一种丹参素的生物生产方法
【专利摘要】本发明公开了一种丹参素的生物生产方法，对羟基苯丙酮酸在对羟基苯乙酸间位羟基化酶的催化下合成3，4-二羟基苯丙酮酸，随后在D-乳酸脱氢酶的催化下合成丹参素；或者对羟基苯丙酮酸现在D-乳酸脱氢酶的催化下合成对羟基苯乳酸，然后在经过对羟基苯乙酸间位羟基化酶的催化，合成丹参素。本发明使用基因工程谷氨酸棒状杆菌和大肠杆菌，进行发酵生产丹参素，不需底物添加即可合成丹参素，实现了丹参素的从头合成，可解决丹参素的来源问题，同时最大限度的降低了生产成本，有利于工业化生产。
【专利说明】一种丹参素的生物生产方法
【技术领域】
[0001]本发明所属生物医药【技术领域】，涉及一种丹参素的生产方法，特别是丹参素的生物生产方法。
【背景技术】
[0002]丹参素(SalvianicacidA, Danshensu),属于酸性芳香类化合物，其化学名为β-(3，4-二羟基苯基)乳酸，也称丹参素甲，分子式为C9HltlO5，分子量为198.17。其多为棕黄色粉末或黄色粉末，纯品为白色长针状结晶，熔点84~86°C，密度1.546。最近的药理药效研究表明，丹参素可抑制血小板合成、聚集及释放TXA2等缩血管物质，提高心肌耐缺氧能力，保护心肌，增加冠脉流量。这些药理作用是丹参注射液治疗冠心病、心肌缺血的主要机制。因此丹参素在心脑血管疾病方面具有非常好的功能，如:抗血栓形成，抗动脉粥样硬化及降血脂，扩张冠状动脉，保护心肌线粒体免受氧自由基引发的脂质过氧化物的损伤等作用。同时一些研究也发现其在抗菌消炎及增强机体免疫，防止创面的过度愈合，治疗肝损伤，抗脑缺血损伤，素抗肿瘤，治疗银屑病等方面也有较好的作用。如天士力集团出品的复方丹参滴丸的主要有效成分之一就是丹参素。因此，丹参素拥有广阔的市场市场和前景。丹参素属于酸性芳香类化合物，是丹参水溶提取物的主要活性成分之一。到目前为止，从植物丹参中提取仍是生产丹参素的最主要的方法。我国目前是丹参素植物提取物的主要生产国家。传统的提取方法为水提醇沉，这也是目前制作注射液及口服液的主要提取方法。但不足之处是乙醇浓度过高，使原植物中的主要活性丹参素等酚性成分损失较大，含量不稳定。近年来出现了一些新的提取技术，如酶提法、CO2超临界萃取法、微波萃取法、超声萃取法等等。但仍然不能解决植物提取法面临的根本问题，如植物原料受限和质量不稳定、生产能力低、种植受到季节和地理位置的限制等等。虽然已有化学全合成丹参素的报道，但步骤复杂，产率低，环境污染严重。近年来，随着合成生物学技术的不断进步，使用重组微生物生产丹参素成为备受关注的方法。但目前为止还没有任何文献报道利用重组微生物合成丹参素。
【发明内容】
[0003]本发明的技术目的在于克服现有技术的不足，首次设计并构建了丹参素的生物合成途径，并成功突破了丹参素重组微生物合成的瓶颈，提供了一种全新的丹参素的生物生产方法，通过构建重组工程菌株，实现丹参素的从葡萄糖或者其他生物质能源为起始的生物合成，使生产成本最低化。
[0004]本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现:
[0005]一种丹参素的生物生产方法，按照下述步骤进行:
[0006]步骤1，设计·并优化对羟基苯乙酸间位羟基化酶(hpaB，hpaC)的基因序列，并全合成所述目标基因；
[0007]在所述步骤I中，依据大肠杆菌BL21 (DE3)菌株的对羟基苯乙酸间位羟基化酶(hpaB, hpaC)基因序列，设计引物并克隆,所述对羟基苯乙酸间位羟基化酶(hpaB, hpaC)的基因序列如序列表SEQ ID N0.1所不
[0008]步骤2，设计并优化D-乳酸脱氢酶(D-LCH)的基因序列，并全合成所述目标基因，并经过位点突变，获得D-乳酸脱氢酶基因序列的突变基因序列D-LCH (Y52V)和D-LCH(Y52A)；
[0009]在所述步骤2 中，以植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum) ATCC14917 的 D-乳酸脱氢酶(D-LCH)基因序列作为参考，设计PCR引物，以植物乳杆菌CICC21419的基因组为模板进行PCR反应，并克隆；所述D-乳酸脱氢酶(D-LCH)的基因序列如序列表SEQ IDN0.4所示，其对应的蛋白质序列中第52位氨基酸为酪氨酸(Y，Tyr);所述D-LCH (Y52V)的DNA序列如序列表SEQ ID N0.7所不,其对应的蛋白序列如序列表SEQID N0.8所不，与序列表SEQ IDN0.4编码的蛋白质相比，在第52位氨基酸突变为缬氨酸(Val)，表示为突变基因序列D-LCH (Y52V)；D-LCH (Y52A)的DNA序列如序列表SEQ IDN0.9所示，其对应的蛋白序列如序列表SEQ ID N0.10所示，与序列表SEQ ID N0.4编码的蛋白质相比，在第52位氨基酸突变为丙氨酸(Ala)，表示为突变基因序列D-LCH (Y52A)。 [0010]步骤3，设计并优化T7RNA聚合酶基因序列，并全合成所述目标基因；
[0011]在所述步骤3中，以大肠杆菌BL21 (DE3)基因组序列中的T7RNA聚合酶序列为参考，设计PCR引物，以大肠杆菌BL21 (DE3)基因组为模板进行PCR反应，得到T7RNA聚合酶基因以及其前面包含LacUV5启动子和IacI基因在内的一部分序列，并将其克隆；，所述T7RNA聚合酶基因序列如序列表SEQ ID N0.15所示，RNA聚合酶蛋白序列如序列表SEQ IDN0.16所示，并以此序列构建表达载体。
[0012]步骤4，将获得的对羟基苯乙酸间位羟基化酶基因序列SEQ ID N0.1、T7RNA聚合酶基因序列SEQ ID N0.15，与D-乳酸脱氢酶基因序列SEQ ID N0.4、突变基因序列D-LCH(Y52V) SEQ ID N0.7、或者突变基因序列D-LCH (Y52A) SEQ ID N0.9之一的序列进行配合构建表达载体，并转染大肠杆菌或者嵌入大肠杆菌基因组
[0013]在所述步骤4中，选择将对羟基苯乙酸间位羟基化酶基因序列SEQ ID N0.1分别与D-乳酸脱氢酶基因序列SEQ ID N0.4、突变基因序列D-LCH(Y52V)SEQ ID N0.7、突变基因序列 D-LCH(Y52A)SEQ ID N0.9 构建重组质粒(例如 pCDF-hpaBC-D-LCH、pCDF-hpaBC-D_LCH(Y52V)、pCDF-hpaBC-D-LCH (Y52A))，将上述重组质粒分别与利用T7RNA聚合酶基因序列SEQ ID N0.15构建的辅助质粒(例如pECXK99E_T7)转染大肠杆菌；所述大肠杆菌菌种名称为SyBE-002447，建议的分类命名为大肠埃希氏菌Escherichiacoli，现于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏中心登记入册编号为CGMCCN0.7962，保藏时间为2013年7月22日，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。
[0014]在所述步骤4的转染大肠杆菌过程中，以对羟基苯乙酸间位羟基化酶基因序列SEQ ID N0.1、T7RNA聚合酶基因序列SEQ ID N0.15与突变基因序列D-LCH (Y52A) SEQ IDN0.9转化高产酪氨酸的大肠杆菌(CGMCC N0.7962)得到的工程菌，取得相对较好的丹参素产量，将上述工程菌进行保藏，保藏信息如下:菌种名称为SyBE-002444，保藏中心登记入册编号为CGMCC N0.7961，建议的分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，现于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏时间为2013年7月22日，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。
[0015]在所述步骤4中，将对羟基苯乙酸间位羟基化酶基因序列SEQ ID N0.1、突变基因序列D-LCH(Y52A)SEQ IDN0.9嵌入高产酪氨酸大肠杆菌(CGMCC N0.7962)基因组中，选择将GAP启动子、RBS、hpaBC基因(对羟基苯乙酸间位羟基化酶基因序列SEQ ID N0.1)，D-LCH基因(突变基因序列D-LCH (Y52A) SEQ ID N0.9)和氯霉素基因序列SEQ ID N0.19利用重叠延伸方法构造GAP-RBS-hpaBC-RBS-D-LCH的串联片段，用λ - Red同源重组方法，将该串联片段插入到高产酪氨酸的大肠杆菌(CGMCC N0.7962)基因组ybhB和ybhC基因中间，经PCR和测序筛选得到正确菌株。
[0016]步骤5，利用步骤4得到的工程菌进行发酵生产丹参素；
[0017]在所述步骤5中，选择添加前体物对羟基苯丙酮酸和诱导剂异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。
[0018]本发明设计的丹参素的生物合成途径属于莽草酸途径，详细的合成途径如下:以葡萄糖/甘油或者其他生物质为碳源，经莽草酸途径合成对羟基苯丙酮酸。以芒草酸为底物合成丹参素有两条途径。一.对羟基苯丙酮酸在对羟基苯乙酸间位羟基化酶(hpaB, hpaC)的催化下合成3，4-二羟基苯丙酮酸，随后在D-乳酸脱氢酶(D-LCH)的催化下合成丹参素；二.对羟基苯丙酮酸现在D-乳酸脱氢酶(D-LCH)的催化下合成对羟基苯乳酸，然后在经过对羟基苯乙酸间位羟基化酶(hpaB，hpaC)的催化，合成丹参素。两条途径虽然合成的中间产物不一样，但实际上起催化作用的酶是一样的。本发明提供了一种用生物发酵生产丹参素的方法，使用基因工程谷氨酸棒状杆菌和大肠杆菌，进行发酵生产丹参素，不需底物添加即可合成丹参素，实现了丹参素的从头合成。本发明可以解决丹参素的来源问题，同时最大限度的降低了生产成本，有利于工业化生产。 【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是本发明使用的丹参素生物合成路线，其中I为TyrA，2为D-LCH，3为hpaB&C。图2是本发明P⑶F-hpaBC-D-LCH质粒构建过程。
[0020]图3是本发明产物验证的HPLC图谱，其中标准品为丹参素标准品(lg/L);对照为未加IPTG诱导基因基因表达；野生型为D-LCH基因未突变的表达载体；1为Y52V，即D-LCH(Y52V)突变的表达载体；2为Y52A，即D-LCH (Y52A)突变的表达载体。
[0021]图4是构建工程菌株发酵检测结果。
【具体实施方式】
[0022]下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。各个使用质粒具体信息如下:质粒pJETl.2购自北京全式金生物技术有限公司(北京市海淀区西小口路66号中关村东升科技园B-3号楼四层)；质粒pCDFDuet-l、pECXK99E、pKD46、pKD3和pcp20购自北京中原公司(北京市朝阳区东方东路11号)。
[0023]实施例1高产L-酪氨酸菌株的筛选
[0024]以与日本交换所获得的大肠杆菌BW25113(由日本国家遗传研究所在2009年2月通过赠送或交换获得，提供者联系方式为矢田1111，三岛，静网县411-8540，日本)为出发菌株，在LB培养基(10g/lNaCl，10g/l蛋白胨，5g/l酵母提取物)中进行(紫外)诱变培养，并分离出候选菌株，进行发酵检测L-酪氨酸产量。
[0025]将50uL保存的候选菌株转接至含有5mLpH=7.0的LB培养基(并加入相应的抗生素:氨苄青霉素100ug/ml)的试管中，37°C，220rmp培养12h，后将500ul的过夜培养候选菌株转接至含有50mlpH=7.0的LB培养基(并加入相应的抗生素:氨苄青霉素100ug/ml)的250mL摇瓶中，370C，220rmp培养。当0D0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，继续培养3h。后将菌液离心，并重新悬浮于MOPS培养基(5g/l葡萄糖，lg/Ι酵母提取物，K2HPO40.3g/1，NH4Cl:2.54g/l, MgCl2:0.05g/l, K2SO4:0.05g/l, FeSO4:0.0015g/l, CaCl2:0.05g/l,NaCl:3g/l, MOPS:9.24g/l，甘氨酸:0.3g/l)中，IPTG (IPTG:异丙基-β _D_ 硫代吡喃半乳糖苷，由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司购买，地址:北京市昌平区北七家镇北顺工业园区东沙384号)浓度为0.5mM,发酵24h后检测酪氨酸产量。
[0026]发酵结束后，取ImL发酵液12000r/min离心5min，取上清，用0.22um的水系微孔滤膜过滤后进行HPLC检测。色谱条件如下:色谱柱:C18 (4.6X 250mm);流动相为20%甲醇-80%水-0.1%甲酸；流速为lmL/min ;进样量20ul ;紫外检测器，检测波长为281nm。最终获得702.7mg/l的酪氨酸，即高产酪氨酸菌株，建议的分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli,现于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,菌种名称为SyBE-002447，保藏中心登记入册编号为CGMCC N0.7962，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。
[0027]实施例2对羟基苯乙酸间位羟基化酶(hpaB, hpaC)序列获得和p⑶F_hpaBC的构建依据大肠杆菌BL21 (DE3)菌株的对羟基苯乙酸间位羟基化酶(hpaB，hpaC)基因序列，设计引物，并克隆(即由大肠杆菌BL21 (DE3)菌株提供对羟基苯乙酸间位羟基化酶的基因序列)。由于对羟基苯乙酸间位羟基化酶功能的实现需要hpaB和hpaC两个基因共同完成，在BL21(DE3)基因组中， hpaB和hpaC基因是相邻的，故克隆时是一起克隆下来并表达的。所述大肠杆菌BL21 (DE3)由北京全式金生物技术有限公司提供，北京市海淀区西小口路66号中关村东升科技园B-3号楼四层。对羟基苯乙酸间位羟基化酶(hpaB，hpaC)的基因序列如序列表SEQ ID N0.1所示。设计引物如下:
[0028]hpaBC-U(up)，如序列表 SEQ ID N0.2 所示:CGCGGATCCGATGAAACCAGAAGATTTCCGCG(下划线部分为BamHI酶切位点)；hpaBC_D (down),如序列表SEQ ID N0.3所示:CCCAAGCTTAAATCGCAGCTTCCATTTCC (下划线部分为 HindIII 酶切位点)
[0029]使用FASTpfu 酶进行 PCR，PCR 反应条件为:95°C，5min，I 个循环；95°C，30s，57°C，30s，72°C，lmin30s，共 30 个循环;72°C，5min，I 个循环;4°C保存。PCR 得至Ij 2000bp 左右的目标片段。将得到的PCR产物进行纯化后用BamHI和HindII酶进行酶切；连接到同样用BamHI和HindII进行酶切的p⑶FDuet-1载体上，构建重组质粒p⑶F_hpaBC载体，并转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态(需要说明的是此处仅仅用于验证基因的表达，故可使用的大肠杆菌为一般市售的大肠杆菌即可)。37°C复苏完成后涂布链霉素抗性LB平板，37°C培养12小时。然后以引物hpaBC-U (up,上段引物)和hpaBC-D (down,下段引物)进行菌落PCR验证，筛选阳性克隆，并将验证得到的阳性克隆株进行测序验证。
[0030]实施例3D-乳酸脱氢酶(D-LCH)序列获得以及p⑶F-hpaBC-D_LCH表达载体的构
建
[0031]以植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)ATCC14917 的 D-LCH 基因序列作为参考，设计PCR引物，以植物乳杆菌CICC21419 (在中国普通微生物菌种保藏管理中心购买，北京市朝阳区北辰西路I号院3号)的基因组为模板进行PCR反应，并克隆至pJETl.2载体上，送交测序。然后连接的以构建好的P⑶F-hpaBC载体上，最终获得的一个表达质粒P⑶F-hpaBC-D-LCH。经测序得到的D-LCH基因序列如序列表SEQIDN0.4所示，设计引物如下:
[0032]D-LCH-U (up)，如序列表 SEQ ID N0.5 所示:GGGAATTCCATATGAAAATTATTGCCTATGCTGTAC (下划线部分为NdeI酶切位点)；D-LCH-D (down)，如序列表SEQ ID N0.6所示:CGGGGTACCCAGTGATAATCGAGATTAGTCAAACT (下划线部分为 KpnI 酶切位点)
[0033]使用FASTpfu 酶进行 PCR，PCR 反应条件为:95°C，5min，I 个循环；95°C，30s，58°C，30s，72°C，45s，共30个循环；72°C，5min, I个循环；4°C保存。可得到1000bp左右片段。将得到的PCR产物进行纯化后，按照pJETl.2克隆试剂盒说明，将PCR片段连接到pJETl.2质粒上得到PJETl.2-D-LCH，并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态。37°C复苏完成后涂布氨苄青霉素抗性LB平板，37°C培养12小时。然后以引物D-LCH-U (up，上段引物)和D-LCH-D (down，下段引物)进行菌落PCR验证，筛选阳性克隆。并将验证得到的阳性克隆株进行测序验证。提取测序正确PJET1.2-D-LCH质粒，用Kpn I和Nde I酶进行酶切，回收D-LCH基因片段，连接到同样用Kpn I和Nde I酶切的pCDF_hpaBC质粒上，构建重组质粒pCDF-hpaBC-D-LCH，并转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态。37°C复苏完成后涂布链霉素抗性LB平板，37°C培养12小时。然后以引物D-LCH-U和D-LCH-D进行菌落PCR验证，筛选阳性克隆。并将验证得到的阳性克隆株进行测序验证。
[0034] 实施例4D-LCH基因的突变和表达载体pCDF-hpaBC-D-LCH (Y52V)和pCDF-hpaBC-D-LCH (Y52A)的构建
[0035]依据测序获得的植物乳杆菌CICC21419 (在中国普通微生物菌种保藏管理中心购买，北京市朝阳区北辰西路I号院3号)的D-LCH的序列设计突变引物，利用重叠延伸PCR技术，获得催化活性和底物专一性都得到提高的D-LCH (Y52V)和D-LCH (Y52A)突变基因。然后利用实施例2中类似的方法连接到pCDF-hpaBC上，获得CDF-hpaBC-D_LCH (Y52V)和P⑶F-hpaBC-D-LCH (Y52A)表达载体。上述实施例3中的D-LCH基因序列如序列表SEQ IDN0.4所示，其对应的蛋白质序列中第52位氨基酸为酪氨酸(Y，Tyr) ;D_LCH (Y52V)的DNA序列如序列表SEQ ID N0.7所不,其对应的蛋白序列如序列表SEQIDN0.8所不，与上述实施例3的D-LCH基因序列SEQ ID N0.4对应的蛋白质序列相比，在第52位氨基酸突变为缬氨酸(Val )，表示为Y52V ；D-LCH (Y52A)的DNA序列如序列表SEQ ID N0.9所示，其对应的蛋白序列如序列表SEQ ID N0.10所示，与上述实施例3的D-LCH基因序列SEQ ID N0.4对应的蛋白质序列相比，在第52位氨基酸突变为丙氨酸(Ala)，表示为Y52A。设计引物如下:
[0036]D-LCH-U (up)，如序列表 SEQ ID N0.5 所示:GGGAATTCCATATGAAAATTATTGCCTATGCTGTAC (下划线部分为NdeI酶切位点)；D-LCH-D (down)，如序列表SEQ ID N0.6所示:CGGGGTACCCAGTGATAATCGAGATTAGTCAAACT (下划线部分为 KpnI 酶切位点)；Y52V_D (down),如序列表 SEQ ID N0.11 所示:TTGTTGGACTACATCGGCACCGTCGAAG ;Y52V_U (up),如序列表 SEQ ID N0.12 所示:TgCCgATgTAgTCCAACAAAAggAC ;Y52A-D (down)，如序列表 SEQ IDN0.13 所示:TTGTTGGGCTACATCGGCACCGTCGAAG ;Y52A_U (up)，如序列表 SEQ ID N0.14 所示:TgCCgATgTAgCCCAACAAAAggAC[0037]以Y52A 的点突变为例:使用 FASTpfu 酶进行 PCR，以 D_LCH_U、Y52A-D 和 Y52A-U、D-LCH-D两对引物分别进行PCR反应，以P⑶F-hpaBC-D-LCH质粒为模板。由于反应条件相差不大，故一起做PCR反应。PCR反应条件为:95°C，5min，l个循环；95°C，40s，58°C，30s，72°C，45s，共 30 个循环;72°C，5min，l 个循环;4°C保存。PCR 得到一个 200bp 和一个 800bp左右的片段。将此PCR产物回收后，以这两个片段为模板，以D-LCH-U和D-LCH-D引物进行第二轮重叠延伸PCR，应条件如上。反应结束后将得到一个1000bp左右的条带。将此条带回收后，按照实施例2中类似的方法连接到pCDF-hpaBC上，筛选阳性克隆病测序验证。最终获得 pO)F-hpaBC-D-LCH (Y52V)和 pCDF-hpaBC-D-LCH (Y52A)两个表达载体。
[0038]实施例5验证hpaBC基因、D-LCH基因、D-LCH (Y52V)基因、D_LCH(Y52A)基因功能
[0039]将实施例3 和 4 中获得 pCDF-hpaBC-D-LCH、pCDF-hpaBC-D-LCH (Y52V)和pCDF-hpaBC-D-LCH (Y52A)三个表达载体，转化大肠杆菌BL21 (DE3)菌株。然后从转化的平板中挑取单菌落到5mlLB培养基中过夜培养。然后将将100 μ L过夜培养的菌液转接进入含有50mlLB培养基(加入相应的链霉素抗生素50ug/ml)的250ml摇瓶中，37°C，220rpm培养。当菌体0D600长至0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，继续培养3h，然后将菌液离心，并重新悬浮于50mLM9培养基(M9培养基配方=Na2HPO4.12H20:17.lg/1 ；KH2PO4:3g/I ；NaCl:0.5g/l ；NH4Cl:lg/l ；lmol/lMgS04:2mL ；20% 葡萄糖:20mL ；lmol/lCaCl2:0.1mL)中，并补充500mg/L的前体物-对羟基苯丙酮酸和0.5mM的IPTG，继续培养24_48h至发酵结束。同时有一瓶菌株，只加终浓度为500mg/L的对羟基苯丙酮酸而两个发酵阶段都不加0.5mM的IPTG作为对照。
[0040]发酵结束后，取ImL发酵液12000r/min离心3分钟，取上清，用0.22 μ m的微孔滤膜过滤后进行HPLC检测。色谱条件如下:色谱柱:C18 (4.6X250mm);流动相为20%甲醇-80%水-0.1%甲酸；流速lmL/min ;进样量20 μ L ;柱温室温；紫外检测器，检测波长281nm。依据液相的检测结果，通过和标准品保留时间的对照，确认合成的产物为丹参素，并通过峰面积的计算,最终确认产量为259mg/l (如附图3所示)。
[0041]实施例6辅助质粒的构造
[0042]以大肠杆菌BL21 (DE3)基因组序列中的T7RNA聚合酶序列为参考，设计PCR引物，以大肠杆菌BL21 (DE3)基因组为模板进行PCR反应，得到T7RNA聚合酶基因以及其前面包含LacUV5启动子和IacI基因在内的一部分序列，并将其克隆至pJETl.2载体上，送交测序，然后连接到PECXK99E载体上，最终获得一个表达质粒pECXK99E-T7RNApol。测序获得LacUV5-lac1-T7RNApol的序列如序列表SEQ ID N0.15所示，RNA聚合酶蛋白序列如序列表SEQ ID N0.16所示。设计引物如下:T7_U (up)，如序列表SEQ ID N0.17所示:CCGGAATTCTCACTCATTAGGCACCCC (下划线部分为 EcoRI 酶切位点)；T7_D (down)，如序列表SEQ ID N0.18 所示:GCAAAACTGCAGTGGCGGAGAAACCATMTTGCA (下划线部分为 PstI 酶切位点)
[0043]使用FASTpfu 酶进行 PCR，PCR 反应条件为:95°C，5min，I 个循环；95°C，30s，55°C，30s，72°C，95s，共30个循环;72°C，5min，I个循环;4°C保存。可得到3000bp左右片段。将得到的PCR产物进行纯化后，按照pJETl.2克隆试剂盒说明，将PCR片段连接到pJETl.2质粒上得到pJETl.2-T7，并转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态。37°C复苏完成后涂布氨苄青霉素抗性LB平板，37°C培养1·2小时。然后以引物T7-U和T7-D进行菌落PCR验证，筛选阳性克隆。并将验证得到的阳性克隆株进行测序验证。提取测序正确PJET1.2-T7质粒，用EcoRI和PstI酶进行酶切，回收T7基因片段，连接到同样用EcoRI和PstI酶切的pECXK99E质粒上，构建重组质粒PECXK99E-T7，并转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态。37°C复苏完成后涂布卡纳抗性LB平板，37°C培养12小时。然后以引物T7-U和T7-D进行菌落PCR验证，筛选阳性克隆。并将验证得到的阳性克隆株进行测序验证。
[0044]实施例7生物质碳源直接发酵法合成丹参素
[0045]分别将已构建好的重组质粒pCDF-hpaBC-D-LCH、pCDF-hpaBC-D-LCH (Y52V)、pCDF-hpaBC-D-LCH (Y52A)和实施例6构建的辅助质粒pECXK99E_T7 (提供T7RNA聚合酶)电击转化进入高产酪氨酸的大肠杆菌菌株中(CGMCC N0.7962，详见实施例1)，得到三种工程菌。将转化的单菌落挑至5mlLB培养基(加入相应的抗生素:硫酸链霉素50ug/ml ;氨苄青霉素100ug/ml ;硫酸卡纳霉素50ug/ml)中，37°C、220rmp过夜培养。后将100 μ L过夜培养的菌液转接进入含有50mlLB培养基(加入相应的抗生素:硫酸链霉素50ug/ml ;氨苄青霉素100ug/ml ;硫酸卡纳霉素50ug/ml)的250ml摇瓶中，37°C，220rpm培养。当菌体0D600长至0.6-0.8时，加入终浓度0.5mM的IPTG，继续培养3小时，后将菌液离心重新悬浮于MOPS培养基中，并加入终浓度为0.5mM的IPTG，继续培养24_48h至发酵结束。发酵结束后按照实施例5中的检测条件测量不同发酵时间丹参素合成的产量，HPLC检测结果分析表明，所构建的工程菌，可以高效的利用生物质碳源，通过发酵合成丹参素，平均产量为6.9mg/l，其中以P⑶F-hpaBC-D-LCH (Y52A)和辅助质粒转化高产酪氨酸的大肠杆菌(CGMCC N0.7962)得到的工程菌，取得相对较好的丹参素产量，将上述工程菌进行保藏，保藏信息如下:菌种名称为SyBE-002444，保藏中心登记入册编号为CGMCC N0.7961，建议的分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli,现于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。
[0046]实施例8将hpaBC基因和D-LCH (Y52A)基因嵌入高产酪氨酸大肠杆菌(CGMCCN0.7962)基因组中并发酵检测丹参素产量
[0047]按照文献(LimCG, Fowler ZL, Hueller T, et al.High-yield resveratrolproductionin engineered Escherichia coli[J].Applied and Environmental Microbiology, 2011,77(10):3451-3460)中已报道的GAP启动子的序列，大肠杆菌基因组序列以及测序的hpaBC和D-LCH基因序列设计引物，将GAP启动子、RBS、hpaBC基因，D-LCH基因和氯霉素基因利用重叠延伸方法构造GAP-RBS-hpaBC-RBS-D-LCH的串联片段，用λ - Red同源重组方法，将该串联片段插入到高产酪氨酸的大肠杆菌基因组ybhB和ybhC基因中间，经PCR和测序筛选得到正确菌株后进行发酵检测丹参素产量。使用的氯霉素基因序列如序列表SEQ ID N0.19所示，设计引物具体如下:GAP-U (up)，如序列表SEQ ID N0.20所示:GCGTAATGCTTAGGCACA ;GAP-D (down)，如序列表 SEQ ID N0.21 所示:TGTAATCCTCCTAAACCATGGTTCTGAATAAAAGGTTGCCTGTAA ;hpaBC_U，如序列表 SEQ ID N0.22 所示:CCATGGITTAGGAGGATTACAAAATGAAACCAGAAGATTTCC ;hpaBC_D，如序列表 SEQ ID N0.23 所示:TGTAATCCTCCTAAACCATGGTTAAATCGCAGCTTCCAT ;D-LCH_U，如序列表 SEQ ID N0.24 所示:CCATGGITTAGGAGGATTACAAAATGAAAATTATTGCCTAT ;D-LCH_D，如序列表 SEQ ID N0.25 所示:TACACAATCGCTCAAGACGTTTAGTCAAACTTAACTTGT ;C1_U， 如序列表 SEQ ID N0.26 所示:ACGTCTTGAGCGATTGTGTA ;C1_D，如序列表 SEQ ID N0.27 所示:GAATTAGCCATGGTCCATAT[0048]使用FASTpfu酶进行PCR，以GAP-U和GAP-D为引物，以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，进行PCR反应，PCR反应条件为:95°C，5min，l个循环；95°C，40s，60°C，30s，72°C，45s，共30个循环；72°C，5min，l个循环；4°C保存，获得150bp左右的片段。以hpaBC_U，hpaBC-D 和 D-LCH-U，D-LCH-D 为两对引物，以 pCDF-hpaBC-D-LCH (Y52A)为模板，进行 PCR反应，PCR 反应条件为:95°C，5min, I 个循环；95°C，40s, 58°C，30s, 72°C，45s，共 30 个循环；72°C，5min，I个循环；4°C保存，由两对引物分别得到2000bp和1000bp左右的片段，将PCR所获得的三个片段进行PCR纯化回收，后以上述150bp左右的片段和2000bp左右的片段为模板，以GAP-U和hpaBC-D为引物，进行重叠延伸PCR，PCR条件为:PCR反应条件同上，得到2200bp左右的片段，将此片段进行PCR回收，以此片段和上述1000左右的片段为模板，以GAP-U和D-LCH-D为引物，进行PCR反应，反应条件如上，获得3200左右片段，将产物进行PCR回收，按照pJETl.2克隆质粒试剂盒说明书进行连接，将PCR片段连接到pJETl.2质粒上得到 PJETl.2-GAP-RBS-hpaBC-RBS-D-LCH,并转化大肠杆菌 BL21 (DE3)感受态。37°C复苏完成后涂布氨苄青霉素抗性LB平板，37°C培养12小时。然后以引物D-LCH-U和D-LCH-D进行菌落PCR验证，筛选阳性克隆。并将验证得到的阳性克隆株进行测序验证，结果为之前所设计的序列。
[0049]以pJETL 2-GAP-RBS-hpaBC-RBS-D-LCH 质粒为模板，以 GAP-U 和 D-LCH-D 为引物，进行PCR反应，反应条件为950C，5min, I个循环；95°C，40s, 58°C，30s, 72°C，45s，共30个循环；72°C，5min, I 个循环；4°C保存，获得 GAP-RBS-hpaBC-RBS-D-LCH 片段。以 Cl-U 和 Cl-D为引物，以PKD3质粒为模板，进行PCR反应，克隆氯霉素抗性加基因，反应条件如下:95°C，5min，l 个循环；95°C，40s，55°C，30s，72°C，45s，共 30 个循环;72°C，5min，I 个循环;4°C保存，获得1000bp左右片段，进行PCR产物回收。以此片段和GAP-RBS-hpaBC-RBS-D-LCH片段为模板，以Cl-U和D-LCH-D为引物，进行重叠延伸PCR，获得4200bp左右的片段，将产物进行PCR回收。
[0050]挑取含有pKD46质粒的大肠杆菌(CGMCC N0.7962)于5mlLB培养基中，30°C过夜培养。取IOOul过夜培养物转接于含有50mlLB培养基的250ml摇瓶中，同时添加终浓度为50ug/ml的氨苄青霉素，30°C，220rpm培养。当菌体培养至0D600在0.1-0.2之间时，加入终浓度为IOOmM的L-阿拉伯糖作为诱导剂，继续培养至0D600约为0.6，制备电击转化感受态细胞。取5ul制备的插入片段，电击转化进入制备的待电击转化感受态细胞，2.5KV，5-6ms, 37摄氏度复苏。复苏完成后涂布氯霉素抗性的LB的平板,过夜培养。第二天用Y-Up和Y-Down为引物，进行菌落PCR验证，挑选出阳性克隆，同时以原始菌株作为对照。验证PCR 反应条件为:95°C，5min，l 个循环；95°C，30s，53°C，30s，72°C，lmin30s，共 30 个循环；72°C，5min，l个循环；4°C保存。将得到的PCR产物进行测序验证，以确保基因插入成功。将50uL测序正确的插入菌株保存的甘油菌(甘油菌保存方法为600uL甘油和600uL菌液混合，放置-20度进行长期保藏)接入5mLLB培养基(加入相应抗生素氨苄青霉素:100ug/ml)中，370C，220rmp培养12h。后将500ul菌液转接至含有15mL的MOPS培养基中(含有5g/l葡萄糖，lg/Ι酵母提取物，并加入相应的抗生素:100ug/ml)，37°C，220rmp,当OD=0.6-0.8时，加入IPTG，每隔12h补充一次葡萄糖至5g/l，发酵48h后按照实施例5中的检测条件检测丹参素产量，通过HPLC检测，最终检测得到7.5g/l丹参素。
[0051]以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范 围。
【权利要求】
1.一种丹参素的生物生产方法，其特征在于，按照下述步骤进行: 步骤1，设计并优化对羟基苯乙酸间位羟基化酶的基因序列，并全合成所述目标基因；所述对羟基苯乙酸间位羟基化酶的基因序列如序列表SEQ ID N0.1所示； 步骤2，设计并优化D-乳酸脱氢酶(D-LCH)的基因序列，并全合成所述目标基因，并经过位点突变，获得D-乳酸脱氢酶基因序列的突变基因序列D-LCH (Y52V)和D-LCH (Y52A)；所述D-乳酸脱氢酶(D-LCH)的基因序列如序列表SEQ ID N0.4所示，其对应的蛋白质序列中第52位氨基酸为酪氨酸；所述D-乳酸脱氢酶基因序列的突变基因序列D-LCH (Y52V)如序列表SEQ ID N0.7所不，其对应的蛋白序列如序列表SEQ ID N0.8所不，与序列表SEQ IDN0.4编码的蛋白质相比，在第52位氨基酸突变为缬氨酸；所述D-乳酸脱氢酶基因序列的突变基因序列D-LCH (Y52A)如序列表SEQ ID N0.9所示，其对应的蛋白序列如序列表SEQID N0.10所示，与序列表SEQ ID N0.4编码的蛋白质相比，在第52位氨基酸突变为丙氨酸； 步骤3，设计并优化T7RNA聚合酶基因序列，并全合成所述目标基因；所述T7RNA聚合酶基因序列如序列表SEQ ID N0.15所示，RNA聚合酶蛋白序列如序列表SEQ ID N0.16所示； 步骤4，将获得的对羟基苯乙酸间位羟基化酶基因序列SEQ ID N0.1、T7RNA聚合酶基因序列SEQ ID N0.15，与D-乳酸脱氢酶基因序列SEQ ID N0.4、D_乳酸脱氢酶基因序列的突变基因序列D-LCH (Y52V)SEQ ID N0.7、或者D-乳酸脱氢酶基因序列的突变基因序列D-LCH (Y52A) SEQ ID N0.9之一的序列进行配合构建表达载体，并转染大肠杆菌或者嵌入大肠杆菌基因组；所述大肠杆菌为高产酪氨酸大肠杆菌，菌种名称为SyBE-002447，建议的分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli,现于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏中心登记入册编号为CGMCC N0.7962 ； 步骤5，利用步骤4得到的工程菌进行发酵生产丹参素。
2.根据权利要求1所述的一种丹参素的生物生产方法，其特征在于，在所述步骤I中，选用大肠杆菌BL21 (DE3)菌株的对`羟基苯乙酸间位羟基化酶基因序列，设计引物并克隆。
3.根据权利要求1所述的一种丹参素的生物生产方法，其特征在于，在所述步骤2中，以植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) ATCC14917的D-乳酸脱氢酶基因序列作为参考，设计PCR引物，以植物乳杆菌CICC21419的基因组为模板进行PCR反应，并克隆。
4.根据权利要求1所述的一种丹参素的生物生产方法，其特征在于，在所述步骤3中，以大肠杆菌BL2KDE3)基因组序列中的T7RNA聚合酶序列为参考，设计PCR引物，以大肠杆菌BL21 (DE3)基因组为模板进行PCR反应，得到T7RNA聚合酶基因以及其前面包含LacUV5启动子和IacI基因在内的一部分序列，并将其克隆。
5.根据权利要求1所述的一种丹参素的生物生产方法，其特征在于，在所述步骤4中，选择将对羟基苯乙酸间位羟基化酶基因序列SEQ ID N0.1分别与D-乳酸脱氢酶基因序列SEQ ID N0.4、D-乳酸脱氢酶基因序列的突变基因序列D-LCH (Y52V)SEQ ID N0.7、D_乳酸脱氢酶基因序列的突变基因序列D-LCH (Y52A) SEQ ID N0.9构建重组质粒，将上述重组质粒分别与利用T7RNA聚合酶基因序列SEQ ID N0.15构建的辅助质粒转染大肠杆菌。
6.根据权利要求1所述的一种丹参素的生物生产方法，其特征在于，在所述步骤4中，将对羟基苯乙酸间位羟基化酶基因序列SEQ ID N0.1、突变基因序列D-LCH (Y52A) SEQID N0.9嵌入高产酪氨酸大肠杆菌(CGMCC N0.7962)基因组中，选择将GAP启动子、RBS、对羟基苯乙酸间位羟基化酶基因序列SEQ ID N0.1、D-乳酸脱氢酶基因序列的突变基因序列D-LCH (Y52A) SEQ ID N0.9和氯霉素基因序列SEQ ID N0.19利用重叠延伸方法构造GAP-RBS-hpaBC-RBS-D-LCH的串联片段，用λ - Red同源重组方法，将该串联片段插入到高产酪氨酸的大肠杆菌(CGMCC N0.7962)基因组ybhB和ybhC基因中间，经PCR和测序筛选得到正确菌株。
7.根据权利要求5所述的一种丹参素的生物生产方法，其特征在于，在所述步骤4的转染大肠杆菌过程中，以对羟基苯乙酸间位羟基化酶基因序列SEQ ID N0.1、T7RNA聚合酶基因序列SEQ ID N0.15与D-乳酸脱氢酶基因序列的突变基因序列D-LCH (Y52A) SEQ IDN0.9转化高产酪氨酸的大肠杆菌(CGMCC N0.7962)得到的工程菌，取得相对较好的丹参素产量，将上述工程菌进行保藏，保藏信息如下:菌种名称为SyBE-002444，保藏中心登记入册编号为CGMCC N0.7961，建议的分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli。
8.根据权利要求1所述的一种丹参素的生物生产方法，其特征在于，在所述步骤5中，选择添加前体物对羟基苯丙酮酸和诱导剂异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷。
9.一种大肠杆菌菌种保藏登记号为CGMCC N0.7961，菌种名称为SyBE-002444，建议的分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli。
10.如权利要求9所述的菌种在制备丹参素中的应用。
【文档编号】C12R1/19GK103667371SQ201310559498
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月11日 优先权日:2013年11月11日
【发明者】赵广荣, 姚元锋, 赵莹, 王长松 申请人:天津大学