一种检测环境雌激素的重组酵母及其构建方法和用途
【专利摘要】本发明公开了一种检测环境雌激素的重组酵母及其构建方法和用途，该重组酵母含有酵母表达质粒和酵母报告质粒；所述的酵母表达质粒包含序列如SEQ?ID?No.1所示的唐鱼雌激素受体基因TERα；所述的酵母报告质粒，其载体是pMP206，载体上连接序列如SEQ?ID?No.4所示的唐鱼卵黄蛋白原基因启动子2。本发明用唐鱼雌激素受体构建表达质粒，用唐鱼卵黄蛋白原启动子连接报告基因构建报告质粒。唐鱼对生存环境的变化反应灵敏，是用生物方法监测环境雌激素污染的一个极好的鱼类生物标记物，而卵黄蛋白原又是一个很好的环境内分泌干扰物的生物标志物。用唐鱼的雌激素受体和唐鱼卵黄蛋白原启动子构建重组酵母测评系统，其在灵敏度上会有很大提高。
【专利说明】一种检测环境雌激素的重组酵母及其构建方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测领域，具体涉及一种检测环境雌激素的重组酵母及其构建方法和用途。
【背景技术】
[0002]激素是生物内分泌细胞分泌的高效生物活性物质，具有低浓度、高效力的特点。
[0003]环境激素是指环境中存在的，能够模拟天然激素的作用，对生物的内分泌系统等产生严重影响的某些有毒化合物。
[0004]环境雌激素是最主要的一类环境激素，是生殖障碍、生殖系统畸形、发育异常、代谢紊乱以及某些恶性肿瘤发病率增加的主要原因之一。由于环境雌激素种类多、危害大、分布广、作用机制复杂，其对生物体与环境的危害逐步被人们所重视。因此建立快速、灵敏、高效、低成本的针对环境雌激素的检测方法已成为当务之急。
[0005]目前环境雌激素的检测方法主要有化学分析方法和生物学检测方法。
[0006]化学分析方法主要为一些色谱及质谱法，仪器昂贵，操作复杂，对样品的前处理过程要求非常高，检测样品较单一，具有一定的应用局限性。
[0007]而生物学检测方法中，重组基因酵母检测法较为常见，主要是用人雌激素受体基因构建表达质粒，用雌激素效应元件序列片段连接报告基因构建报告质粒。这不利于与一些在体实验、胚胎致畸实验和种群生态实验等相互印证。
【发明内容】
`[0008]为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种检测环境雌激素的重组酵母。
[0009]本发明的另一目的在于提供上述的检测环境雌激素的重组酵母的构建方法。
[0010]本发明的再一目的在于提供上述的检测环境雌激素的重组酵母的用途。
[0011]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0012]一种检测环境雌激素的重组酵母，含有酵母表达质粒和酵母报告质粒。
[0013]所述的酵母表达质粒包含序列如SEQ ID N0.1所示的唐鱼雌激素受体基因TERa。在表达载体中插入的是唐鱼雌激素受体基因，能够更好地受唐鱼卵黄蛋白原启动子的调控。
[0014]所述的酵母报告质粒，其载体是pMP206，载体上连接序列如SEQ ID N0.4所示的唐鱼卵黄蛋白原基因启动子2 (promoter2)0 pMP206是常用的附加型酵母载体，其上带有氨苄青霉素的抗性基因(Amp1O和营养缺陷型标记URA3基因，可以分别作为大肠杆菌和酵母系统中的筛选标记；同时还带有一个编码(6-半乳糖苷酶的全长LacZ报告基因，基本启动子为细胞色素氧化酶基因启动子(CYCl)，该启动子上游有可用于插入待研究的外源性基因的惟一酶切位点Hind III和Pst I，因此可将唐鱼卵黄蛋白原启动子序列插入其上游，从而构建报告质粒。因为本发明的唐鱼卵黄蛋白原基因启动子序列上含有雌激素反应元件ERE，因此能特异性地对雌激素刺激产生反应。
[0015]所述的酵母是酵母菌株AH109(MATa型)，AH109是带有营养缺陷筛选标记的菌株。
[0016]所述的酵母表达质粒，其载体优选pGADI7。PGADI7是常用的附加型酵母载体，其上携带的氨苄青霉素的抗性基因(Amp1O和营养缺陷型标记LEU2可以分别作为大肠杆菌和酵母系统中的筛选标记。
[0017]所述的环境雌激素是雌二醇，优选17-0雌二醇。
[0018]上述的检测环境雌激素的重组酵母的构建方法，包括以下步骤:
[0019](I)将唐鱼雌激素受体基因TERa序列连接到载体上，构建表达质粒；
[0020](2)将唐鱼卵黄蛋白原基因启动子2 (promoter2)序列连接到载体pMP206上，构建报告质粒pMP206/pr2 ；
[0021](3)将上述的表达质粒和报告质粒转染酵母细胞，得到检测环境雌激素的重组酵母。
[0022]上述的重组酵母可用于检测环境雌激素，包括以下步骤:
[0023]将上述的重组酵母置于添加有CuSO4的液体SD培养基中，加入待测样品，30°C下振荡培养18h，测定3 -半乳糖苷酶活性，根据3 -半乳糖苷酶活性的变化计算待测样品中雌激素的含量；
[0024]所述的液体SD培养基不含亮氨酸(Leu)和尿嘧啶(Ura)，其中CuSO4的质量体积浓度是0.1%。
[0025]本发明相对于现有技术具有`如下的优点及效果:
[0026]目前已建立的检测雌激素的重组酵母测评系统主要是用人雌激素受体基因片段构建表达质粒，用雌激素效应元件序列片段连接报告基因构建报告质粒。而环境雌激素易在水体环境中汇集，对水生生物危害严重，不断有关于雄鱼雌性化的相关报道。唐鱼是我国土著淡水鱼，易饲养，且对生存环境的变化反应灵敏，是用生物方法监测环境雌激素污染的一个极好的鱼类生物标记物。而卵黄蛋白原又是一个很好的环境内分泌干扰物的生物标志物，利用鱼类卵黄蛋白原作为环境雌激素的生物标记物的研究对于环境资源和生物资源的保护具有重要意义。本发明用唐鱼雌激素受体基因片段构建表达质粒，构建受唐鱼卵黄蛋白原启动子调控的酵母报质粒。用唐鱼的雌激素受体和唐鱼卵黄蛋白原启动子构建重组酵母测评系统，其在灵敏度上会有很大提高。同时可与唐鱼的在体卵黄蛋白原实验、胚胎致畸实验和种群生态实验相互印证，可构建一套以唐鱼为实验动物的完整的检测及评价环境雌激素效应物质的技术体系。同时，本发明以重组酵母检测雌激素的方法，灵敏度高、重复性好，可应用于环境、食品中雌激素的检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1是17-0雌二醇诱导重组酵母的剂量-效应曲线。
【具体实施方式】
[0028]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0029]唐鱼雌激素受体基因TERa和唐鱼卵黄蛋白原基因启动子2 (promoted)都已被克隆，其序列分别如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.4所示。
[0030]实施例1
[0031]一种检测环境雌激素的重组酵母的构建方法，包括以下步骤:
[0032]( I)表达质粒的构建:
[0033]以唐鱼雌激素受体基因TER a的cDNA序列(SEQ ID N0.1)为模板，设计合成特异性引物:
[0034]h游引物为 5’ -AGAATTCATGGTGATGTCTGGAGGGCA-3’ (SEQ ID N0.2)
[0035]下游引物为5’ -ACTCGAGTTAGGTATCTGGACTTTGGCTAA-3’ (SEQ ID N0.3)
[0036]引物两端分别设计EcoRI和XhoI酶切位点(下划线所示)，PCR扩增得到TER a基因完整的ORF片段。PCR产物经纯化并回收后，与克隆载体pMD18-T连接，构建重组质粒，命名为pMP18_T/TERa。pMP18_T/TERa经EcoR I和Xho I双酶切，胶回收目的片段TERa并与酵母附加型表达载体PGADI7连接，构建重组质粒，命名为pGADI7/TERa。
[0037](2)报告质粒pMP206/pr2的构建:
[0038]以唐鱼卵黄蛋白原基因启动子2 (promoter2)序列(SEQ ID N0.4)为模板，设计2对引物:
[0039]外围引物:
[0040]上游引物5，-C`AAGTAAAGACAATGAGATAGGGAC-3，(SEQ ID N0.5)
[0041]下游引物5’ -TTGATTGTATGGATGATGGATGCAC-3’ (SEQ ID N0.6)
[0042]内周引物:
[0043]上游引物5’ -AAAGCTTGTAAAGACAATGAGATAGGGACAGGACC-3，(SEQ ID N0.7)
[0044]下游引物5’ -ACTGCAGTAGACCAGGGAAACATGAACGTGCCAAA-3’ (SEQ ID N0.8)
[0045]PCR扩增含有ERE序列的promoter2片段。将PCR产物与克隆载体pMD18_T连接，构建重组质粒，命名为pMD18-T/pr2。pMD18_T/pr2经Hind III和Pst I双酶切，胶回收目的片段并与酵母附加型表达载体PMP206连接，构建重组质粒，命名为pMP206/pr2。
[0046](3 )将表达质粒pGADI7/TER a转染酵母菌株AH109:
[0047]表达质粒pGADI7/TERa用醋酸锂(LiAC)方法转染入AH109酵母细胞，用D/_Leu选择培养基筛选出阳性克隆。经常规筛选和鉴定确定质粒pGADI7/TERa已成功转染至酵母菌中，将此酵母菌株命名为AHpTERa。
[0048](4 )将pMP206/pr2报告质粒转染重组酵母AHpTER a:
[0049]将pMP206/pr2质粒用醋酸锂(LiAC)方法转入AHpTER a重组酵母细胞，用SD/-Leu/-Ura选择培养基筛选出阳性克隆，经常规筛选和鉴定确定，确认重组酵母构建成功，并命名为AHptER a /pr2。
[0050]实施例2
[0051]以实施例1得到的重组酵母AHptERa/pr2测定样品中环境雌激素(17-3雌二醇，简称E2)的含量，包括以下步骤:
[0052](I)重组酵母菌株的诱导培养
[0053]挑取重组酵母AHptER a /pr2的单克隆到添加有CuSO4的液体SD培养基中振荡培养，至OD6tltl读数为0.1-0.4时，加入系列待测样品(含有不同浓度17-0雌二醇的DMSO溶液)，30°C的恒温振荡器里振荡培养18h，测定并记录培养液的0D600值；所述的液体SD培养基不含亮氨酸(Leu)和尿嘧啶(Ura)，其中CuSO4的质量体积浓度是0.1%。
[0054]分别取ImL系列待测样品的培养液置于1.5mL离心管中，14000rpm离心，去上清，加入ImL Z缓冲液，再离心并弃上清。加入IOOul Z缓冲液重悬沉淀。即为已诱导完毕的重组酵母AHptER a /pr2。
[0055](2)酶活测定及绘图
[0056]分别在每个装有已诱导完毕的重组酵母AHptERa/pr2的离心管中加入IOOuL
IXuniversal lysis buffer ULB裂解液进行细胞裂解,振荡裂解5_10min,离心lmin,取上
清作显色反应。
[0057]96孔板各孔中依次加入待测上清液，每孔加入IOOul ONPG底物溶液，将孔板置于微孔板振荡器上在室温下进一步恒温培养，立即开始计时，当溶液都变黄时(即OD405=0.3-0.7时)，取出96孔培养板，在酶标仪上测定405nm波长下的吸光度，计算酶活力绘图，如图1示。空白是以非转染细胞(即AH109酵母细胞)进行本实施例步骤(1)- (2)的操作后测定的。
[0058]根据吸光值和酵母菌浓度计算P -半乳糖苷酶的酶活，计算公式为:
[0059]
【权利要求】
1.一种检测环境雌激素的重组酵母，其特征在于含有酵母表达质粒和酵母报告质粒； 所述的酵母表达质粒包含序列如SEQ ID N0.1所示的唐鱼雌激素受体基因TERa ； 所述的酵母报告质粒，其载体是PMP206，载体上连接序列如SEQ ID N0.4所示的唐鱼卵黄蛋白原基因启动子2; 所述的酵母是酵母菌株AH109。
2.根据权利要求1所述的检测环境雌激素的重组酵母，其特征在于:所述的酵母表达质粒，其载体为PGADT7。
3.根据权利要求1所述的检测环境雌激素的重组酵母，其特征在于:所述的环境雌激素是雌二醇。
4.根据权利要求1所述的检测环境雌激素的重组酵母，其特征在于:所述的环境雌激素是17-0雌二醇。
5.权利要求1-4任一项所述的检测环境雌激素的重组酵母的构建方法，其特征在于包括以下步骤: (1)将唐鱼雌激素受体基因TERa序列连接到载体上，构建表达质粒； (2)将唐鱼卵黄蛋白原基因启动子2序列连接到载体pMP206上，构建报告质粒pMP206/pr2 ； (3)将上述的表达质粒和报告质粒转染酵母细胞，得到检测环境雌激素的重组酵母。
6.权利要求1-4任一项所述的重组酵母在检测环境雌激素中的应用。
7.根据权利要求6所述的重组酵母在检测环境雌激素中的应用，其特征在于包括以下步骤: 将权利要求1-4任一项所述的重组酵母置于添加有CuSO4的液体SD培养基中，加入待测样品，30°C下振荡培养18h，测定(6-半乳糖苷酶活性，根据(6-半乳糖苷酶活性的变化计算待测样品中雌激素的含量； 所述的液体SD培养基不含亮氨酸和尿嘧啶，其中CuSO4的质量体积浓度是0.1%。
【文档编号】C12N1/19GK103555601SQ201310574108
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月13日 优先权日:2013年11月13日
【发明者】马广智, 陈美玲, 武佳韵, 凌源智, 刘琳, 黄儒强, 陈世文, 吴萍萍, 尹艳艳, 章凌霄, 黄中豪, 曾健辉, 孔繁茂, 朱宝君 申请人:华南师范大学