一种鉴别吉富罗非鱼性别的实时荧光pcr方法及引物组的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种吉富罗非鱼鱼种性别的实时荧光PCR方法，属于分子生物学【技术领域】。本研究通过选择吉富罗非鱼性别相关基因AMH，该基因在雌雄鱼中表达量存在显著的差异。设计一对特异的实时荧光PCR引物，通过和成鱼卵巢AMH基因的表达量进行比较来鉴定罗非鱼鱼种性别。本发明所建立的方法具有特异性强、可信度高，可应用于罗非鱼鱼种阶段的性别鉴定。
【专利说明】—种鉴别吉富罗非鱼性别的实时荧光PCR方法及引物组
[0001]
【技术领域】[0002]本发明涉及一种吉富罗非鱼鱼种性别的实时荧光PCR方法，还涉及该方法所用的引物组，属于分子生物学【技术领域】。
[0003]【背景技术】
[0004]吉富罗非鱼属于鲈形目、鲡鱼科，罗非鱼属。由于它食性杂，耐低氧，生长快，抗病力强，现已成为世界性的养殖鱼类。在养殖过程中雌雄罗非鱼生长差异明显，雄鱼比雌鱼生长快，常常导致出池规格相差悬殊，从而降低了商品鱼的质量，减少了经济效益。因此开展吉富罗非鱼性决定机制研究，探索吉富罗非鱼全雄育种技术，对于罗非鱼养殖产业的发展具有重要的经济效应和社会效应。
[0005]在吉富罗非鱼性别决定机制研究中，常常涉及到性别相关基因的克隆及其时空表达研究。在时空表达研究中，鱼种阶段是个关键期，这时性别已经分化，但仅凭肉眼观察很难分辨雌雄鱼。通过乳酸醋酸地衣红压片法可区分雌雄鱼，但该方法费时费力，也影响后续实验的连贯性。因此迫切需要通过一种简便的方法来鉴定吉富罗非鱼鱼种阶段的性别。
[0006]
【发明内容】
[0007]本研究通过选择吉富罗非鱼性别相关基因AMH，该基因在雌雄鱼中表达量存在显著的差异，设计一对特异的实时荧光PCR引物，通过和成鱼卵巢AMH基因的表达量进行比较来鉴定吉富罗非鱼鱼种性别。
[0008]一种鉴别吉富罗非鱼性别的实时荧光PCR方法，包括如下步骤:
第1步、提取吉富罗非鱼的RNA，反转录成cDNA ；
第2步、以吉富罗非鱼的AMH基因的正向和反向引物、以及β-actin管家基因的正向和反向引物，对反转录的cDNA进行实时荧光PCR扩增；
第3步、通过双标准曲线法考察吉富罗非鱼的AMH基因的相对表达量，如果鱼种性腺中AMH表达量比成鱼卵巢高10倍以上，鱼种则为雄鱼，如果小于或等于10倍，鱼种则为雌鱼；其中，
AMH 基因的正向引物的序列是:5’ -3’ GGAACGGGAACTGATACGAGATG(SEQ ID N0.1)，反向引物的序列是:5’ -3’ AGCAGGGTCTCGCTGGAGGA(SEQ ID N0.2)；
β -actin 基因的正向引物的序列是:5，-3，ATCCGTAAGGACCTGTACGCC(SEQ ID N0.3)，反向引物的序列是:5’ -3’ GTGGGGCAATGATCTTGATCTTC(SEQ ID N0.4)。
[0009]进一步地，第2步中实时荧光PCR扩增的程序可以是:94°C 3min,然后40个循环94°C 5s，62°C 20s，最后 72°C 3min，4°C保存。[0010]进一步地，在第3步中，双标准曲线法的标准曲线是以反转录的cDNA为模板，进行5倍系列稀释，选取5个浓度梯度进行实时荧光PCR，以Ct值为坐标，以稀释倍数的对数为纵坐标,获得相对定量标准曲线。
[0011]有益效果:本研究通过选择吉富罗非鱼性别相关基因AMH，该基因在雌雄鱼中表达量存在显著的差异。设计一对特异的实时荧光PCR弓|物，通过和成鱼卵巢AMH基因的表达量进行比较来鉴定罗非鱼鱼种性别。本发明所建立的方法具有特异性强、可信度高，可应用于罗非鱼鱼种阶段的性别鉴定。
[0012]
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1是实施例第二部分中的AMH基因表达的标准曲线图2是实施例第三部分中β -actin基因表达的标准曲线
【具体实施方式】
[0014]第一部分吉富罗非鱼AMH基因的测序
吉富罗非鱼血液基因组DNA提取，设计引物、PCR扩增，产物纯化，转入载体，蓝白斑筛选，质粒测序，所设计的引物序列为:
正向:GCTGTGTGCATTTCAGGAGACA反向:TGTCTCCTGAAATGCACACAGC
用此方法克隆所得吉富罗非鱼AMH基因含内含子的部分序列为(SEQ ID N0.5):GCTGTGTGCATTTCAGGAGACACACAGTACGTACTCCTGACAGGAAAATCATCAGAGGGGAGTGTTAACGACAGGTGGCATATTACGGCACAGACAAAACTGCCTCATATGA^-1^a ta tea tcttcttcattttatt tcccca tctctggtteattgtgtaccctacttacattt`cctcteattgia^-AGCAAAACCTAAAAAGCATCTTGATTGGTGAAAAATCAGGAAGTAACATCAGCACGAGTCCACTTCTACTTTTCTCCGGGGGAACGGGAACTGATACGAGrtcaccccegctttctttc tgc tgaca t tcac tgtcgt c a gaga egege tcagc 11 tggt ttttatttt tgc 11 tcccagK\^\GCTTCAGGCTCGCCCCCGGCATCTCTGCAAACCTCCTTCCTTTGTGAGATGAATCGCTTGCTGGGTGCTGTGCTCCCTCAGGAACACTTCGCGTCCCCTCCACTTCCTCTGGACTCCTTACAGTCTCTGCCTCCCCTCTCGCTTGGCTTATCCTCCAGCGAGACCCTGCTGGCAGTAATGATCAACTCCACAGCTCCCACAGTCTTTGGCTTCACGAGTTGGGGCTCCGTGTTGCCGGTGTGGCACGGAGAGCTAGCCCTGTCTGCTGCAATGTTAGAGGAGCTCAGACAGAGACTCGACCAGACTTTGGTGCAAATGACAGAAATAATCAGAGAGGAATAGGTTTCACCGGGAGCCAAGGAGAGCCTGGGGAGGCTCAAAGAACTGAGTGCATTACAGGAGAAAGA
其中，大写字母为外显子，小写字母为内含子，下划线为real tim PCR引物设计时采用的序列。PCR 扩增的反应条件为:95°C 3min ; [30 循环 94°C 30s、57°C 30s、72°C lmin]；72°C延长8min ;4°C度保存。
[0015]然后根据该基因序列设计正向和反向实时荧光PCR扩增引物。
[0016]第二部分吉富罗非鱼AMH基因标准曲线的建立
取吉富罗非鱼成鱼卵巢，参照说明书，用Trizol裂解法抽提总RNA。用1 μ g总RNA，以Oigo dT Primer 和 Random 6 mers 为引物(Takara,大连)，根据 M-MLV (Takara,大连)使用说明进行反转录反应，反应总体积为10 μ 1。以反转录的cDNA为模板，进行5倍系列梯度稀释，选取选取5°飞_4共5个浓度梯度进行实时荧光PCR扩增，引物见表1。以Ct值为坐标，以稀释倍数的对数为纵坐标，获得相对定量标准曲线。结果显示，标准曲线方程为y==-0.2874X+10.30，其相关系数为 r2=0.973，如图 1。
[0017]表1实验中的实时荧光PCR引物
【权利要求】
1.一种鉴别吉富罗非鱼性别的实时荧光PCR方法，包括如下步骤:第1步、提取吉富罗非鱼的RNA，反转录成cDNA ；第2步、以吉富罗非鱼的AMH基因的正向和反向引物、以及β-actin管家基因的正向和反向引物，对反转录的cDNA进行实时荧光PCR扩增；第3步、通过双标准曲线法测定吉富罗非鱼的AMH基因的相对表达量，如果鱼种性腺中AMH表达量比成鱼卵巢高10倍以上，鱼种则为雄鱼，如果小于或等于10倍，鱼种则为雌鱼；其中，AMH基因的正向引物的序列如SEQ ID N0.1所示，反向引物的序列如SEQ ID N0.2所示；β-actin基因的正向引物的序列如SEQ ID N0.3所示，反向引物的序列如SEQ ID N0.4所示。
2.根据权利要求1所述的鉴别吉富罗非鱼性别的实时荧光PCR方法，其特征在于:所述的第2步中实时荧光PCR扩增的程序是:94°C 3min,然后40个循环94°C 5s，62°C 20s,最后 72°C 3min，4°C 保存。
3.根据权利要求1所述的鉴别吉富罗非鱼性别的实时荧光PCR方法，其特征在于:所述的在第3步中，双标准曲线法的标准曲线是以反转录的cDNA为模板，进行5倍系列稀释，选取5个浓度梯度进行实时荧光PCR，以Ct值为坐标，以稀释倍数的对数为纵坐标，获得相对定量标准曲线。
4.一种鉴别吉富罗非鱼性别的引物组，其特征在于:所述的引物组的一对正向和反向引物的序列如SEQ ID N0.1~2所示。
【文档编号】C12N15/11GK103667449SQ201310548365
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月7日 优先权日:2013年11月7日
【发明者】唐永凯, 李建林, 李红霞, 俞菊华, 徐跑 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心