一种快速高效的小麦条锈菌rna提取方法
【专利摘要】RNA(Ribonucleic?acid)在活体生物细胞内普遍存在，是生物的遗传信息中间载体，参与DNA的转录和蛋白质的合成。随着环境因子发生改变，RNA会在第一时间作出反应，离体RNA或者死亡细胞的RNA极易降解。因此，RNA被作为检测当前有活性微生物状态的第一指标。提取完整的、高质量的小麦条锈菌(Puccinia?striiformis?f.sp.tritici)夏孢子RNA是进一步开展转录组学、条锈菌存活数量监测等研究的基础。建立的小麦条锈菌RNA提取方法涉及的关键技术包括试验材料完全转移、防止氧化等。保障小麦条锈菌完全转移及提高研磨效果的关键预处理溶液是pH为8.0的0.01M?Tris-HCl；涉及的防止氧化的主要成分有1％SDS(W∶V)、1％β-巯基乙醇(V∶V)和16％PVP(W∶V)。
【专利说明】一种快速高效的小麦条锈菌RNA提取方法
[0001]【技术领域】:本发明涉及一种快速高效的小麦条锈菌RNA提取方法。
[0002]技术背景:小麦条锈菌是专性寄生菌，不能利用培养基进行人工培养，其繁殖体夏孢子、冬孢子、吸器、菌丝体等难以获得，其小麦条锈菌夏孢子RNA的提取受诸多条件制约显得更加困难。传统的夏孢子提取方法是称取几十克的夏孢子转移到研钵中液氮研磨。但在提取过程中发现，将称取好的夏孢子倒入液氮中时，夏孢子由于质量很轻容易飞溅，而且一少部分夏孢子会沾到管壁上，不能完全转移到研钵中。同时，液氮研磨后转移材料时发现，研磨后的夏孢子容易沾到研钵底部，很难完全刮取下来。以上几种原因常常导致大量夏孢子在提取过程中被损失掉了。目前，小麦条锈菌RNA提取多采用试剂盒的方法，但成本很闻。
[0003]我们研制出了一种可快速、大量、高效、低成本的针对小麦条锈菌RNA的提取方法。具体步骤如下:
[0004]1.在RNA超净工作台中，取出需要数量的2.0mL RNase free离心管，加入800 μ L裂解提取液(裂解提取液成分是:0.02Μ Tris-HCl pH = 8.0 ；0.2MNaCl ；0.005M EDTA ；1%SDS) ,1% β~巯基乙醇和16% PVP各10 μ L，混匀后将离心管置于冰上，备用。
[0005]2.称取5mg小麦条锈菌夏孢子,装于1.5mL离心管中，轻轻弹管壁,至所有孢子置于管底。在管中加入30 μ L的0.01M Tris-HCl (pH = 8.0)，冰浴静置5min帮助缓冲液渗入孢子中。
[0006]3.在预冷研钵中加入20mL液氮速冻研钵，同时将上述离心管在新液氮中速冻，待液氮沸腾停止后，倒转离心管在桌上轻轻一置，管中的孢子和缓冲液呈完整冰坨状与管底剥离，倒入预冷的研钵中。加入液氮快速用力研磨2-3次后，将细末粉状物刮取下来，集中转移至前期准备好的装有裂解提取液的2.0mL的离心管中，涡旋2min后，冰浴静置lOmin。
[0007]4.加入萃取液，其主要成分有约270 μ L的5M NaAc (pH = 4.8)和750 μ L的酚:氯仿:异戊醇(25: 24: 1)，冰浴静置1011^11，41:，12000印111离心151^11，取上清(约1000 μ L)转入无RNA的2.0mL离心管，加入约300 μ L的5MNaAc (pH = 4.8)和700 μ L的氯仿，冰浴静置8min, 4°C, 12000rpm离心15min,取上清,转入RNase free的2.0mL离心管,加入约 120 μ L 的 3M NaAc (pH = 5.2)和 800 μ L 的异丙醇，_20°C放置 30min，4°C，12000rpm离心15min,弃上清。
[0008]5.加入500 μ L的80 %乙醇，轻轻弹管壁帮助洗涤沉淀，4 °C，12000rpm离心IOmin，弃上清，加入500 μ L的无水乙醇，轻轻弹管壁帮助洗涤沉淀，4 °C，12000rpm离心IOmin,弃上清。
[0009]6.加入经DEPC处理的RNase free水43.5 μ L溶解RNA，然后加入5 μ L的IOXDNase BufferU μ L DNaseI 和 0.5 μ L 的 RNase 酶抑制剂，轻微混匀后 37°C水浴 30min。
[0010]7.加入约 5 μ L 的 3Μ NaAc (pH = 5.2)和 165 μ L 的异丙醇，沉淀 30min，4 °C，12000rpm离心15min,弃上清。
[0011]8.加入500yL的80%乙醇，轻轻弹管壁帮助洗涤沉淀，4°C，12000rpm离心IOmin,弃上清,加入500 μ L的无水乙醇,4°C，12000rpm离心IOmin,弃上清。加入DEPC处理的RNase free水20 μ L溶解RNA，_80°C保存备用。
[0012]通过前述步骤就可以准确、简便、快速的提取到完整的小麦条锈菌RNA。以下展示的是本发明相关试验所获得的一些结果。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]附图1:用不同方法从离心管和研钵中完全转移小麦条锈菌夏孢子。图A夏孢子从离心管中转移后情况，图B夏孢子在研钵中残留情况。两图中从左到右依次表示硅藻土和夏孢子(1:1)，纯夏孢子，石英砂和夏孢子(1:1) O
[0014]附图2:四种方法提取小麦条锈菌夏孢子总RNA的电泳图。泳道1-4分别是纯夏孢子，石英砂处理，娃藻土处理和滑石粉处理。取4μ L总RNA混合I μ LlOXLoading Buffer进行上样，电压120伏，15分钟。
[0015]附图3:用Tris-HCl (pH = 8.0)方法从离心管和研钵中完全转移小麦条锈菌夏孢子。图A所示夏孢子从离心管中转移情况。左边是直接转移夏孢子到研钵中后，有夏孢子残留在管壁上；右边是用Tris-HCl (pH = 8.0)方法转移夏孢子，管壁上没有孢子残留。图B所示夏孢子在研钵中残留情况。左边是直接液氮研磨夏孢子后，大量夏孢子粘附在研钵中；右边是用Tris-HCl (pH = 8.0)方法液氮研磨夏孢子后,研钵中无夏孢子残留。图C所示总RNA完整性电泳图，泳道I是纯夏孢子，泳道2是Tris-HCl (pH = 8.0)法。取4 μ L总RNA混合I μ LlOXLoading Buffer进行上样，电压120伏，15分钟。
[0016]附图4:用Tris-HCl (pH = 8.0)和DEPC水的方法从离心管和研钵中完全转移小麦条锈菌夏孢子。图A所示夏孢子从离心管中转移情况。图B所示夏孢子在研钵中残留情况。从左到右依次是Tris-HCl (pH = 8.0)和DEPC水法。图C所示RNA完整性电泳图，泳道1-3分别代表纯夏孢子，Tris-HCl (pH = 8.0)法和DEPC水法。取4 μ L总RNA混合I μ LlOXLoading Buffer进行上样，电压 120伏，15分钟。
[0017]附图5:用不同方法提取小麦条镑菌RNA后,夏抱子在研鉢中残留情况。图A从左到右依次是纯夏孢子，Tris-HCl (pH = 8.0)和Bizol水法提取RNA。图B所示RNA完整性电泳图，泳道1-3分别是纯夏孢子，Tris-HCl (pH = 8.0)法和Bizol水法。取4 μ L总RNA混合I μ LlOXLoading Buffer进行上样，电压120伏，15分钟。
[0018]附图6:用三种不同的RNA裂解液提取小麦条锈菌夏孢子RNA。A，B，C，D和E分别表示提取1，5，10，20和30mg小麦条锈菌夏孢子的电泳图。F代表液氮研磨后小麦条锈菌在研钵中的残留情况(从左到右依次是:LiCl，SDS和NaCl法)。泳道1_3在A，B, C，D四张图中分别代表用LiCl，SDS和NaCl法提取RNA。
[0019]附图7:比较三种方法(LiCl，SDS和NaCl)提取小麦条锈菌总RNA。实线代表纯化后的总RNA，虚线代表粗提的RNA。
[0020]附图8:用三种裂解液法提取5mg小麦条锈菌夏孢子总RNA，并将其反转录成cDNA后用小麦条锈菌的延伸因子EF-1进行普通PCR及电泳检测，产物大小为159bp。泳道1_4分别代表阴性对照，LiCl, SDS’ NaCl法。
[0021 ] 实验I小麦条锈菌夏孢子完全转移方法研究
[0022]方法说明:
[0023]小麦条锈菌体积小，质量轻，在称量转移时容易飞散和粘附离心管壁，在液氮研磨中容易飞溅和粘附研钵底部，从而造成大量RNA损失。本实验通过比较添加不同固体物质(石英砂、滑石粉和硅藻土)和不同液体缓冲液(Tris-HCl，pH = 8.0 ;Bizol和DEPC水)来帮助夏孢子转移的优劣情况，确定最优的小麦条锈菌夏孢子完全转移方法为Tris-HCl (pH=8.0)法。具体操作如下:
[0024]表1不同固体处理方法转移小麦条锈菌夏孢子
[0025]
【权利要求】
1.一种快速高效的小麦条锈菌RNA提取方法，包括试验材料预处理、裂解、RNA萃取、RNA沉淀、及洗涤沉淀步骤，其特征在于，在试验材料预处理过程中采用了 pH8.0的0.01MTris-HCl前期预处理溶液，其能帮助研磨和完全转移小麦条锈菌。
2.权利要求1所述的提取方法，其中裂解步骤中采用的裂解提取液包含如下成分:0.02M Tris-HCl pH = 8.0,0.2M NaCl, 0.005M EDTA, 1% SDS (W: V)。
3.权利要求2所述的提取方法，其中裂解提取液体还包含防止氧化的成分，I% β-巯基乙醇(V: V)和 16% PVPCw: V)。
4.根据权利要求1-3任一项所述的提取方法，其中所述方法具体如下:(I)试验材料完全转移及防止氧化的预处理:称取5mg小麦条锈菌夏孢子，装于1.5mL离心管中，轻轻弹管壁，至所有孢子置于管底，在管中加入30 μ L前期预处理液，冰浴静置5min，在预冷研钵中加入约30mL液氮速冻研钵，同时将上述离心管在新液氮中速冻，待液氮沸腾停止后，将管中的孢子转移至经液氮预冷的研钵中，快速用力研磨2-3次，每次加入20-30mL的液氮，之后，将细末粉状物刮取下来，转移至前期准备好的装有800 μ L裂解提取液的2.0mL的离心管中，在涡旋仪上涡旋2min后，冰浴静置IOmin ; (2)萃取，去除杂质:加入萃取液，颠倒混匀后，冰浴静止IOmin, 4°C，12000rpm离心15min,取上清；加入300 μ L的ρΗ4.85Μ NaAc和700 μ L的氯仿,颠倒混匀,冰浴静止8min, 4°C, 12000rpm离心15min,取上清；(3) RNA沉淀:加入常规RNA沉淀液，_20°C放置30min，4°C，12000rpm离心15min，弃上清，加入500 μ L的80%乙醇洗涤沉淀，4°C，12000rpm离心lOmin，弃上清，加入500 μ L的无水乙醇洗涤沉淀，4°C, 12000rpm离心IOmin,弃上清,得到小麦条锈菌RNA。
5.根据权利要求4所述提取方法，其中萃取液包含如下成分:pH= 4.8的5M NaAc和酚:氯仿:异戊醇=25: 24: I。
6.根据权利要求1-5任一项所述的提取方法，该方法适用于小麦条锈菌夏孢子、菌丝体、吸器、冬孢子的R NA提取。
【文档编号】C12R1/645GK103589714SQ201310548719
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月8日 优先权日:2013年11月8日
【发明者】胡小平, 马丽杰 申请人:西北农林科技大学