一种检测甘蔗赤条病菌的荧光定量pcr试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测甘蔗赤条病菌的荧光定量PCR试剂盒，包括：（1）阳性标准品；（2）阴性对照；（3）PCR反应液；（4）ExTaq酶液；（5）探针溶液；（6）无菌水。本试剂盒对甘蔗赤条病菌的检测有高度的特异性，与其他植物病菌无交叉反应；检测的灵敏度达100拷贝，可直接用于甘蔗植株、脱毒种苗等样本的定量检测甘蔗赤条病菌；利用本发明试剂盒检测快速简单，准确性好，灵敏度高，检测结果可靠稳定。
【专利说明】一种检测甘蔗赤条病菌的荧光定量PCR试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测植物病菌的PCR试剂盒，具体涉及一种检测甘蔗赤条病菌的荧光定量PCR试剂盒，属微生物检测领域。
【背景技术】
[0002]甘鹿赤条病(Sugarcane red stripe disease)是一种普遍发生的细菌性病害，几乎在主要甘蔗种植国家均有发生，我国甘蔗赤条病在几个种植甘蔗的省(区)都有零星发生。甘鹿赤条病菌被认为是红条纹假单胞菌rubrilineans (Lee et al.)Stapp引起，其形态特征为无芽孢，呈杆状，大小为0.7 X 1.6 μ m，有单根极生鞭毛，有薄荚膜，革兰氏染色反应为阴性。1992年Willems等将红条纹假单胞菌重新命名为燕麦噬酸菌燕麦亚种 dii/orarazsubsp.A venae) 0 Zia-ul-Hussnain 等(2011)从巴基斯坦甘蔗赤条病株上分离得到了燕麦噬酸菌燕麦亚种病菌，并对该病菌的菌体形态、培养性状、生理生化反应作了研究。燕麦噬酸菌燕麦亚种病菌其寄主范围除甘蔗外，还有水稻、玉米、铺地黍等禾本科的一些植物。病害有叶条斑和顶腐两种类型。两者可以单独发生，亦可并发。在潮湿温暖的条件下容易发病，而且病叶的伤痕表面常有细菌溢泌物，借助雨水和气流传播。患病的枯老蔗叶、病茎中的病原菌经4个月后仍然有致病力。因此建立甘蔗赤条病菌的快速、准确、灵敏的检测技术，对该病的防治起到十分关键的作用。
[0003]常用的检测病菌的方法有生物学鉴定法、电镜技术、酶联免疫技术和分子生物学技术等。生物学鉴定法耗时、且步骤繁琐；电镜技术需要植物组织切片，步骤繁琐，且只能通过形态学观察判断；酶联免疫技术需要特异性的抗血清，且灵敏度不及分子检测技术；基于PCR原理的分子生物学技术是一种灵敏度高、特异性强的快速检测技术，在其它甘蔗病原物的检测已得到广泛应用。目前，检测甘蔗赤条病菌燕麦噬酸菌燕麦亚种的荧光定量PCR试剂盒及其方法未见报道。
[0004]本发明在分离获得甘蔗赤条病菌，克隆测序病菌基因组核糖体rDNA序列基础上，选择甘蔗赤条病菌16S-23S rDNA间隔区序列(ITS)，设计用于荧光定量PCR检测的引物及探针，通过对反应体系的优化，研制用于检测甘蔗赤条病菌的荧光定量PCR试剂盒及方法，为我国甘蔗科研、检疫、质检等部门提供快速、灵敏、准确的病害检测试剂盒产品和技术服务。
[0005]
【发明内容】
[0006]本发明目的是提供一种检测甘蔗赤条病菌的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒能快速准确的对待测样品的甘蔗赤条病菌进行定量检测。该试剂盒不仅可使用于目前市场上的所有类型荧光定量PCR仪，而且能够灵敏、特异的对甘蔗赤条病菌进行定量检测。
[0007]为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下:
本发明采用Taqman探针建立荧光定量PCR检测甘蔗赤条病菌试剂盒，通过制备病菌DNA标准样品与待测样品同时检测，得到待测样品的初始病菌拷贝数，对病菌进行定量检测。
[0008]本发明提供了一种利用荧光定量PCR方法检测甘蔗赤条病菌的引物对QPCR-F5、QPCR-R5和Taqman探针QPCR-P5，所述的引物对序列如下:
QPCR-F5:5’ -TCATCCTCCACCAACCAATA-3’，
QPCR-R5:5’ -TACCGGACCAACAACAAAGA-3’ ；
Taqman探针QPCR-P5的序列如下:
5，-FAM-CACCAAAGCGGCTTCGCAAG-TAMRA-3，。
[0009]本发明还提供一种检测甘蔗赤条病菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于该试剂盒由下列试剂组成:
Cl)阳性标准品:采用常规PCR扩增含有16S-23S rDNA间隔区的DNA作为标准样品，I X 101° 拷贝 / μ L，50 μ L/ 瓶，-20°C冷冻保存；
(2)阴性对照:采用无甘蔗赤条病菌感染的甘蔗叶片组织，提取叶片总DNA为阴性对照，100 ng/ μ L，50 μ L/瓶，-20 °C冷冻保存备用；
(3)PCR反应液:每个反应包括5XPCR缓冲液5.0 μ LUO mmol dNTPs 0.5 μ L、25mmol MgCl2 2.0 μ L 以及浓度为 10 μ mol/L 的引物对 QPCR-F5 和 QPCR-R5 各 2.0 μ L，共
11.5 μ L，50个反应体系共计575 μ L, -20 °C保存备用；
(4)Ex Taq酶:每个反应体系包括5 U/μ L Ex Taq酶0.5 μ L，50个反应体系共计25μ L, _20°C保存备用；
(5)探针溶液:Taqman探针QPCR-P5采用5’-FAM和3’ -TAMRA修饰，合成后采用无菌水稀释,浓度为10 μ mol/L,每个反应体系0.4 μ L, 50个反应体系共计20 yL,_20°C保存备用;
(6)无菌水:2X10 mL/瓶。
[0010]本发明的优点和有益效果主要体现在:本试剂盒对甘蔗赤条病菌的检测有高度的特异性，与其他甘蔗病菌无交叉反应；检测的灵敏度达100拷贝，可以在甘蔗田间样品和脱毒种苗等样本中检测甘蔗赤条病菌；利用本发明试剂盒检测操作简单快速，从样品病菌核酸提取至完成检测，耗时2~3小时。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1是甘蔗赤条病菌DNA标准品荧光定量PCR的动力学曲线。图中横坐标代表荧光定量PCR扩增循环数，纵坐标代表荧光信号强度，扩增曲线分别是DNA标准品IX IO8拷贝/μ L、1 X IO7 拷贝 / μ L、1 X IO6 拷贝 / μ L、1 X IO5 拷贝 / μ L、1 X IO4 拷贝 / μ L、1 X IO3 拷贝/ μ L、I X IO2 和 I X IO1 拷贝 / μ Lo
[0012]图2是甘蔗赤条病菌DNA标准品荧光定量PCR的标准曲线。横坐标χ代表标准品拷贝数的对数值，纵坐标y代表PCR扩增循环数；y= -3.2167x+39.785 ;R代表相关系数，决定系数 R2=0.9998。
【具体实施方式】
[0013]为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
[0014]实施例1 一种检测甘蔗赤条病菌的荧光定量PCR试剂盒，包括Taqman探针 QPCR-P5 和引物对 QPCR-F5、QPCR-R5,其中 Taqman 探针 QPCR-P5 序列为 5’ -CACCAAAGCGGCTTCGCAAG _3 ’，探针的5 ’端和3 ’端分别采用荧光基团FAM和TAMRA进行修饰；引物对 QPCR-F5 和 QPCR-R5 序列为 5’ - TCATCCTCCACCAACCAATA -3，和 5’ -TACCGGACCAACAACAAAGA -3’ ；该试剂盒包括下列试剂:
(I)阳性标准品:以 16S-F3 (5，-ACTGCGTGAAGTCGGAATC-3’)和 23S-R1(5’ -TCGGAATCTCGGTTGATG-3’)为引物，利用常规PCR方法扩增获得甘蔗赤条病菌16S-23SrDNA间隔区序列(ITS)片段，PCR产物纯化后作为甘蔗赤条病菌DNA标准样品。用核酸蛋白分析仪测定PCR产物DNA浓度后，稀释为100 ng/yL, PCR产物片段大小为1070 bp，根据公式计算DNA标准样品的拷贝数为8.52X IO10拷贝/ μ L，并稀释成标准样品I X 101°拷贝/yL，50 μ L/瓶，-20 °C冷冻保存。
[0015](2)阴性对照:采用无甘蔗赤条病菌感染的甘蔗叶片组织，提取叶片总DNA为阴性对照，用核酸蛋白分析仪测定提取的总DNA浓度，并稀释成浓度为100 ng/yL作为阴性样品，50 μ L/瓶，-20 1:冷冻保存备用。
[0016](3)无菌水:2X 10 mL/瓶。
[0017](4)PCR 反应液:每个反应包括 5XPCR 缓冲液 5.0 μ LUO mmol dNTPs 0.5 μ L、25 mmol MgCl2 2.0 μ L 以及浓度为 10 μ mol/L 的引物对 QPCR-F5 和 QPCR-R5各 2.0 μ L,共11.5 μ L，50个反应体系共计575 μ L, -20 °C保存备用；
(5)Ex Taq酶:每个反应体系包括5 U/μ L Ex Taq酶0.5 μ L，50个反应体系共计25μ L, _20°C保存备用；
(6)探针溶液:Taqman探针QPCR-P5采用5’-FAM和3’ -TAMRA修饰，合成后采用无菌水稀释,浓度为10 μ mol/L,每个反应体系0.4 μ L, 50个反应体系共计20 yL,_20°C保存备用。
[0018]实施例2甘蔗赤条病菌的荧光定量PCR试剂盒检测应用
I)标准品DNA稀释:将甘蔗赤条病菌DNA标准品用无菌水按10倍稀释成I X IO8~I X IO1拷贝/ y L的一系列DNA标准品。
[0019]2)标准曲线方程建立
以此稀释后DNA标准品为模板，每个标准样品处理重复3次。并以无甘蔗赤条病菌感染的甘蔗叶片总DNA为阴性对照，以无菌水为空白对照。按上述试剂盒内组分，荧光定量PCR反应总体系为25 μ L，包括PCR反应液11.5 μ L，反应酶混合液0.5 μ L，探针溶液0.4μ L，标准样品DNA 1.0 μ L，无菌水补至25 μ L ;然后放于ABI公司7500定量PCR仪进行荧光定量PCR扩增。扩增程序为:95 V 15 S，60 V I min，40个循环，在60 1:进行单点荧光检测。获得如图1所示的扩增曲线，然后绘制如图2所示的标准曲线，构建标准曲线方程。本实施例构建的标准曲线方程为Υ=-3.2167χ+39.785，决定系数R2为0.9998，扩增效率为104.58 %，满足荧光定量PCR正常的标准曲线要求。检测灵敏度可10拷贝/μ L。将荧光定量PCR方法获得产物用常规电泳检测，只能检测到IO4拷贝/ μ L，比常规的PCR检测灵敏度至少高100倍。[0020]3)待测样品DNA提取:采用CTAB法提取几份待测甘蔗叶片DNA，在核酸蛋白分析仪上测定DNA的光吸收值，计算提取的DNA浓度，然后统一稀释成100 ng/ μ L。
[0021 ] 4)荧光定量PCR扩增:以待测样品的RNA为模板，荧光定量PCR反应总体系和扩增程序同上述标准曲线方程建立。在ABI公司7500定量PCR仪进行荧光定量PCR扩增，获得待测样品的甘蔗赤条病菌标准品荧光定量PCR的动力学曲线。将待测样品的Ct值代入标准曲线方程转化成初始病菌分子拷贝数，即一个分子拷贝数代表一个甘蔗赤条病菌，从而定量分析甘蔗样品中感染甘蔗赤条病菌的数量，结果如表1所示。检测结果表明，具有典型甘蔗赤条病症状的福农38号、福农1110这2个田间样品证实感染了甘蔗赤条病菌，病菌含量达IO5拷贝/ μ L ;没有甘蔗赤条病症状的新台糖25、德宏06-24这2个田间样品没有检测出甘蔗赤条病菌。为了进一步证实福农38号、福农1110感染的病菌是否为甘蔗赤条病菌，我们将荧光定量PCR产物进行克隆和测序，核苷酸序列提交http: //blast, ncb1.nlm.nih.gov/比对,结果证实是甘鹿赤条病菌,属于燕麦曬酸菌燕麦亚种avenaesubsp.ΑνθΩ3θ\本发明建立的检测甘鹿赤条病菌突光定量PCR方法具有很好的重复性，同一样品的Ct值变异系数小于I %。
[0022]利用本发明的Taqman探针荧光定量PCR试剂盒进行检测时，可以准确快速的得到样品的甘蔗赤条病菌初始拷贝数，可以应用于甘蔗田间样品检测、脱毒种苗质量监控和甘蔗抗性鉴定。
[0023]表1待测样品Ct值及稳定性
【权利要求】
1.一种检测甘蔗赤条病菌的荧光定量PCR试剂盒，包括Taqman探针QPCR-P5和引物对QPCR-F5、QPCR-R5，其中 Taqman 探针 QPCR-P5 序列为 5，-CACCATCACGAAATCAATGCAGCA-3，，探针的5’端和3’端分别采用荧光基团FAM和TAMRA进行修饰；引物对QPCR-F5和QPCR-R55序列为 5’ -CGGGAAACCCATAATACCAC-3’ 和 5’ -GTCGAITTCTGCTGGTGAGA-3 ’。
2.一种用于甘蔗赤条病菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于该试剂盒由下列试剂组成: Cl)阳性标准品:采用常规PCR扩增含有16S-23S rDNA间隔区的DNA作为标准样品，I X 101° 拷贝 / μ L，50 μ L/ 瓶，-20°C冷冻保存； (2)阴性对照:采用无甘蔗赤条病菌感染的甘蔗叶片组织，提取叶片总DNA为阴性对照，100 ng/ μ L，50 μ L/瓶，-20 °C冷冻保存备用； (3)PCR反应液:每个反应包括5XPCR缓冲液5.0 μ LUO mmol dNTPs 0.5 μ L、25mmol MgCl2 2.0 μ L，以及权利要求1所述的引物对，浓度为10 μ mol/L的QPCR-F5和0卩0?-1?5各2.0 μ L，共11.5 μ L，50个反应体系共计575 μ L, -20 °C保存备用； (4)ExTaq酶:每个反应体系包括5 U/ μ L Ex Taq酶0.5 μ L，50个反应体系共计25μ L, _20°C保存备用； (5)探针溶液:如权利要求1所述的Taqman探针QPCR-P5，采用5’-FAM和3’ -TAMRA修饰，合成后采用无菌水稀释，浓度为10 μ mol/L，每个反应体系0.4 μ L，50个反应体系共计20 μ L，_20°C保存备用； (6)无菌水:2X10 m L/瓶。
【文档编号】C12R1/01GK103555844SQ201310548336
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月7日 优先权日:2013年11月7日
【发明者】高三基, 葛丹凤, 付卫林, 吴小斌, 林艺华, 孙生仁, 陈如凯, 傅华英 申请人:福建农林大学