木聚糖酶的制备方法
【专利摘要】本发明涉及微生物发酵和酶工程【技术领域】，尤其涉及一种毕赤酵母工程菌发酵生产的饲用木聚糖酶的制作方法。木聚糖酶的制备的方法，包括下述的步骤：活化菌种；扩大培养；二次扩大培养；发酵；过滤；超滤浓缩；加入防腐剂混合均匀，精滤，除菌，灌装。采用本发明的方法所制备得到的木聚糖酶，和普通的木聚糖酶制作方法相比，无论是从耐酸性还是从耐热性方面来看，都明显地具有优势。
【专利说明】木聚糖酶的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物发酵和酶工程【技术领域】，尤其涉及一种毕赤酵母工程菌发酵生产的饲用木聚糖酶的制作方法。
[0002]【背景技术】
木聚糖酶主要分解由五碳糖聚合而成的半纤维素、木聚糖成为五碳糖，如木糖、木二糖、木三糖和少量的阿拉伯糖，是饲料主要用酶之一，木聚糖酶是市场上应用最广泛的单酶制剂之一，而且也是绝大多数饲用复合酶制剂的主要组成成分。
[0003]木聚糖酶在饲料、食品、纺织、造纸和日用化工等行业都有着极其广泛的用途。可添加到饲料中，其效果已得到公认，欧洲国家的饲料中90%以上添加了木聚糖酶；可促进果汁和啤酒的澄清；可用于制备低聚木糖；可作为食品添加剂，在烘烤食品中代替卵磷脂而提高烘烤物品的质量；可用于造纸工业无氯生物制浆和预漂白，可增加纸张的亮度而不影响纸张的强度，市场容量很大。目前国内生产木聚糖酶的厂家较少，酶活力单位较低，质量不稳定，木聚糖酶产品主要依靠进口。
[0004]目前大多数木聚糖酶的最适温度在40_60°C之间。由于酶在饲料、工业生产、食品加工过程中要经受高温高湿工序，如制粒等，饲用酶还要经受胃酸和胃蛋白酶的损害，这就要求相应酶种具有良好 的耐热性和耐酸性，良好的木聚糖酶应具有较宽的温度及中性酸性PH作用范围，保证既能在动物体温的温度下表现有较高的酶活，又能对饲料高温高湿制粒过程中表现出较高的耐受性；既能耐受胃酸的损害，在胃的酸性环境及小肠的中性环境下也能具有较高的酶活表现。
[0005]本发明拟采用基因工程技术构建含有耐热耐酸木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌，闻效表达获得新型的木聚糖酶。
【发明内容】
[0006]为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种耐热性和耐酸性好的木聚糖酶的制
备方法。
[0007]本发明是通过下述的技术方案来实现的:
木聚糖酶的制备的方法，包括下述的步骤:
活化菌种:用Yro培养基(酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)，对含有耐热植酸酶基因的毕赤酵母工程菌进行活化，活化条件为28-32°C，20-26h ；
扩大培养:将活化好的菌种接入摇瓶中，于28-32°C下，以180-220r/min的转速进行扩
大培养；
二次扩大培养:22-26h后接入种子罐，28-32°C条件下进一步扩大培养；
发酵:经种子罐扩大培养后，接入发酵罐，28-32°C下，pH4.6-4.8条件下进行发酵，140-160h后发酵结束；
过滤:将发酵结束的料液，加入1%的硅藻土，混合均匀后，打入板框压滤机进行过滤，过滤压力〈0.5MPa ；超滤浓缩:过滤澄清后，用膜分子量1000ODa的有机膜进行超滤浓缩，浓缩至所需要的酶活；加入防腐剂，防腐剂包括盐和山梨酸钾；盐的浓度为8-12%，山梨酸钾的浓度为1-3%0 ；加入上述的防腐剂后，与滤液混合均匀，在小于0.5Mpa的压力下，精滤、除菌，灌装。[0008]优选的，上述的活化菌种的步骤中，活化条件为:30°C，24h。[0009]上述的扩大培养的条件是，于30°C下，以200r/min的转速进行扩大培养。[0010]上述的二次扩大培养的温度是30°C。[0011]上述的发酵步骤的条件是，30°C下，pH4.6-4.8的条件下进行发酵。[0012]上述的除菌步骤中，酶制剂中每毫升细菌总数小于5X104cfu。[0013]上述的扩大培养所用的培养基为:酵母粉0.5-2%、蛋白胨1_3%、葡萄糖1-4%。[0014]优选的，上述的扩大培养所用的培养基为:酵母粉1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%。[0015]上述的二次扩大培养所用的培养基为:葡萄糖2-6%，硫酸钙0.03-0.09%,磷酸二氢铵3.0-4.5%，氢氧化钾0.05-0.2%，磷酸二氢钾0.2-0.6%，硫酸钾1.0-1.5%，硫酸镁 0.8-1.2%。[0016]优选的，上述的二次扩大培养所用的培养基为:葡萄糖4%，硫酸钙0.07%，磷酸二氢铵3.8%,氢氧化钾0.1%,磷酸二氢钾0.4%,硫酸钾1.3%,硫酸镁1%。[0017]本发明的有益效果在于，采用本发明的方法所制备得到的木聚糖酶，和普通的木聚糖酶制作方法相比，无论是从耐酸性还是从耐热性方面来看，都明显地具有优势: 从耐热性上看，本发明的木聚糖酶最适温度为60°C，在30-70°C范围内，相对酶活保持 80%以上，耐热性好；而普通的木聚糖酶其耐热性，在30-70°C范围内，相对酶活保持60%。[0018]从耐酸性上看，本发明的木聚糖酶最适pH为5.0，在pH3.7-7.0范围内，相对酶活保持80%以上，适于在动物胃肠道中发挥作用；普通的木聚糖酶在pH3.7-7.0范围内，相对酶活保持65%。【具体实施方式】[0019]下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。[0020]实施例1木聚糖酶的制备的方法，包括下述的步骤:活化菌种:用Yro培养基，对含有耐热植酸酶基因的毕赤酵母工程菌进行活化，活化条件为30°C，24h，YPD培养基为酵母浸出粉胨葡萄糖培养基；扩大培养:将活化好的菌种接入摇瓶中，于30°C下，以200r/min的转速进行扩大培养； 扩大培养所用的培养基为:酵母粉1%、蛋白胨2%、葡萄糖2% ；二次扩大培养:24h后接入种子罐，30°C条件下进一步扩大培养；二次扩大培养所用的培养基为:葡萄糖4%，硫酸钙0.07%,磷酸二氢铵3.8%，氢氧化钾0.1%，磷酸二氢钾0.4%，硫酸钾1.3%，硫酸镁1% ；发酵:经种子罐扩大培养后，接入发酵罐，30°C下，PH4.7条件下进行发酵，150h后发酵结束；过滤:将发酵结束的料液，加入1%的硅藻土，混合均匀后，打入板框压滤机进行过滤，过滤压力〈0.5MPa ；
超滤浓缩:过滤澄清后，用膜分子量1000ODa的有机膜进行超滤浓缩，浓缩至所需要的酶活；
加入防腐剂，防腐剂包括盐和山梨酸钾；
防腐剂的浓度为10%，山梨酸钾的浓度为2%。；
加入上述的防腐剂后，与滤液混合均匀，在小于0.5Mpa的压力下，精滤、除菌，灌装；除菌步骤中，使酶制剂中每毫升细菌总数小于5X 104cfu。
[0021]实施例2
木聚糖酶的制备的方法，包括下述的步骤:
活化菌种:用Yro培养基，对含有耐热植酸酶基因的毕赤酵母工程菌进行活化，活化条件为28°C，24h，YPD培养基为酵母浸出粉胨葡萄糖培养基；
扩大培养:将活化好的菌种接入摇瓶中，于28°C下，以180r/min的转速进行扩大培养；扩大培养所用的培养基为:酵母粉0.5%、蛋白胨1%、葡萄糖1% ；
二次扩大培养:24h后接入种子罐，28°C条件下进一步扩大培养；二次扩大培养所用的培养基为:葡萄糖2%，硫酸钙0.03%，磷酸二氢铵3.0%，氢氧化钾0.05%，磷酸二氢钾0.2%，硫酸钾1.0%，硫酸镁0.8% ；
发酵:经种子罐扩大`培养后，接入发酵罐，28°C下，pH4.6条件下进行发酵，140h后发酵结束；
过滤:将发酵结束的料液，加入1%的硅藻土，混合均匀后，打入板框压滤机进行过滤，过滤压力〈0.5MPa ；
超滤浓缩:过滤澄清后，用膜分子量1000ODa的有机膜进行超滤浓缩，浓缩至所需要的酶活；
加入防腐剂，防腐剂包括盐和山梨酸钾；
防腐剂的浓度为8%，山梨酸钾的浓度为I %。；
加入上述的防腐剂后，与滤液混合均匀，在小于0.5Mpa的压力下，精滤、除菌，灌装；除菌步骤中，使酶制剂中每毫升细菌总数小于5X 104cfu。
[0022]实施例3
木聚糖酶的制备的方法，包括下述的步骤:
活化菌种:用Yro培养基，对含有耐热植酸酶基因的毕赤酵母工程菌进行活化，活化条件为32°C，26h，YPD培养基为酵母浸出粉胨葡萄糖培养基；
扩大培养:将活化好的菌种接入摇瓶中，于32°C下，以220r/min的转速进行扩大培养；扩大培养所用的培养基为:酵母粉2%、蛋白胨3%、葡萄糖4% ；
二次扩大培养:26h后接入种子罐，32°C条件下进一步扩大培养；二次扩大培养所用的培养基为:葡萄糖6%，硫酸钙0.09%,磷酸二氢铵4.5%，氢氧化钾0.2%，磷酸二氢钾0.6%，硫酸钾1.6%，硫酸镁1.2% ；
发酵:经种子罐扩大培养后，接入发酵罐，32°C下，pH4.8条件下进行发酵，160h后发酵结束；
过滤:将发酵结束的料液，加入1%的硅藻土，混合均匀后，打入板框压滤机进行过滤，过滤压力〈0.5MPa ；超滤浓缩:过滤澄清后，用膜分子量1000ODa的有机膜进行超滤浓缩，浓缩至所需要的酶活；加入防腐剂，防腐剂包括盐和山梨酸钾；防腐剂的浓度为12%，山梨酸钾的浓度为3%。；加入上述 的防腐剂后，与滤液混合均匀，在小于0.5Mpa的压力下，精滤、除菌，灌装；除菌步骤中，使酶制剂中每毫升细菌总数小于5X 104cfu。
【权利要求】
1.木聚糖酶的制备的方法，包括下述的步骤:活化菌种:用Yro培养基，对含有耐热植酸酶基因的毕赤酵母工程菌进行活化，活化条件为28-32°C，20-26h，所述的YPD培养基为酵母浸出粉胨葡萄糖培养基；扩大培养:将活化好的菌种接入摇瓶中，于28-32°C下，以180-220r/min的转速进行扩大培养；二次扩大培养:22-26h后接入种子罐，28-32°C条件下进一步扩大培养；发酵:经种子罐扩大培养后，接入发酵罐，28-32°C下，pH4.6-4.8条件下进行发酵， 140-160h后发酵结束；过滤:将发酵结束的料液，加入1%的硅藻土，混合均匀后，打入板框压滤机进行过滤， 过滤压力〈0.5MPa ；超滤浓缩:过滤澄清后，用膜分子量1000ODa的有机膜进行超滤浓缩，浓缩至所需要的酶活；加入防腐剂，所述的防腐剂包括盐和山梨酸钾；盐的浓度为8-12%，山梨酸钾的浓度为1_3%。；加入上述的防腐剂后，与滤液混合均匀，在小于0.5Mpa的压力下，精滤、除菌，灌装。
2.如权利要求1所述的木聚糖酶的制备的方法，其特征在于，所述的活化菌种的步骤中，活化条件为:30°C，24h。
3.如权利要求1所述的木聚糖酶的制备的方法，其特征在于，所述的扩大培养的条件是，于30°C下，以200r/min的转速进行扩大培养。
4.如权利要求1所述的木聚糖酶的制备的方法，其特征在于，所述的二次扩大培养的温度是30°C。
5.如权利要求1所述的木聚糖酶的制备的方法，其特征在于，所述的发酵步骤的条件是，30°C下，pH4.6-4.8的条件下进行发酵。
6.如权利要求1所述的木聚糖酶的制备的方法，其特征在于，所述的除菌步骤中，酶制剂中每毫升细菌总数小于5X 104cfu。
7.如权利要求1所述的木聚糖酶的制备的方法，其特征在于，所述的扩大培养所用的培养基为:酵母粉0.5-2%、蛋白胨1-3%、葡萄糖1-4%。
8.如权利要求1所述的木聚糖酶的制备的方法，其特征在于，所述的扩大培养所用的培养基为:酵母粉1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%。
9.如权利要求1所述的木聚糖酶的制备的方法，其特征在于，所述的二次扩大培养所用的培养基为:葡萄糖.2-6%，硫酸钙0.03-0.09%,磷酸二氢铵3.0-4.5%，氢氧化钾 0.05-0.2%，磷酸二氢钾 0.2-0.6%，硫酸钾 .1.0-1.5%，硫酸镁 0.8-1.2%。
10.如权利要求1所述的木聚糖酶的制备的方法，其特征在于，所述的二次扩大培养所用的培养基为:葡萄糖.4%，硫酸钙0.07%，磷酸二氢铵3.8%，氢氧化钾0.1%，磷酸二氢钾.0.4%，硫酸钾1.3%， 硫酸镁1%。
【文档编号】C12R1/84GK103602645SQ201310558478
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月12日 优先权日:2013年11月12日
【发明者】郭芳坤, 吴秀玉, 刘延杰 申请人:济南天天香有限公司