一种生产紫杉二烯的系统和微生物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种生产紫杉二烯的系统和微生物及其应用，属于合成生物学领域。生产紫杉二烯的系统包含甲羟戊酸途径和紫杉二烯合成相关基因或其功能等同体。甲羟戊酸途径的相关基因为来源于大肠杆菌BL21的atoB、idi和来源于酿酒酵母INVSC1的erg13、thmg1、erg12、erg8、mvd1；紫杉二烯合成的相关基因ggpps和ts基因核苷酸序列如SEQIDNO.1和2所示。生产紫杉二烯的微生物为含有生产紫杉二烯的系统的微生物，通过将该系统转化到微生物中得到生产紫杉二烯的微生物。本发明构建的微生物能稳定产生紫杉二烯的培养物，为后续进一步利用微生物产生紫杉醇奠定了基础，具有广阔的应用前景。
【专利说明】—种生产紫杉二烯的系统和微生物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于合成生物学领域，涉及一种生产紫杉二烯的系统和微生物及其应用。【背景技术】
[0002]1963年美国科学家首次从一种太平洋杉树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物，并发现其对鼠肿瘤细胞有很高活性。后来通过I1-1II期临床研究发现，紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效，是现在最有潜能且商业应用最为成熟的一种抗癌药。现今获得紫杉醇的方法主要有三种:(1)最传统的从天然植物树皮中提取，(2)从植物叶片等组织中提取中间产物巴卡亭III等，随后通过化学合成生产紫杉醇，(3)利用植物组织培养后提取紫杉醇。这三种都是依赖于植物源的方式获得产物，因而价格一直很高，而且随着逐年的砍伐，可利用的红豆杉等植物已经越来越少，这很大程度的限制了利用该药物去治疗更多患者。
[0003]自从1993年，首次报道从太平洋红豆杉树木中分离到一株能独立生物合成产生紫杉醇的内生真菌以来，国内外就有大量的文献专注于解决紫杉醇的生物合成以及相关的紫杉烷类化合物这一问题。同时，另外一些科研工作者致力于阐明紫杉醇的合成途径，但目前仍有至少五步反应的功能基因还未克隆出来，在这些酶中，研究者一致认为催化栊牛儿基物牛儿基焦磷酸合成紫杉二烯的紫杉二烯合酶(Taxadiene synthase,TS)是合成紫杉二烯的第一个决定性步骤。
[0004]紫杉醇属于异戊二烯类超家族化合物，至今已报道有超过30000种被鉴定为异戊二烯类。而异戊二烯类超家族化合物都来源于相同的两个中间产物:异戊烯焦磷酸(IPP, isopentenyl diphosphate)和二甲基烯丙基焦憐酸(DMAPP, dimethylallyldiphosphate)。自然界中存在两个异戊二烯合成途径来提供IPP和DMAPP这两种通用的萜类化合物前体:(I)甲羟戊酸途径(MVA途径)，主要存在于高等真核生物(动物，植物线粒体，真菌和酵母等)和部分细菌中，(2)非甲羟戊酸途径(DXP或MEP途径)，主要存在于植物质体、原生生物和大多数细菌中，而链霉菌、部分植物等同时含有MVA和MEP途径。近年来，利用改造微生物内源的MEP或MVA途径，或者导入改造的外源MEP或MVA途径生产萜类化合物引起了人们的广泛兴趣。
【发明内容】
[0005]本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种生产紫杉二烯的系统。
[0006]本发明的另一目的在于提供一种生产紫杉二烯的微生物。
[0007] 本发明的另一目的在于提供上述生产紫杉二烯的系统或微生物的应用。
[0008]本发明的再一目的还在于提供一种提高生产紫杉二烯能力的方法。
[0009]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0010]一种生产紫杉二烯的系统，包含甲羟戊酸途径和紫杉二烯合成相关基因或其功能等同体(同功能基因)中的一种或多种。所述的甲羟戊酸途径的相关基因包括(I)将乙酰辅酶A缩合为乙酰乙酰辅酶A的基因atoB或其功能等同体、(2)将乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A缩合为HMG-CoA的基因ergl3或其功能等同体、(3)将HMG-CoA还原为甲羟戊酸的基因thmgl或其功能等同体、(4)将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸-5-磷酸的基因ergl2或其功能等同体、(5)将甲羟戊酸-5-磷酸磷酸化为甲羟戊酸-5-焦磷酸的基因erg8或其功能等同体、(6)将甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧生成异戊烯焦磷酸的基因mvdl或其功能等同体和
(7)将异戊烯焦磷酸异构为二甲基烯丙基焦磷酸的基因idi或其功能等同体；所述的紫杉二烯合成的相关基因包括(8)将异戊二烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸缩合为栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸的基因栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合酶ggpps基因或其功能等同体和(9)将栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸环化为紫杉二烯的紫杉二烯合酶ts基因或其功能等同体。
[0011]优选的，所述的甲羟戊酸途径相关基因或其功能共同体和紫杉二烯合成相关基因或其功能共同体被设置在同一个载体或相互不同的载体上。由此，可以进一步提高采用该系统转化微生物的效率。
[0012]所述的甲羟戊酸途径的相关基因优选为来源于大肠杆菌BL21 (DE3)的atoB(CP001509.3:2216470-2217654)、idi (CP001509.3:2863926-2864474)和来源于酿酒酵母 INVSCl 的 ergl3 (329138949:19060-20535)、 thmgl (329138949:115734-117239)、ergl2 (329138949:684467-685798)、erg8 (329138949:712316-713671)、mvdl(329138953:701895-703085)。
[0013]所述的紫杉二烯合成的相关基因优选为来源于Taxus canadensis (加拿大红豆杉)经过密码子优化的栊牛儿 基栊牛儿基焦磷酸合酶ggpps基因(序列如SEQ ID N0.1所示)和来源于Taxus brevifolia (短叶红豆杉)经过密码子优化的紫杉二烯合酶ts基因(序列如 SEQ ID N0.2 所示)。
[0014]一种生产紫杉二烯的微生物为含有上述生产紫杉二烯的系统的微生物。通过将生产紫杉二烯的系统转化到微生物中得到生产紫杉二烯的微生物，通过表达该微生物的基因组中所包含的外源基因，可以使该微生物过表达甲羟戊酸途径或栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合酶或紫杉二烯合酶的至少一种。
[0015]优选的，所述的生产紫杉二烯的微生物为将甲羟戊酸途径相关基因或其功能共同体和紫杉二烯合成相关基因或其功能共同体中的一种或多种整合到微生物基因组中。
[0016]所述的微生物为选自真核微生物、原核微生物和病毒的至少一种。
[0017]优选的，所述的微生物为选自细菌、真菌、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体、立克次体、病毒和酵母的至少一种。
[0018]优选的，所述的微生物为丝状真菌。
[0019]优选的，所述的微生物为酵母。
[0020]优选的，所述微生物为大肠杆菌。
[0021]优选的，所述微生物为芽孢杆菌。
[0022]优选的，所述微生物为链霉菌。
[0023]优选的，所述微生物不含内源的甲羟戊酸途径。
[0024]更优选的，所述微生物含有内源的甲羟戊酸途径。
[0025]优选的，所述的生产紫杉二烯的微生物为含有质粒pMHl、质粒pFZ81和质粒pXC02的大肠杆菌；所述的质粒pMHl启动子为Iac启动子，复制子为pl5A复制子,包含atoB、ergl3和thmgl基因，pMHl的序列(不含骨架载体序列)如SEQ ID N0.3所示；所述的质粒pFZ81启动子为Iac启动子，复制子为pBBRlMCS复制子,包含ergl2、erg8、mvdl和idi基因，PFZ81的序列(不含骨架载体序列)如SEQ ID N0.4所示；所述的质粒pXC02启动子为T7强启动子，复制子为PSClOl低拷贝复制子，包含ggpps和ts基因，pXC02的序列(不含骨架载体序列)如SEQ ID N0.5所示。
[0026]更优选的，所述的生产紫杉二烯的微生物为含有质粒pMHl、质粒pFZ81和质粒PFZ131的大肠杆菌；所述的质粒PFZ131包含与pXC02相同的ggpps和ts基因，启动子为T7强启动子，只是复制子为PBBR322高拷贝复制子。
[0027]上述生产紫杉二烯的系统或微生物在生产紫杉二烯中的应用。
[0028]—种提闻生广紫杉二稀能力的方法为增加上述系统中任一基因或其功能等同体的表达。
[0029]合成生物学与代谢工程等的发展使得在目标微生物中表达外源基因成为可能，通过选择合适的表达元件能很好的完成外源基因在选定微生物中的表达与功能重建。本发明以大肠杆菌这一不含甲羟戊酸途径的微生物为例，通过导入甲羟戊酸途径相关基因或功能共同体、栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合酶与紫杉二烯合酶成功的在大肠杆菌体内合成了紫杉二烯。这表明即使微生物不含甲羟戊酸途径亦可利用外源导入的甲羟戊酸途径来用于合成紫杉二烯等萜类化合物， 这类微生物可以是大肠杆菌，芽孢杆菌等含有MEP途径的微生物。相对于不含甲羟戊酸途径的微生物，对酵母，丝状真菌和链霉菌等含有内源甲羟戊酸途径的微生物进行甲羟戊酸途径的改造则更为便捷，可通过表达部分或者全部相关基因亦或是全部外源的相关基因以达到改造甲羟戊酸途径的目的，因此本发明所建立的甲羟戊酸途径改造与对栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合酶及紫杉二烯合酶的改造完全可以通过选用合适的表达元件在其他微生物中进行重现。目前还无法利用常用微生物直接生产紫杉醇，而利用微生物生产紫杉二烯这一重要的紫杉醇合成中间产物能为今后微生物生产紫杉醇提供一定的指导。
[0030]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:本发明利用外源的甲羟戊酸途径获得了稳定生产紫杉二烯的大肠杆菌。本发明构建的微生物能稳定产生紫杉二烯的培养物，为后续进一步利用微生物生产紫杉醇奠定了基础，具有广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1是甲羟戊酸途径示意图。
[0032]图2是紫杉二烯合成途径示意图。
[0033]图3是质粒pMHl示意图。
[0034]图4是质粒pFZ81示意图。
[0035]图5是质粒PFZ131示意图。
[0036]图6是质粒pXC02示意图。
[0037]图7是T2菌株摇瓶发酵产物GC-MS分析结果图。
[0038]图8是T2与T4菌株生产紫杉二烯的GC-MS分析结果比较。
[0039]图9是紫杉二烯定量标准曲线；其中，A是紫杉二烯的标准曲线，Υ=-31766.7+5576.48*X，R Λ 2=0.9911，W:Equal ;B 是内标物的标准曲线，Y=-11808.6+11273.7*X, R Λ 2=0.9977, W:Equal。
[0040]图10是T4菌株紫杉二烯发酵结果。
【具体实施方式】
[0041]下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0042]通过从大肠杆菌和酿酒酵母基因组DNA中扩增相应基因构建了用于大肠杆菌表达的甲羟戊酸途径和紫杉二烯合成途径，并实现了重组大肠杆菌Τ2和Τ4稳定生产紫杉二烯，相关反应途径见图1和图2。
[0043]实施例中所用到的引物如表1所示:
[0044]表1引物列表
[0045]·
【权利要求】
1.一种生产紫杉二烯的系统，其特征在于:包含甲羟戊酸途径和紫杉二烯合成相关基因或其功能等同体中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的生产紫杉二烯的系统:其特征在于:所述的甲羟戊酸途径相关基因或其功能共同体和紫杉二烯合成相关基因或其功能共同体被设置在同一个载体或相互不同的载体上。
3.根据权利要求1所述的生产紫杉二烯的系统，其特征在于:所述的紫杉二烯合成的相关基因为经过密码子优化的辟》^和ts基因，核苷酸序列分别如SEQ ID N0.1和2所示。
4.一种生产紫杉二烯的微生物,其特征在于:为包含权利要求1-3任一项所述的系统的微生物，所述的微生物为选自真核微生物、原核微生物和病毒的至少一种。
5.根据权利要求4所述的微生物，其特征在于:所述的微生物为丝状真菌、酵母、链霉菌、芽孢杆菌或大肠杆菌。
6.根据权利要求4所述的微生物，其特征在于:所述的微生物为基因组DNA中整合了权利要求1-3任一项所述的系统的核酸序列一种或多种。
7.根据权利要求4所述的微生物，其特征在于:所述的微生物为含有质粒pMHl、质粒PFZ81和质粒pXC02的大肠杆菌；所述的质粒pMHl启动子为Iac启动子，复制子为pl5A复制子，包含aioS、ergl3和thmgl基因；所述的质粒pFZ81启动子为Iac启动子，复制子为pBBRlMCS复制子，包含ergl2、erg8、mvdl和idi基因；所述的质粒pXC02启动子为T7强启动子，复制子为PSClOl低拷贝复制子，包含辟pas和ts基因；或为含有质粒pMHl、质粒pFZ81和质粒pFZ131的大肠杆菌；所述的质粒pFZ131启动子为T7强启动子，复制子为pBBR322高拷贝复制子,包含ggpps和ts基因。
8.权利要求4-7任一项所述的微生物的制备方法，其特征在于包含如下步骤:将权利要求1-3任一项所述的系统转化微生物中。
9.权利要求1-3任一项所述的系统或权利要求4-7一项所述的微生物在生产紫杉二烯中的应用。
10.一种提高生产紫杉二烯能力的方法，其特征在于:增加权利要求1-3任一项所述的系统中的任一基因或其功能等同体的表达。
【文档编号】C12N15/11GK103571835SQ201310595448
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月22日 优先权日:2013年11月22日
【发明者】刘天罡, 朱发银, 曹小迎, 张宇琛, 卞光凯, 邓子新 申请人:武汉大学