一种dc细胞的快速制备方法
【专利摘要】本发明涉及细胞制备领域，具体地说是一种DC细胞的快速制备方法，本发明同现有技术相比，将制备时间由现有技术的7-9天缩短至3天；将DC细胞的活力由现有技术的68-75%提高至88-95%，纯度由现有技术的60-65%提高至80-90%；采用本发明方法制备的DC细胞具有完全成熟表型，表达趋化因子CCR7，分泌高浓度IL-12细胞因子并有效促进T细胞增殖。
【专利说明】一种DC细胞的快速制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞制备领域，具体地说是一种DC细胞的快速制备方法。
【背景技术】
[0002]DC细胞，即为树突状细胞(Dendritic Cell)，是机体免疫系统功能最强大的专职抗原提呈细胞，通过摄取、加工处理和提呈抗原，启动抗原特异性免疫应答，在机体免疫系统抵御病毒感染、肿瘤侵袭中发挥着关键作用。近年来，国内外多个研究团队利用抗原特异性DC疫苗治疗肿瘤等疾病均已取得令人鼓舞的进展，部分已进入临床试验阶段。
[0003]但是，DC细胞数量稀少,仅占人外周血单个核细胞的1%,而DC疫苗需要大量成熟DC细胞，目前只允许通过分离患者自体单核细胞，再进一步体外诱导扩增来获得。因此，高效大量获得成熟并具有功能的DC细胞成为抗原特异性DC疫苗治疗疾病成功的决定性环节。
[0004]常规的DC细胞体外诱导扩增方案，是利用细胞因子=GM-CSF和IL_4，经过5~7天的诱导分化，紧接着再经过2天的诱导成熟，从而获得成熟并具有功能的DC细胞，总培养时长在7、天。常规的DC细胞体外诱导扩增方案存在操作耗时长、细胞纯度低、细胞功能缺失等问题，导致DC疫苗产业化、批量化生产进程缓慢，进而难以推广应用。所以，寻找成本低、时程短的功能性DC细 胞体外诱导扩增方式显得尤为迫切。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供了一种诱导时间短、细胞纯度高、功能强的DC细胞的快速制备方法。
[0006]为了达到上述目的，本发明是一种DC细胞的快速制备方法，其特征在于:依次完成如下步骤:步骤一:在3毫升淋巴细胞分离液中以每分钟I毫升的速度加入5毫升全血，保持淋巴细胞分离液液面不被冲破，在室温状态下，采用300g离心力，离心20分钟，离心过程中提速及减速均不带刹车；步骤二:用滴管吸取云雾层，加入0.9%的生理盐水30毫升洗涤一次，在室温状态下，采用300g离心力，离心5分钟，弃上清；步骤三:用30毫升预冷的分选缓冲液重悬细胞，计数细胞数，在4摄氏度状态下，采用300g离心力，离心10分钟，弃上清；步骤四:每IxlO7个细胞加入30微升预冷的分选缓冲液、10微升Fe受体阻断试剂和10微升生物素抗体混合液，进行混匀，混匀后，置于温度为4摄氏度的冰箱内，10分钟后取出；步骤五:每I X IO7个细胞加入30微升预冷的分选缓冲液和20微升抗生物素微磁珠，进行混匀，混匀后，置于温度为4摄氏度的冰箱内，15分钟后取出；步骤六:加入1-2微升预冷的分选缓冲液，在4摄氏度状态下，采用300g离心力，离心10分钟，弃上清，加入500微升预冷的分选缓冲液重悬细胞；步骤七:MS柱置于磁架上，加入500微升预冷的分选缓冲液，待液体完全流干后，加入500微升细胞悬液，收集流出的细胞，该流出的细胞即为CD14+的单核细胞；步骤八:待液体完全流干后，加入500微升预冷的分选缓冲液洗柱，重复两次；步骤九:计数收集的细胞数量，在4摄氏度状态下，采用300g离心力，离心10分钟，弃上清；步骤十:用DC细胞培养基调节细胞浓度至0.5-0.6xl06个/毫升，将细胞悬液铺入6孔板中，每孔3毫升；步骤十一:将6孔板置于温度为37摄氏度，二氧化碳浓度为5%的孵箱内，培养48小时后，补充加入诱导DC细胞成熟的混合因子；步骤十二:继续培养24小时后，检测细胞数量、细胞活力、细胞表型及功能。
[0007]所述的步骤二中，所述的云雾层为单个核细胞层。
[0008]所述的步骤十中，所述的DC细胞培养基为GT551无血清培养基加入1000 U/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和500 U/mL白细胞介素4。
[0009]所述的步骤十一中，所述的诱导DC细胞成熟的混合因子为1000 U/mL肿瘤坏死因子、10000 U/mL白细胞介素1、1000 U/mL干扰素r、I微摩尔/升前列腺素E2、500 ng/mLCD40LU0 ng/mL 脂多糖、2.5 微克 / 毫升 R848。
[0010]本发明同现有技术相比，将制备时间由现有技术的7-9天缩短至3天；将DC细胞的活力由现有技术的68-75%提高至88-95%，纯度由现有技术的60-65%提高至80-90% ;采用本发明方法制备的DC细胞具有完全成熟表型，表达趋化因子CCR7，分泌高浓度IL-12细胞因子并有效促进T细胞增殖。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为本发明与现有技术制备的DC树突状细胞的MHC II类分子及共刺激分子表达水平对比图。
[0012]图2为本发明与现有技术制备的DC树突状细胞的趋化因子受体CCR7表达水平对比图。
[0013]图3为本发明与现有技术制备的DC树突状细胞的分泌白细胞介素12水平对比图。
[0014]图4为本发明与现有技术制备的DC树突状细胞诱导T淋巴细胞增殖能力的对比图。
【具体实施方式】
[0015]现对本发明做进一步描述。
[0016]本发明是一种DC细胞的快速制备方法，其特征在于:依次完成如下步骤:步骤一:在3毫升淋巴细胞分离液中以每分钟I毫升的速度加入5毫升全血，保持淋巴细胞分离液液面不被冲破，在室温状态下，采用300g离心力，离心20分钟，离心过程中提速及减速均不带刹车。
[0017]步骤二:用滴管缓慢吸取云雾层，吸取云雾层时，不要带入很多分离液，云雾层为单个核细胞层，加入0.9%的生理盐水30毫升洗涤一次，在室温状态下，采用300g离心力，离心5分钟，弃上清。
[0018]步骤三:用30毫升预冷的分选缓冲液重悬细胞，计数细胞数，在4摄氏度状态下，采用300g离心力，离心10分钟，弃上清。
[0019]步骤四:每I X IO7个细胞加入30微升预冷的分选缓冲液、10微升Fe受体阻断试剂和10微升生物素抗体混合液，进行混匀，混匀后，置于温度为4摄氏度的冰箱内，10分钟后取出。[0020] 步骤五:每I X IO7个细胞加入30微升预冷的分选缓冲液和20微升抗生物素微磁珠，进行混匀，混匀后，置于温度为4摄氏度的冰箱内，15分钟后取出。
[0021]步骤六:加入1-2微升预冷的分选缓冲液，在4摄氏度状态下，采用300g离心力，离心10分钟，弃上清，加入500微升预冷的分选缓冲液重悬细胞。
[0022]步骤七:MS柱置于磁架上，加入500微升预冷的分选缓冲液，待液体完全流干后，加入500微升细胞悬液，收集流出的细胞，该流出的细胞即为CD14+的单核细胞。
[0023]步骤八:待液体完全流干后，加入500微升预冷的分选缓冲液洗柱，重复两次。
[0024]步骤九:计数收集的细胞数量，在4摄氏度状态下，采用300g离心力，离心10分钟，弃上清。
[0025]步骤十:用DC细胞培养基调节细胞浓度至0.5-0.6xl06个/毫升，将细胞悬液铺入6孔板中，每孔3毫升，DC细胞培养基为宝生物工程(大连)有限公司生产的GT551无血清培养基加入1000 U/mL派普泰克公司生产的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和500 U/mL派普泰克公司生产的白细胞介素4。
[0026]步骤^^一:将6孔板置于温度为37摄氏度，二氧化碳浓度为5%的孵箱内，培养48小时后，补充加入诱导DC细胞成熟的混合因子。所述的诱导DC细胞成熟的混合因子为1000U/mL派普泰克公司生产的肿瘤坏死因子、10000 U/mL派普泰克公司生产的白细胞介素1、1000 U/mL派普泰克公司生产的干扰素r、l微摩尔/升西格玛奥德里奇公司生产的前列腺素 E2、500 ng/mL CD40LU0 ng/mL 脂多糖、2.5 微克 / 毫升 R848，R848 为 TLR7/8 的一种配体。
[0027]步骤十二:继续培养24小时后，检测细胞数量、细胞活力、细胞表型及功能。
[0028]本发明中，淋巴细胞分离液为国药集团化学试剂有限公司生产，在第四、第五步骤用到单核细胞分选试剂盒为德国美天旎公司生产，分选缓冲液为德国美天旎公司生产。
[0029]常规DC细胞制备需要7-9天，本发明制备DC细胞仅需3天，实验时间大大缩短。
[0030]常规方法制备的DC细胞通常活力为68-75%和纯度为60_65%，活力和纯度都较低，本发明制备的DC细胞活力为88-95%和纯度为80-90%，活力和纯度都明显提高。
[0031]参见图1，其中左侧一列为同型对照图，中间一列为常规DC细胞培养法的MHC II类分子及共刺激分子表达水平图，右侧一列为本发明的DC细胞培养法的MHC II类分子及共刺激分子表达水平图，与常规DC细胞制备方式相比，本发明制备的DC细胞具有完全成熟表型，
参见图2，其中左侧为同型对照图，中间为常规DC细胞培养法的趋化因子受体CCR7表达水平图，右侧为本发明的DC细胞培养法的趋化因子受体CCR7表达水平图，与常规DC细胞制备方式相比，本发明制备的DC细胞表达趋化因子CCR7。
[0032]参见图3，分泌白细胞介素12水平对比图，其中左侧为常规DC细胞培养法的分泌白细胞介素12水平，右侧为本发明的DC细胞培养法的分泌白细胞介素12水平，与常规DC细胞制备方式相比，本发明制备的DC细胞分泌高浓度白细胞介素12细胞因子。
[0033]参见图4，其中第一行为采用常规DC细胞培养法制备第四天的DC树突状细胞诱导T淋巴细胞增殖能力图，第二行为本发明的DC细胞培养法制备第四天的DC树突状细胞诱导T淋巴细胞增殖能力图，第三行为采用常规DC细胞培养法制备第六天的DC树突状细胞诱导T淋巴细胞增殖能力图，第四行为本发明的DC细胞培养法制备第六天的DC树突状细胞诱导T淋巴细胞增殖能力图，与常规DC细胞制备方式相比，本发明制备的DC细胞有效诱导T淋巴细胞增殖 。
【权利要求】
1.一种DC细胞的快速制备方法，其特征在于:依次完成如下步骤:步骤一:在3毫升淋巴细胞分离液中以每分钟I毫升的速度加入5毫升全血，保持淋巴细胞分离液液面不被冲破，在室温状态下，采用300g离心力，离心20分钟，离心过程中提速及减速均不带刹车；步骤二:用滴管吸取云雾层，加入0.9%的生理盐水30毫升洗涤一次，在室温状态下，采用.300g离心力，离心5分钟，弃上清；步骤三:用30毫升预冷的分选缓冲液重悬细胞，计数细胞数，在4摄氏度状态下，采用300g离心力，离心10分钟，弃上清；步骤四:每I X IO7个细胞加入30微升预冷的分选缓冲液、10微升Fe受体阻断试剂和10微升生物素抗体混合液，进行混匀，混匀后，置于温度为4摄氏度的冰箱内，10分钟后取出；步骤五:每IxlO7个细胞加入30微升预冷的分选缓冲液和20微升抗生物素微磁珠，进行混匀，混匀后，置于温度为4摄氏度的冰箱内，15分钟后取出；步骤六:加入1-2微升预冷的分选缓冲液，在4摄氏度状态下，采用300g离心力，离心10分钟，弃上清，加入500微升预冷的分选缓冲液重悬细胞；步骤七:MS柱置于磁架上，加入500微升预冷的分选缓冲液，待液体完全流干后，加入500微升细胞悬液，收集流出的细胞，该流出的细胞即为CD14+的单核细胞；步骤八:待液体完全流干后，加入500微升预冷的分选缓冲液洗柱，重复两次；步骤九:计数收集的细胞数量，在4摄氏度状态下，采用300g离心力，离心10分钟，弃上清；步骤十:用DC细胞培养基调节细胞浓度至0.5-0.6xl06个/毫升，将细胞悬液铺入6孔板中，每孔3毫升；步骤.1:将6孔板置于温度为37摄氏度,二氧化碳浓度为5%的孵箱内，培养48小时后,补充加入诱导DC细胞成熟的混合因子；步骤十二:继续培养24小时后，检测细胞数量、细胞活力、细胞表型及功能。
2.根据权利要求1所述的一种DC细胞的快速制备方法，其特征在于:所述的步骤二中，所述的云雾层为单个核细胞层。
3.根据权利要求1所述的一种DC细胞的快速制备方法，其特征在于:所述的步骤十中，所述的DC细胞培养基为GT551无血清培养基加入1000 U/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和500 U/mL白细胞介素4。
4.根据权利要求1所述的一种DC细胞的快速制备方法，其特征在于:所述的步骤十一中，所述的诱导DC细胞成熟的混合因子为1000 U/mL肿瘤坏死因子、10000 U/mL白细胞介* UlOOO U/mL干扰素r、l微摩尔/升前列腺素E2、500 ng/mL CD40LU0 ng/mL脂多糖、.2.5微克/毫升R848。
【文档编号】C12N5/0784GK103589685SQ201310610764
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月26日 优先权日:2013年11月26日
【发明者】储以微, 骆菲菲, 郑秀娟, 张丹 申请人:复旦大学