Rga法检测重组人促红细胞生成素生物学活性的制作方法
【专利摘要】一种新的重组人促红细胞生成素(Recombinant?Human?Erythropoietin，rhEPO)生物活性测定方法。它的基本原理是：利用STAT5的反应元件(sis?inducible?element，SIE；the?gamma?response?region，GRR；the?interferon?γ-activated?sequence，GAS)构建报告基因载体，转染UT-7细胞，加压筛选和单克隆分离培养得到稳定单克隆细胞株UT-7／G7。rhEPO与配体结合后，经过一系列信号转导，激活报告基因萤光素酶的表达，通过检测rhEPO刺激后萤光素酶表达的变化来对rhEPO活性进行定量。具体检测步骤为：UT-7／G7细胞用DPBS洗3次后，分析培养基培养17-20小时，以60,000个／孔铺96孔板，加入系列浓度的rhEPO，作用4h，检测萤光素酶活性。该方法操作简单，反应灵敏，变异性小，对于rhEPO的质量控制和临床应用具有重要意义。
【专利说明】RGA法检测重组人促红细胞生成素生物学活性
【技术领域】:
[0001]本发明涉及生物药物活性检测领域，针对重组人促红细胞生成素(rhEPO)的生物学活性测定建立了一种更加快速、准确的报告基因定量方法(report gene assay, RGA)。
【背景技术】:
[0002]重组人促红细胞生成素(rhEPO)是一种应用基因工程技术，将人的促红细胞生成素基因转入哺乳动物细胞内，高效表达的能够刺激红细胞生成的糖蛋白类激素，用于治疗慢性肾功能衰竭和癌症化疗产生的贫血。目前常用的活性测定方法为网织红细胞计数法和MTT法，网织红细胞计数法需要用小鼠，涉及到动物福利问题，而且实验操作复杂，实验结果变异性大；MTT法实验周期为4天，操作复杂。rhEPO生物学效应的发挥是通过与EPOR结合，激活JAK2,进而激活STAT5转录因子,后者与其DNA反应元件(sis inducible element,SIE ；the gamma response region,GRR:the interferon y-activated sequence,GAS)结合，激活下游基因的转录。报告基因法(report gene assay,RGA)是一种快速、简便的检测方法，利用药物作用后报告基因表达的变化来反映药物的活性。结合rhEPO的具体作用机制和RGA的优势，我们将报告基因质粒(Importer gene, R-G)转染UT-7细胞，建立了一种更加简便，低成本的检测方法。
【发明内容】
:
[0003]1.发明目的:
[0004]建立一种更加快速，简便，准确客观的rhEPO活性测定报告基因法，促进该产品的研究开发，质量控制以及临床应用。
[0005]2.技术方案:
[0006]本发明通过将STAT5反应元件(SIE，GRR，GAS)构建报告基因质粒(Importergene, R-G)转染UT_7细胞，并加压筛选分离培养出单克隆细胞株，再建立相应的检测方法来对rhEPO活性进行定量。其技术流程为:UT-7 / R-G细胞株的建立(报告基因载体单克隆细胞株)一RGA测定方法建立及方法学验证。
[0007]3.有益效果:
[0008]该检测方法的建立有利于rhEPO药品的研究开发，质量控制和临床应用，具有较高的应用价值。
[0009]通过与现有的方法比较，有如下优点:
[0010](I)成本较低，不需要进行动物实验；
[0011]⑵操作简单 ；
[0012](3)周期短，可以在24h内完成全部实验；
[0013](4)结果客观可靠，准确度高，变异小。
【专利附图】
【附图说明】:[0014]图1-1单克隆细胞株的反应性
[0015]图2-1 rhEPO不同稀释比例
[0016]图2-2不同细胞密度的比较
[0017]图2-3 rhEPO不同作用时间的比较
[0018]图3-1样品I的回收率检测
【具体实施方式】:
[0019]1.材料与方法:
[0020]1.1研究对象:重组人促红细胞生成素
[0021]1.2pGL4.26 载体:购买于 Promega。
[0022]UT-7 细胞:购买于 ATCC。
[0023]rhEPO标准品与样品:中国食品药品检定研究院重组药物室留存。
[0024]1.3 试剂:
[0025]生长培养基:MDM(GIBC0，#12440)+10% 胎牛血清(GIBCO，#10099)+1 % 双抗(GIBC0, #15240)
[0026]潮霉素:Amresco,K547
[0027]HEPES:GIBC0,15630
[0028]白色底部透光96孔板:C0RNING，3903
[0029]选择培养基:生长培养基+500 μ g / ml潮霉素
[0030]分析培养:无酚红RPM1-1640 (GIBC0, #11835) 500ml+5ml 胎牛血清 +6ml HEPES
[0031]荧光素酶底物:Promega，E2650
[0032]1.4 仪器:
[0033]电转仪，Bio-Rad, Gene Pulser Xcell
[0034]酶标仪，SpectraMaxM5
[0035]1.5数据分析软件:
[0036]SoftMax Pro 软件
[0037]sigmaPlotl2.0 软件
[0038]1.6实验流程:
[0039]1.6.lpGL4.26-R-G 的构建
[0040]化学合成DNA反应元件,序列如下:
[0041 ]5，-GTCGACATTTCCCGTAAATCAAGGATGTATTTCCCAGAAAAGGTATTTCCCAGAAAAGGAAC
[0042]GTCGACATTTCCCGTAAATCAAGGATGTATTTCCCAGAAAAGGTATTTCCCAGAAAAGGAAC
[0043]GTCGACATTTCCCGTAAATCAAGGATGTATTTCCCAGAAAAGGTATTTCCCAGAAAAGGAAC-3，正负链退火后连入PGL4.26载体，送至奥科鼎盛生物科技公司测序，完全正确。
[0044]1.6.2 转染
[0045]I)收集细胞，计数，200 μ I重悬，转移至4mm电击杯；
[0046]2)取100 μ I质粒，加入电击杯中，与细胞悬液混匀；
[0047]3)设置电击参数，电压250V，电容950 μ F，电击杯4mm ；
[0048]4)电击后转移至6孔板,加3ml完全培养基；[0049]5) 48h后检测荧光素酶的表达。
[0050]1.6.3加压筛选及单克隆细胞株分离培养
[0051](I)转染后48h，更换潮霉素选择培养基，筛选3周左右，每3-4天更换一次潮霉素选择培养基；
[0052](2)待克隆长出后，消化计数，稀释至I个细胞/ 200μ 1,200μ1 /孔铺至96孔板；
[0053](3)用选择培养基培养4周，显微镜下观察，挑选单克隆的细胞孔，并转移至24孔板，长满后再传至6孔板扩大培养。
[0054]1.6.4单克隆细胞株对rhEPO反应性检测
[0055]分离培养得到10个单克隆细胞株，分别检测对rhEPO反应性，细胞密度为40，000个/孔，rhEPO预稀释浓度为250 IU / ml，4倍比系列稀释12个梯度，各设3个复孔。rhEPO药物作用4h检测荧光素酶活性。
[0056]1.6.5RGA活性测定方法建立:
[0057]1.6.5.1倍比稀释比例
[0058]根据前面的试验结果，细胞密度为40，000个/孔，rhEPO预稀释浓度为10IU /ml，药物作用时间为4h，检测rhEPO倍比稀释倍数分别为3倍和2倍的剂量反应曲线。
[0059]1.6.5.2比较不同细胞密度的线性反应
[0060]根据前面的试验结果，rhEPO预稀释浓度为2IU / ml，调整倍比稀释倍数为2倍，药物作用时间为4h，检测细胞密度分别为20，000,40, 000,60, 000,80, 000个/孔的剂量反
应曲线。
[0061]1.6.5.3不同药物刺激时间的线性反应
[0062]根据前面的试验结果，细胞密度为60，000个/孔，调整rhEPO预稀释浓度为2IU / ml，倍比稀释倍数为2倍，检测分别作用3，4，5和6h的剂量反应曲线。
[0063]1.6.6方法学验证
[0064]1.6.6.1 回收率
[0065]用新建RGA法对2批rhEPO样品进行活性测定，同时做50%加标回收率，每个剂量3个复孔，测定6次。
[0066]1.6.6.2 精密度
[0067]用新建RGA法对2批rhEPO样品进行活性测定，检测该方法的精密度，每个剂量3个复孔，测定6次。
[0068]2.结果与讨论
[0069]2.1R-G质粒转染UT-7细胞，通过500 μ g / ml潮霉素加压筛选，得到的稳定克隆进行单克隆分离培养，得到10个单克隆细胞株，分别检测对rhEPO反应性，其中7号单克隆信号值较强，信噪比较好，结果见图1-1。rhEPO预稀释浓度为250IU / ml，4倍比稀释12个梯度，拟以此克隆UT-7 / G7建立rhEPO活性检测方法。
[0070]2.2检测方法的建立
[0071]分别对药物倍比稀释比例，细胞铺板密度，药物作用时间等参数进行了优化，见图2-1，2-2和2-3。通过比较ED5tl值和信噪比，初步确定了检测方案:细胞铺板密度为60，000个细胞/孔，rhEPO药物预稀释浓度为2IU / ml, 2倍比稀释，药物刺激时间为4小时。[0072]2.3用RGA法对2批rhEPO样品测定6次，同时做50%加标回收率，其中样品I的一次回收率结果见图3-1。结果汇总见表2-1。
[0073]表中结果表明，该方法检测样品I的回收率在85.37-96.34%之间，样品2的回收率在81.71-102.44%之间，结果证明该方法的准确性较高，适用于作为常规方法来检测rhEPO活性。2.4用RGA法对2批rhEPO样品测定6次，检测该方法的精密度，结果汇总见表2-1。该方法检测样品I的活性均值为3857.67IU / ml, CV%值为3.50% ;样品2的活性均值为3564.5IU /结果证明该方法的重现性较好，适用于作为常规方法来检测rhEPO活性。
[0074]表2-1RGA法检测rhEPO样品生物学活性
[0075]
【权利要求】
1.一种应用转基因细胞株来检测重组人促红细胞生成素(rhEPO)生物活性的非诊断目的的方法，其特征在于包括如下步骤:
(1)将DNA 反应兀件 SIE (Sis inducible element, SIE), GRR(the gamma responseregion, GRR)和 GAS (the interferon y -activated sequence, GAS)串联后重复三次插入pGL4.26多克隆位点，构建Reporter gene (R-G)质粒。R-G正链:
5’ -GTCGACATTTCCCGTAAATCAAGGATGTATTTCCCAGAAAAGGTATTTCCCAGAAAAGGAAC
GTCGACATTTCCCGTAAATCAAGGATGTATTTCCCAGAAAAGGTATTTCCCAGAAAAGGAAC
GTCGACATTTCCCGTAAATCAAGGATGTATTTCCCAGAAAAGGTATTTCCCAGAAAAGGAAC-3’ (2)根据rhEPO及其受体的作用机制，构建rhEPO反应性转基因细胞株:选用UT-7细胞，转染R-G质粒，通过加压筛选，获得稳定细胞株UT-7 / G7，并用于rhEPO活性检测。 (3)通过检测rhEPO刺激下荧光素酶含量的变化对rhEPO活性进行定量:(i)检测用分析培养基为500ml无酚红RPM1-1640+5ml胎牛血清+6ml HEPES，检测用细胞培养板为白色底部透光96孔板；(ii)UT-7 / G7细胞用分析培养基培养17-20h，离心收集后用分析培养基调整至1.2X 1O6个 / ml，将50 μ I细胞悬液与50 μ I rhEPO系列稀释液同时加入96孔板，培养4h加入100 μ I /孔荧光素酶底物，检测萤光素酶表达量。 (4)利用SoftMaxPro软件四参数方程对rhEPO活性进行定量分析。
【文档编号】C12Q1/66GK103993066SQ201310547894
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2013年11月8日 优先权日:2013年11月8日
【发明者】王军志, 饶春明, 杨玉帅, 周勇, 于雷, 史新昌, 李响, 秦玺 申请人:中国食品药品检定研究院