAAAACAGGTTCAGAATCCTCGAC-3，；
[0045]M，-5PC-NH2:
[0046]5, -NH2-PCspacer-AAAAAAAAAAACAGGTTCAGAATCCTCGAC-3，。
[0047]其中M为负载在微通道内表面的多核苷酸(参见SEQ ID N0.1)，M’ _PC_NH-2 (参见SEQ ID N0.4)与M’-5PC-NH2 (参见SEQ ID N0.5)为连接在抗体上的标记单链多核苷酸，均可与M特异性结合。PC spacer为光敏基团，可在一定波长光照射下发生断裂，优选波长为365纳米。M’ -PC-NH2与M’ _5PC_NH2的区别在于光敏基团直接与5端的抗体相连，以及与5端的抗体间隔若干核苷酸分子。这些多核苷酸由生工生物合成。
[0048]将多核苷酸M溶于纯水配成浓度400 μ M的溶液，再与二甲基亚砜(DMSO)按体积比2:1稀释为终浓度267 μ M的溶液。同时，将用于灌注多核苷酸的聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控芯片贴在聚赖氨酸玻璃上，放在烘箱中80°C处理2小时。处理结束后，采用恒流泵灌注浓度为267 μ M的多核苷酸M溶液,灌满后放于干燥箱中干燥,待通道中液体完全干后,揭下微流控芯片，将玻璃置于烘箱中80°C处理4小时，然后用纯水快速清洗去除玻璃表面的盐和溶剂残余，氮气吹干。
[0049]将具有周期性表面凹凸结构的“鱼骨型”PDMS芯片(制作方法见Wang，S.T.；Liu,K.；Liu, J.A.et al，.Angew.Chem.1nt.Ed.2011，50，3084-3088)贴在负载有多核苷酸的聚赖氨酸玻璃上，确保“鱼骨型”芯片的微通道与基底多核苷酸区域重合，将芯片放于烘箱中80°C处理2小时，处理完毕后待芯片恢复至室温后用夹具固定。“鱼骨型”芯片有一个入口和一个出口，通道呈连续的S型，宽度1mm，整体长度为200mm，芯片的横截面呈周期性的凹凸结构，由两层SU8光刻胶制备而成，下层光刻胶厚度为70 μ rn，上层光刻胶厚度为35 μ m,上层的鱼骨图形呈周期性排列，“鱼骨”宽度为35 μ m，水平夹角为45度，周期性间隔为100 μ m，一组共20条“鱼骨”。实验中两个芯片串联使用，使得捕获通道的长度达到400mm。
[0050]在“鱼骨型”芯片中通过恒流泵灌注3%牛血清白蛋白(BSA)，室温静置I小时对芯片进行封闭。将1000个结肠癌肿瘤细胞HCTl 16用细胞膜红色荧光探针DiI染成红色，然后与I毫升健康人的全血混合，同时加入I微升lmg/ml的上皮细胞粘附分子(EpCAM，购自美国R&D Systems公司)_标记单链多核苷酸(M’ -PC-NH2或,-5PC-NH2)复合物，充分混合半小时后采用注射器和恒流泵以lmL/h的流速通过“鱼骨型"PDMS芯片，同时收集流经芯片的血液。灌注结束后，将流经芯片的血液离心取上层血浆，通过恒流泵用该血浆清洗芯片除去多余血液。最后，使用活细胞工作站对“鱼骨型”芯片中肿瘤细胞、非特异性吸附的细胞以及流经芯片的血液中未被捕获的肿瘤细胞进行计数，计算捕获率约为85%，纯度低于1 %。
[0051 ] 用365纳米的紫外灯(购自美国Cole-Parmer公司，功率为40W，功率密度为
1.19mff/em2)对“鱼骨型”PDMS芯片照射10分钟，照射结束后用无细胞血浆清洗芯片，并对释放的细胞进行计数，其中肿瘤细胞的纯度提升至81 %。
[0052]进一步的，将释放后的细胞通过另一个“鱼骨型”芯片，该芯片表面负载了针对白细胞的⑶45抗体(购自美国R&D Systems公司)。通过该芯片后,循环肿瘤细胞的纯度进一步提升至95%以上。
[0053]实施例2通过限制性内切酶释放循环肿瘤细胞
[0054]A-EcoRl (参见 SEQ ID N0.2):5’ -AAAAAAAAAAAAGAGCTAAGTCCGTAGAATTCAAAAAAAAAAGAGCTAAGTCCGTAGAATTCAAAAAAAAAAAAA-3，；
[0055]A-EcoRI' -NH2 (参见 SEQ ID N0.6):
[0056]5， -NH2-AAAAAAAAAAGAATTCTACGGACTTAGCTCCAGGAT-3，；
[0057]B-BanHI (参见 SEQ ID N0.3):5’ -AAAAAAAAAAAATTGAATCATGCCTAGGATCCAAAAAAAAAATTGAATCAT GCCTAGGATCCAAAAAAAAAAAAA-3，；
[0058]B-BamHI' -NH2:(参见 SEQ ID N0.7) 5 ’ -NH2_AAAAAAAAAAGGATCCTAGGCATGATTCAATGAGGC-3，；
[0059]其中A-EcoRI与B-BamHI为负载在为微通道内表面的多核苷酸，A-EcoRr -NH2与B-BamHI, NH2为连接在抗体上的标记单链多核苷酸。A-EcoRI与A-EcoRI, -NH2中存在能够被限制性内切酶EcoRI切断的序列，B-BamHI与B-BamHI丨-NH2中存在能够被限制性内切酶BamHI切断的序列。
[0060]血液中肿瘤细胞的捕获方式同上，当血液流经微流控芯片完成捕获后，用50 μ I浓度为20units/l.! I的限制性内切酶(EcoRI或BamHI)灌注微流控芯片，然后37°C孵育lh，孵育结束后用细胞 培养基清洗芯片，并对释放的细胞进行计数，其中肿瘤细胞的纯度为65%。
【权利要求】
1.一种从血液中分离高纯度循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤: A、在微流控芯片的微通道的至少一个表面负载单链多核苷酸，该单链多核苷酸能够与抗体-标记单链多核苷酸复合物中的标记单链多核苷酸特异性结合，该抗体-标记单链多核苷酸复合物能够与循环肿瘤细胞表面独特抗原特异性结合，通过微通道表面的单链多核苷酸与标记单链多核苷酸的特异性结合形成多核苷酸双链使微通道表面负载抗体，其中单链多核苷酸中存在能够被切断的化学基团或核酸序列； B、将血液样品与微流控芯片微通道表面负载的抗体接触，并通过微通道表面负载的抗体与循环肿瘤细胞表面特异性抗原的结合将循环肿瘤细胞从血液样品中分离出来并固定在微通道表面上； C、通过将单链多核苷酸切断实现抗体以及被其捕获的循环肿瘤细胞从微通道表面释放，从而获得高纯度的循环肿瘤细胞。
2.—种从血液中分离高纯度循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤: A、在微流控芯片的微通道的至少一个表面负载单链多核苷酸，该单链多核苷酸能够与抗体-标记单链多核苷酸复合物中的标记单链多核苷酸特异性结合，该抗体-标记单链多核苷酸复合物能够与循环肿瘤细胞表面独特抗原特异性结合，其中单链多核苷酸中存在能够被切断的化学基团或核酸序列； B、将血液样品与抗体-标记单链多核苷酸复合物混合与孵育后，与微流控芯片微通道表面负载的单链多核苷酸接触，通过微通道表面负载的单链多核苷酸与和循环肿瘤细胞表面特异性抗原结合的抗体-标记单链多核苷酸复合物中的标记单链多核苷酸的特异性结合形成多核苷酸双链，将循环肿瘤细胞从血液样品中分离出来并固定在微通道表面上； C、通过将单链多核苷酸切断实现抗体以及被其捕获的循环肿瘤细胞从微通道表面的释放，从而获得高纯度的循环肿瘤细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的血液样品是指经过抗凝处理的全血样本，其体积为I毫升至10毫升，所用抗凝剂包括EDTA、柠檬酸或肝素。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述抗体-标记单链多核苷酸复合中的标记单链多核苷酸与负载于芯片微通道表面的单链多核苷酸能够特异性结合并形成稳定的双链结构，两种单链多核苷酸中至少有连续的10个核苷酸互补，或至少有连续的20个核苷酸互补。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述抗体-标记单链多核苷酸复合物中的标记单链多核苷酸通过共价键与抗体直接相连，或者抗体与标记单链多核苷酸通过共价键或其他作用力共同连接在纳米粒子上。
6.根据权利 要求1或2所述的方法，其特征在于，所述能够特异性结合循环肿瘤细胞表面独特抗原的抗体-标记单链多核苷酸复合物可以是一种，也可以是针对不同抗原的多种不同的抗体-标记单链多核苷酸复合物。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述能够被切断的化学基团为可被特定波长紫外光切断的光敏基团。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述能够被切断的核酸序列为可被限制性内切酶切断的核苷酸序列。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其后可以串联一个能够特异性捕获白细胞的芯片，用于去除 释放细胞中的白细胞，从而进一步提高分离循环肿瘤细胞的纯度。
【文档编号】C12N5/09GK103642756SQ201310547812
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】施奇惠, 邓宇亮, 孙帅, 张瑜 申请人:上海交通大学