海洋球石藻真核表达载体的构建方法
【专利摘要】海洋球石藻真核表达载体的构建方法，涉及一种海洋微型浮游植物。提供一种海洋球石藻真核表达载体的构建方法，构建的真核表达载体能够运用于对海洋球石藻体内代谢途径研究、作为构建高产神经酰胺基因工程藻株的基础载体。通过构建海洋球石藻真核表达载体，作为微藻生物技术的工具，用于研究海洋球石藻机体代谢途径等问题，并为构建高产神经酰胺基因工程藻株提高基础载体。可用于海洋球石藻合成代谢途径的调控过程研究，即通过利用微藻生物技术阻断或修饰其代谢途径，构建高产神经酰胺海洋球石藻基因工程藻株，以达到神经酰胺的大量积累，为寻找一条新的生产神经酰胺的天然途径奠定基础。
【专利说明】海洋球石藻真核表达载体的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种海洋微型浮游植物，尤其是涉及一种海洋球石藻(Emilianiahuxleyi)真核表达载体的构建方法。
【背景技术】
[0002]近年来，微藻基因工程研究取得了许多重要进展，在微藻产品高值化上具有广泛的应用前景。目前，利用基因工程手段将外源基因转入到微藻细胞中已经有所报道，通过对藻类基因工程的研究，可以从改造的藻体中筛选抗性强且生长快的优良藻种，并把藻类作为新型的生物反应器生产某些具有较大经济价值的生物活性物质。在微藻中表达重要的蛋白、多肽甚至次生产物合成酶系，通过分子生物学技术阻断或修饰代谢途径，以创造具有商业价值的工程藻株和开发高价值微藻产品，推动微藻生物技术产业发展。
[0003]目前用于转化藻类的常用方法有:
[0004]①玻璃珠法，在待转化的藻细胞样品中加入DNA、玻璃珠和聚乙二醇，短暂涡旋震荡，使细胞产生瞬时空洞，从而使得DNA进入细胞内。该方法的优点是不需要昂贵的专业设备、操作简单、重复性好，缺点是需要使用没有细胞壁的藻株或者制备原生质体。由于微藻细胞壁结构组成的复杂性和多样性，大部分藻株很难获得可存活的原生质体，因此玻璃珠法并不适合用于所有微藻的转化。
[0005]②农杆菌侵染法，农杆菌是一种土壤寄生菌，具有感染植物细胞的能力。研究表明，该方法也可以用于真核微藻的转化，具有可以转化有完整细胞壁的微藻细胞T-DNA准确插入宿主基因组中、获得稳定转化子的效率较高等优点。
[0006]③基因枪法，将外`源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下，微粒被高速射入受体细胞，微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到染色体上，得到表达，从而实现基因的转化。该方法具有可以同时穿透细胞质膜和细胞器膜，几乎可以用于转化所有的微藻等优点，但是存在设备要求高、价格昂贵等缺点。
[0007]④电击法，在适当的外加电场强度和脉冲时间作用下，细胞膜产生瞬间的可逆性小孔，使附着在质膜上的DNA分子进入细胞内，移去外加电压后，膜孔在一定时间内可以自动修复，不影响或很少影响细胞质的生命活动，从而达到转化的效果。该方法的优点有强度适当的电脉冲对DNA和受体细胞损害较小、操作容易控制、流程简单、没有细胞的种属限制、转化效率较高等。其中比较常用是基因枪法和电转化法。通过现代生物技术(如基因工程、发酵工程及酶工程等)强化活性物质代谢途径，提高其产量已成为海洋生物资源领域新的研究热点。
[0008]神经酰胺(Ceramide)是一种新型的生物活性物质，对细胞分化、增殖、免疫、凋亡、衰老等生命活动具有重要调节作用；其特有的生理功效使其成为一种附加值高和市场潜力大的活性成分，在医药、食品、化工特别是高档护肤品以及治疗某些皮肤病的药物开发中具有广阔的应用前景。神经酰胺在生物体中以信号传导分子的形式存在，通常含量极低，一般低于细胞总脂类的1%，目前制备神经酰胺的原料主要为玉米、小麦、魔芋、米糠，但生产成本高，价格昂贵，产量不高。天然神经酰胺产量较低是制约神经酰胺功能性产品开发的瓶颈，迫切需要找到一种安全经济的来源和提高神经酰胺产量的途径。
[0009]海洋球石藻是一类单细胞的海洋微型浮游植物，在分类学上隶属于定鞭藻门(Haptophyta=Prymnesiophyta),定鞭藻纲(Prym nesiophyceae),广泛分布于世界范围的近海和大洋水域中。自然海域中，病毒感染海洋浮游植物是一种普遍现象；研究发现，球石藻病毒感染宿主后导致宿主细胞的裂解，并伴随神经酰胺的大量合成，因此该藻及其病毒有望开发成为一种新的生产神经酰胺的天然途径。尽管如此，病毒感染通过什么机制(或代谢途径)促使细胞合成大量的神经酰胺；病毒感染伴随着神经酰胺的合成，神经酰胺是一类中间产物，导致这种天然的合成途径不能无限制地积累，因此通过构建基因工程藻株，人为调控神经酰胺合成代谢途径将有望解决这一难题 。
【发明内容】
[0010]为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种海洋球石藻真核表达载体的构建方法，本发明构建的真核表达载体能够运用于对海洋球石藻体内代谢途径(特别是神经酰胺的合成途径)研究、作为构建高产神经酰胺基因工程藻株的基础载体。
[0011]本发明包括以下步骤:
[0012]I)海洋球石藻抗生素抗性分析及选择标记基因的筛选；
[0013]2)基础载体、启动子基因及报告基因的选择；
[0014]3)根据步骤I)和2)确定的标记基因、启动子基因及报告基因的序列设计引物；
[0015]4)从含有pGFP质粒的大肠杆菌ToplO-pGFP中提取质粒,作为下一步的模板；
[0016]5) PCR扩增报告基因gfp ；
[0017]6)PCR电泳回收产物，连接质粒，转化大肠杆菌ToplO感受态细胞，挑取克隆，提取质粒采用Pst I和Sal I进行双酶切后电泳分析PCR产物并进行测序鉴定；
[0018]7)选择与预期大小相符的条带进行回收，通过双酶切得到目的基因片断，连接质粒，转化大肠杆菌ToplO感受态细胞,筛选得到重组质粒；
[0019]8)从海洋球石藻细胞中提取DNA;
[0020]9) PCR扩增海洋球石藻fcp启动子基因；
[0021]10) PCR电泳回收产物，连接质粒，转化大肠杆菌ToplO感受态细胞，挑取克隆，提取质粒采用EcoR I和Sac I进行双酶切后电泳分析PCR产物并进行测序鉴定；
[0022]11)选择与预期大小相符的条带进行回收，通过双酶切得到目的基因片断，分别连接步骤g)构建的重组质粒和质粒，分别转化大肠杆菌ToplO感受态细胞，筛选得到两种重组质粒；
[0023]12)从含有pSELECT质粒的大肠杆菌ToplO-pSELECT中提取质粒，作为下一步的模板；
[0024]13) PCR扩增标记基因neo ；
[0025]14) PCR电泳回收产物，连接质粒，转化大肠杆菌ToplO感受态细胞，挑取克隆，提取质粒采用Xba I和BamH I进行双酶切后电泳分析PCR产物并进行测序鉴定；
[0026]15)选择与预期大小相符的条带进行回收，通过双酶切得到目的基因片断，连接步骤j)构建的重组质粒，分别转化大肠杆菌感受态细胞，筛选得到重组质粒；[0027]16)将海洋球石藻细胞进行处理，去除细胞表面球石粒(碳酸钙)；
[0028]17)采用电转化方法将构建的真核表达载体共转化海洋球石藻细胞，并在荧光显微镜下观察确定转化的细胞。
[0029]在步骤I)中，所述海洋球石藻抗生素可选自氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、G418、链霉素、新生霉素、嘌呤霉素等中的一种(均购于鹭隆生物科技有限公司)。
[0030]在步骤2)中，所述基础载体可采用PUC18 (购于GE Healthcare厦门鹭隆生物科技发展有限公司)。
[0031]在步骤3)中，所述引物可采用 SEQIDN0.1、SEQIDN0.2、SEQIDN0.3、SEQIDN0.4、SEQIDN0.5和SEQIDN0.6 ;其核苷酸序列分别为:
[0032]SEQIDN0.1:GFP-F:5, -GCGTCGACATGAGTAAAGGAGAAGAAC ~3'， [0033]其中，划线部分为SalI酶切位点；
[0034]SEQIDN0.2:GFP-R:5' -GCTGCAGCTTTATTTGTATAGTTCATCCA-3'，
[0035]其中，划线部分为PstI酶切位点；
[0036]SEQIDNOJ=FCP-Fj' -ACACAGAATTCTGTGTGGCTTGAG-3'，
[0037]其中，划线部分为EcoRI酶切位点；
[0038]SEQIDN0.4:FCP-R:5' -TTAAGAGCTCGGTGAGGAAGGAG-3'，
[0039]其中，划线部分为Sac I酶切位点；
[0040]SEQIDN0.5:6418^:5' -TATAATAGGATCCACTATAGGAGG-3'，
[0041 ] 其中，划线部分为BamH I酶切位点；
[0042]SEQIDN0.6:G418-R:5' -AGACAGCGAGCTTCTAGATTTAG-3'，
[0043]其中，划线部分为Xba I酶切位点。
[0044]在步骤4)中，所述含有pGFP质粒的大肠杆菌ToplO-pGFP购于泰京生物技术有限公司。
[0045]在步骤5)中，所述PCR扩增的反应条件可为:94°C预变性5min后进行94°C变性30s、52°C复性30s、72°C延伸Imin的35个循环，72°C再延伸IOmin的扩增，保存于4°C。
[0046]在步骤6)中，所述质粒可采用pMD19_T质粒，pMD19_T质粒购于TaKaRa广州瑞真生物技术有限公司；所述双酶切采用Pst I和Sal I。
[0047]在步骤7)中，所述双酶切采用的酶为Pst I和Sal I。
[0048]在步骤8)中，所述海洋球石藻细胞可从美国国家海洋藻种保藏中心(CultureCenter of Marine Phytoplankton，CCMP)购买，https://ncma.bigelow.0rg/。
[0049]在步骤9 )中，所述PCR扩增的反应条件为:94°C预变性5min后进行94°C变性30s、56°C复性30s、72°C延伸Imin的35个循环，72°C再延伸IOmin的扩增，保存于4°C。
[0050]在步骤10)中，所述质粒可采用pMD19-T质粒，pMD19_T质粒购于TaKaRa广州瑞真生物技术有限公司；所述双酶切采用EcoRI和Sac I。
[0051 ] 在步骤11)中，所述双酶切采用EcoRI和Sac I。
[0052]在步骤12)中，所述含有pSELECT质粒的大肠杆菌ToplO-pSELECT购于泰京生物技术有限公司。
[0053]在步骤13)中，所述PCR扩增的反应条件为:94°C预变性5min后进行94°C变性30s、51。。复性30s、72。。延伸Imin的35个循环，72°C再延伸IOmin的扩增，保存于4°C。[0054]在步骤14)中，所述质粒采用pMD19-T质粒，pMD19_T质粒购于TaKaRa广州瑞真生物技术有限公司；所述双酶切采用Xba I和BamH I。
[0055]在步骤15)中，所述双酶切采用Xba I和BamH I。
[0056]在步骤16)中，所述海洋球石藻细胞购于美国国家海洋藻种保藏中心(CultureCenter of Marine Phytoplankton,CCMP),网址为:https://ncma.bigelow.0rg ;所述去除细胞表面碳酸钙采用MES-NaOH缓冲液，其配方为:0.5mol/L MES (2-N-吗啉代-乙磺酸)(购于上海生工BBI分装)，pH5.5。
[0057]在步骤17)中，所述电转化方法可采用Hepes电击缓冲液，其配方为:0.080mol/LKCl, 0.005mol/L CaCl2,0.2mol/L 甘露醇,0.2mol/L 山梨醇,0.01mol/L Hepes (4-轻乙基哌嗪乙磺酸)(购于上海生工BBI分装)，pH7.2。
[0058]本发明中，含有pGFP质粒和含有pSELECT质粒的大肠杆菌均购自泰京生物科技有限公司；不含任何质粒的大肠杆菌ToplO购于碧云天生物技术研究所；双酶切所用的酶均购于TaKaRa广州瑞真生物技术有限公司。
[0059]本发明的有益效果是:本发明基于对构建海洋球石藻真核表达载体的研究分析得到，海洋球石藻对G418特别敏感，因此G418抗性基因最适合作为该真核表达载体的标记基因。同时，根据已报道的序列结合生物信息学分析，确定编码岩藻黄素叶绿素a/c结合蛋白的启动子作为该真核表达载体的启动子，该启动子基因来源于宿主基因组DNA，针对性强、启动效果好，有利于整合到宿主的染色体中，从而获得稳定的转化子。选择绿色荧光蛋白基因作为报告基因，由于绿色荧光蛋白是一种非常实用的新型报告基因，具有荧光特性稳定、检测方便、无种属特异性、对受体细胞无毒害作用、不受假阳性干扰和灵敏度高等优点。另外，海洋球石藻细胞表面有球石粒(碳酸钙)包裹着，先通过脱钙处理去掉碳酸钙，再进行电击法转化，大大提高的转化效率，并能在荧光显微镜下观察到发绿色荧光的转化藻细胞。因此，通过构建海洋球石藻真核表达载体，作为微藻生物技术的工具，用于研究海洋球石藻机体代谢途径等问题，并为构建高产神经酰胺基因工程藻株提高基础载体。本发明所阐述的这种新型的海洋球石藻真核表达载体及其构建方法，可用于海洋球石藻合成代谢途径的调控过程研究，即通过利用微藻生物技术阻断或修饰其代谢途径，构建高产神经酰胺海洋球石藻基因工程藻株，以达到神经酰胺的大量积累，为寻找一条新的生产神经酰胺的天然途径奠定基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0060]图1是本发明中pUC18-gfp_fcp重组质粒双酶切的凝胶电泳图。
[0061]图2是本发明中pUC18-fcp_neo重组质粒双酶切的凝胶电泳图。
[0062]图3是本发明中pUC18-gfp_fcp重组质粒的载体图谱。
[0063]图4是本发明中pUC18-fcp_neo重组质粒的载体图谱。
[0064]图5是本发明构建的真核表达载体电转化海洋球石藻在突光显微镜(400倍)下观察结果图。
【具体实施方式】
[0065]下面结合附图对本发明作进一步的说明。[0066]实施例1
[0067]本实施例主要包括如下步骤来构建海洋球石藻真核表达载体。
[0068]a)海洋球石藻抗生素抗性分析，将处于对数中期的藻液接种于50ml的三角瓶中使其细胞密度为104cellS/L，每瓶藻液25ml，再加入不同浓度的抗生素，分别是氨苄青霉素(O、100 u g/ml、300 u g/ml、500 u g/ml、700u u g/ml、900 u g/ml )、卡那霉素(0、100 u g/ml、300 u g/ml>500 u g/ml、700 ii g/ml>900 u g/ml)、氯霉素(0、25 ii g/ml、50 ii g/ml、100 ii g/ml、200 ii g/ml、300 ii g/ml)、新生霉素(0、25 ii g/ml、50 ii g/ml、100 ii g/ml、200 ii g/ml、300ii g/ml)、G418 (0、25 y g/ml、50 y g/ml、100 y g/ml、200 y g/ml、300 y g/ml)、链霉素(0、25 V- g/ml>50 V- g/ml、100 ii g/ml>200 u g/ml>300 u g/ml)、嘌呤霉素(0、25ii g/ml>50 u g/ml>75 u g/ml>100 u g/ml>125 u g/ml),抗生素浓度梯度由多次预实验确定,每个浓度设置3个平行组，光照培养。每24h取样一次，用卢戈氏液固定样品，血球计数板计数，测定细胞数目，并观察藻液颜色变化，筛选出海洋球石藻的最适抗生素、以确定标记基因。
[0069]b)根据目前已有的载体，考虑载体的多克隆位点及细菌的选择标记，最终确定PUC18为基础载体；通过查阅相关资料、查找已报道的相关蛋白基因的启动子并结合生物信息学分析，确定海洋球石藻基因组中编码岩藻黄质叶绿素a/c结合蛋白基因的启动子作为启动子；而报告基因的选择是通过比较已有的报告基因，综合考虑其优缺点而确定绿色荧光蛋白基因为报告基因。
[0070]c)根据步骤a)和b)确定的报告基因(绿色荧光蛋白基因gfp)、海洋球石藻启动子(岩藻黄质叶绿素a/c结合`蛋白启动子基因fcp)和标记基因(G418的抗性基因neo)，根据这三段基因的序列分别设计三对特异引物进行PCR扩增，本实验中采用的引物为:SEQIDN0.1:GFP-F:5' -GCGTCGACATGAGTAAAGGAGAAGAAC ~3'(划线部分为 Sail 酶切位点);SEQIDN0.2:GFP-R:5' -GCTGCAGCTTTATTTGTATAGTTCATCCA-3'(划线部分为 PstI 酶切位点)；SEQIDN0.3:FCP-F: 5 ' -ACACAGAATTCTGTGTGGCTTGAG-3 '(划线部分为 EcoRI 酶切位点)；SEQIDN0.4:FCP-R:5' -TTAAGAGCTCGGTGAGGAAGGAG-3'(划线部分为 Sac I 酶切位点)；SEQIDN0.5:G418-F:5' -TATAATAGGATCCACTATAGGAGG-3 '(划线部分为 BamH I 酶切位点)；SEQIDN0.6:G418-R:5' -AGACAGCGAGCTTCTAGATTTAG-3 '(划线部分为 Xba I 酶切位点)。
[0071]d) pGFP质粒提取按照TIANGEN质粒小提试剂盒操作说明书进行:(I)、柱平衡步骤:向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500iU的平衡液BL，12000rpm离心Imin ；弃收集管中的废液；(2)、取I~5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm离心Imin,尽量吸除上清；(3)、加入250 U I溶液Pl,充分悬浮细菌沉淀；(4)、加A 250 u I溶液P2，温和的上下翻转6~8次使菌体裂解；(5)、加入350 U I溶液P3，温和的上下翻转6~8次，12000rpm离心IOmin,此时在离心管底部形成沉淀；(6)、将上一步收集的上清液转移到吸附柱CP3中，12000rpm离心30~60s，弃废液；(7)、向吸附柱CP3中加A 600 u I漂洗液PW，12000rpm离心30~60s，弃废液；(8)、重复上一步操作；(9)、将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm离心2min，除残留；(10)、将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，加入50iil无菌水于吸附柱CP3内，室温静置2min，12000rpm离心lmin，收集质粒溶液。1%琼脂糖凝胶电泳检测质粒质量，并取2 ill测其浓度。
[0072]e) PCR扩增绿色荧光蛋白基因:PCR反应体系为25 yl，含Iyl模板质粒、0.3iUrTaq DNA polymerase (rTaq DNA聚合酶)(购于TaKaRa广州瑞真生物技术有限公司)、I U I上游引物 SEQIDN0.1 (10pmol/ii 1)、1 ii I 下游引物 SEQIDN0.2 (10pmol/u 1),2 u I dNTP(脱氧核苷三磷酸)(dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2.5mmol/L)、2.5 yllOXPCR 缓冲液(其中含有 IOOmmoI/L Tris-HCl (pH8.3), 500mmol/LKCl, 15mmol/L MgCl2)(购于 TaKaRa 广州瑞真生物技术有限公司)、17.2iU无菌水。
[0073]PCR的反应条件为:94°C预变性5min后进行94°C变性30s、52°C复性30s、72°C延伸Imin的35个循环，72°C再延伸lOmin，保存于4°C。
[0074]f)绿色荧光蛋白基因的PCR扩增后的产物鉴定:用设计的GFP基因特异性引物GFP-F和GFP-R进行PCR，扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，可见大小约717bp的特异性扩增片段，与预期大小相符。PCR电泳产物(与预期大小相符的条带)经DNA (脱氧核糖核酸)回收试剂盒回收后，进行T-A克隆，所用载体为pMD19-T (购于TaKaRa广州瑞真生物技术有限公司)，并转化到大肠杆菌ToplO感受态细胞。将IOiU连接产物(含有4iU回收的gfp基因、I ill pMD19-T载体和5iil solution〗连接酶)加入到200 ill的大肠杆菌ToplO感受态细胞中，置冰浴30min，42°C热激90s，冰浴2min ;再加入到含有800 LB(LB培养基)的试管中混匀，37°C, 150rpm (每min转数)60min,取200 y I涂布至Amp板(氨节青霉素)板(10mg/ml)，37°C倒置培养过夜，至克隆长出，进行蓝白斑筛选。挑取白色菌落，采用试剂盒小量提取质粒.采用Pst I和Sal I双酶切后电泳分析并进行测序鉴定，测序结果(见序列表1)证明阅读框架正确，得到了含有目的基因片段的重组质粒pMD19-T-gfp。
[0075]g) PCR产物经切胶回收后以Pst I和Sal I双酶切获得717bp (碱基对)的目的基因片段，与经Pst I和Sal I双酶切的PUC18基础载体连接，并转化大肠杆菌ToplO，筛选得到 重组子pUC18-gfp (质粒构建图如图1)，其中M1为DNA Marker (分子量标记)(TaKaRaA-Hind III digest23130,9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564, 125), I 为pUC18-gfp 质粒，2 为 Pst I/Sal I 双酶切 pUC18-gfp 质粒结果，3 为 pUC18_gfp 质粒 PCR 扩增 gfp，4 为 pUC18-gfp-fcp 质粒，5 为 Sac I/EcoR I 双酶切 pUC18-gfp-fcp 质粒结果，6 为pUC18-gfp-fcp 质粒 PCR 扩增 fcp, M2 为 DNA Marker (分子量标记)(TaKaRa IOObp DNALadderMarkerl500, 1000，900，800，700，600，500，400，300，200，100)。对重组质粒进行 PCR 验证和酶切验证可见一 717bp条带,与预期大小相符,说明gfp基因已连接到pUC18载体上。
[0076]h)从海洋球石藻中提取基因组DNA:(I)取250mL指数期的藻液，7000rpm，离心IOmin,收集藻细胞沉淀，加入500 u L0.5%SDS (十二烷基磺酸钠)和终浓度为20 y g ? mL_l的蛋白激酶K (购于AMERSC0上海生工分装)，旋涡混合30s，55°C孵育30min，每IOmin轻轻的旋涡混合一次；(2)加入80 u L4.5M的NaCl和65°C预热的CTAB溶液，轻轻混匀，65°C恒温孵育IOmin ; (3)将样品取出降至室温，加入500 体积比为24:1的氯仿-异戊醇(480 u L:20ii L)和60 ii LTris平衡酚(购于Biotech上海生工)轻轻颠倒离心管混匀样品；
(4)室温下高速(12000rpm)离心5min ； (5)移出最上层部分的水相于新的无菌的离心管中加入0.6倍体积的异丙醇，上下轻轻颠倒几次混匀，于室温下静止IOmin使沉淀形成；(6)全速离心(13000rpm) IOmin,使DNA沉淀下来，取出异丙醇，加入预冷的70%乙醇500 y L最高速度(13000rpm)离心5min,室温干燥2min ； (7)加入35mL TE缓冲液(购于碧云天生物技术研究所)(也可用无菌水代替)和终浓度为0.lmg/ml的RNase37°C孵育2个h，以除去RNA。[0077]i)PCR扩增海洋球石藻启动子基因fcp:PCR反应体系为25iU，含Iiil模板DNA、
0.3ill rTaq DNA polymerase、I ii I 上游引物 SEQIDN0.3 (IOpmol/)、I 下游引物SEQIDN0.4 (lOpmol/u l),2u I dNTP, 2.5 u I 10XPCR 缓冲液、5 y 15%DMS0 (二甲基亚砜)、
1.25 u I Betaine(5mol/l甜菜碱)(购于Sigma厦门鹭隆生物科技发展有限公司)，11.05 U I无菌水。
[0078]PCR的反应条件为:94°C预变性5min后进行94°C变性30s、56°C复性30s、72°C延伸Imin的35个循环，72°C再延伸IOmin的扩增，保存于4°C。
[0079]j)启动子基因的PCR扩增后的产物鉴定:用设计的启动子基因特异性引物FCP-F和FCP-R进行PCR，扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，可见大小约483bp的特异性扩增片段，与预期大小相符。PCR电泳产物(与预期大小相符的条带)经DNA (脱氧核糖核酸)回收试剂盒回收后，进行T-A克隆，所用载体为PMD19-T，并转化到大肠杆菌ToplO感受态细胞。将10 ill连接产物(含有4 ill回收的fcp基因、I ill ?1?19-1'载体和5111 solutionl连接酶)加入到200 ill的大肠杆菌ToplO感受态细胞，置冰浴30min，42°C热激90s，冰浴2min ;再加入到含有800iU LB (LB培养基)的试管中，37°C，150rpm (每min转数)60min，取200iil涂布至Amp板(氨苄青霉素)板(10mg/ml)，37°C倒置培养过夜，至克隆长出，进行蓝白斑筛选。挑取白色菌落，采用试剂盒小量提取质粒.采用EcoR I和Sac I双酶切后电泳分析并进行测序鉴定，测序结果(见序列表1)证明启动子序列正确，得到了含有目的基因片段的重组质粒pMD19-T-fcp。
[0080]k) PCR产物经切胶回收后以EcoR I和Sac I双酶切获得483bp (碱基对)的目的基因片段，分别与经EcoR I和Sac I双酶切的pUC18-gfp重组质粒和pUC18基础载体连接，并转化大肠杆菌ToplO,筛选得到重组子pUC18-gfp-fcp (质粒构建图如图1,质粒图谱如图3);重组子pUC18-fcp (质粒构建图如图2)，其中M1为DNA Marker (分子量标记)(TaKaRaA-Hind III digest 23130，9416，6557，4361，2322，2027，564，125)，I 为pUC18-fcp 质粒，2 为 Sac I/EcoR I 双酶切 pUC18_fcp 质粒结果，3 为 pUC18_fcp 质粒 PCR扩增 fcp，4 为 pUC18-fcp_neo 质粒，5 为 Xba I/BamH I 双酶切 pUC18-fcp_neo 质粒结果，6为 pUC18-gfp-fcp 质粒 PCR 扩增 neo，M2 为 DNA Marker (分子量标记)(TaKaRa IOObp DNALadderMarkerl500, 1000，900，800，700，600，500，400，300，200，100)。对重组质粒进行PCR验证和酶切验证可见一 484bp条带,与预期大小相符,说明fcp基因已分别连接到pUC18-gfp重组质粒和PUC18载体上。
[0081]I) pSELECT质粒提取按照TIANGEN质粒小提试剂盒操作说明进行。
[0082]m)PCR扩增G418抗性基因neo =PCR反应体系为25 yl，含I 模板质粒、0.3 U IrTaq DNA polymerase、I y I 上游引物 SEQIDN0.5 (10pmol/u 1),1 U I 下游引物 SEQIDN0.6(10pmol/u l),2u I dNTP, 2.5 u 110 X PCR 缓冲液、17.2 y I 无菌水。
[0083]PCR的反应条件为:94°C预变性5min后进行94°C变性30s、51°C复性30s、72°C延伸Imin的35个循环，72°C再延伸lOmin，保存于4°C。
[0084]n)标记基因neo的PCR扩增后的产物鉴定:用设计的neo基因特异性引物G418-F和G418-R进行PCR，扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，可见大小约797bp的特异性扩增片段，与预期大小相符。PCR电泳产物(与预期大小相符的条带)经DNA (脱氧核糖核酸)回收试剂盒回收后，进行T-A克隆，所用载体为pMD19-T，并转化到大肠杆菌ToplO感受态细胞。将10 ill连接产物(含有4 ill回收的neo基因、I ill pMD19_T载体和5 solutionl连接酶)加入到200 ill的大肠杆菌ToplO感受态细胞，置冰浴30min，42°C热激90s，冰浴21^11;再加入到含有800111 LB (LB培养基)的试管中，37°C，150rpm (每min转数)60min，取200iil涂布至Amp板(氨苄青霉素)板(10mg/ml)，37°C倒置培养过夜，至克隆长出，进行蓝白斑筛选。挑取白色菌落，采用试剂盒小量提取质粒.采用Xba I和BamH I双酶切后电泳分析并进行测序鉴定，测序结果(见序列表1)证明阅读框架正确，得到了含有目的基因片段的重组质粒pMD19-T-neo。
[0085]O)PCR产物经切胶回收后以Xba I和BamH I双酶切获得797bp(碱基对)的目的基因片段，与经Xba I和BamH I双酶切的pUC18_fcp重组质粒连接，并转化大肠杆菌ToplO，筛选得到重组子pUC18-fcp-neo(质粒构建图如图2,质粒图谱如图4)。对重组质粒进行PCR验证和酶切验证可见一 797bp条带,与预期大小相符，说明neo基因已连接到pUC18_fcp重组质粒上。
[0086]p)海洋球石藻细胞表面去除球石粒(碳酸钙)过程:取100ml指数生长期的藻液，4°C下4000rpm离心5min ;将收集的细胞沉淀重悬于5ml MES-NaOH缓冲液(0.5mol/L,pH5.5)，置于18°C培养箱反应2h。
[0087]q)电转化过程:将步骤p)处理的藻细胞在4°C下4000rpm离心5min,弃废液；用Hepes 电击缓冲液(0.080mol/L KCl, 0.005mol/L CaCl2, 0.2mol/L 甘露醇，0.2mol/L 山梨醇，0.01mol/L Hepes (4_羟乙基哌嗪乙磺酸)，pH7.2)洗涤细胞I次，4°C下4000rpm离心5min，弃废液；再将细胞重悬于Ifepes缓冲液，使其终浓度为5X IO7个/ml，再加入重组质粒充分混匀，使重组质粒的终浓度为IOii g/ml，用Iml宽口吸头充分混匀，冰浴15min ；吸取IOOii I混合液加入0.1cm冰浴的电击杯(购于Bio-Rad泰京生物科技有限公司)，电击(200V, 2ms/次，2次);电击完毕冰浴15min，再转入培养基中培养；培养24后加入G418 (终浓度为100 u g/ml),继续培养；一周后取样置于荧光显微镜下观察，如图5所示，该图是置于400倍的荧光显微镜下观察的结果，图中视野中有三个被转化的微藻细胞发绿色荧光，确定为被转化的阳性藻株。`
【权利要求】
1.海洋球石藻真核表达载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤: 1)海洋球石藻抗生素抗性分析及选择标记基因的筛选； 2)基础载体、启动子基因及报告基因的选择； 3)根据步骤I)和2)确定的标记基因、启动子基因及报告基因的序列设计引物； 4)从含有pGFP质粒的大肠杆菌ToplO-pGFP中提取质粒，作为下一步的模板； 5)PCR扩增报告基因gfp ； 6)PCR电泳回收产物，连接质粒，转化大肠杆菌ToplO感受态细胞，挑取克隆，提取质粒采用Pst I和Sal I进行双酶切后电泳分析PCR产物并进行测序鉴定； 7)选择与预期大小相符的条带进行回收，通过双酶切得到目的基因片断，连接质粒，转化大肠杆菌ToplO感受态细胞,筛选得到重组质粒； 8)从海洋球石藻细胞中提取DNA； 9)PCR扩增海洋球石藻fcp启动子基因； 10)PCR电泳回收产物，连接质粒，转化大肠杆菌ToplO感受态细胞，挑取克隆，提取质粒采用EcoR I和Sac I进行双酶切后电泳分析PCR产物并进行测序鉴定； 11)选择与预期大小相符的条 带进行回收，通过双酶切得到目的基因片断，分别连接步骤g)构建的重组质粒和质粒，分别转化大肠杆菌ToplO感受态细胞，筛选得到两种重组质粒; 12)从含有pSELECT质粒的大肠杆菌ToplO-pSELECT中提取质粒，作为下一步的模板； 13)PCR扩增标记基因neo ； 14)PCR电泳回收产物，连接质粒，转化大肠杆菌ToplO感受态细胞，挑取克隆，提取质粒采用Xba I和BamH I进行双酶切后电泳分析PCR产物并进行测序鉴定； 15)选择与预期大小相符的条带进行回收，通过双酶切得到目的基因片断，连接步骤j)构建的重组质粒，分别转化大肠杆菌感受态细胞，筛选得到重组质粒； 16)将海洋球石藻细胞进行处理，去除细胞表面球石粒； 17)采用电转化方法将构建的真核表达载体共转化海洋球石藻细胞，并在荧光显微镜下观察确定转化的细胞。
2.如权利要求1所述海洋球石藻真核表达载体的构建方法，其特征在于在步骤I)中，所述海洋球石藻抗生素选自氨节青霉素、卡那霉素、氯霉素、G418、链霉素、新生霉素、嘌呤霉素等中的一种；在步骤2)中，所述基础载体可采用PUC18。
3.如权利要求1所述海洋球石藻真核表达载体的构建方法，其特征在于在步骤3)中，所述引物采用 SEQIDN0.1、SEQIDN0.2、SEQIDN0.3、SEQIDN0.4、SEQIDN0.5 和 SEQIDN0.6 ;其核苷酸序列分别为:
SEQIDN0.1:GFP-F:5' -GCGTCGACATGAGTAAAGGAGAAGAAC _3'， 其中，划线部分为SalI酶切位点；
SEQIDN0.2:GFP-R:5' -GCTGCAGCTTTATTTGTATAGTTCATCCA-3'， 其中，划线部分为PstI酶切位点；
SEQIDN0.3:FCP-F:5' -ACACAGAATTCTGTGTGGCTTGAG-3'， 其中，划线部分为EcoRI酶切位点；
SEQIDN0.4:FCP-R:5' -TTAAGAGCTCGGTGAGGAAGGAG-3'，其中，划线部分为Sac I酶切位点；
SEQIDN0.5:G418-F:5' -TATAATAGGATCCACTATAGGAGG-3'， 其中，划线部分为BamH I酶切位点；
SEQIDN0.6:G418-R:5' -AGACAGCGAGCTTCTAGATTTAG-3'， 其中，划线部分为Xba I酶切位点。
4.如权利要求1所述海洋球石藻真核表达载体的构建方法，其特征在于在步骤5)中，所述PCR扩增的反应条件为:94°C预变性5min后进行94°C变性30s、52°C复性30s、72°C延伸Imin的35个循环，72°C再延伸IOmin的扩增，保存于4°C ； 在步骤9)中，所述PCR扩增的反应条件可为:94°C预变性5min后进行94°C变性30s、56°C复性30s、72°C延伸Imin的35个循环，72°C再延伸IOmin的扩增，保存于4°C ； 在步骤13)中，所述PCR扩增的反应条件可为:94°C预变性5min后进行94°C变性30s、51°C复性30s、72°C延伸Imin的35个循环，72°C再延伸IOmin的扩增，保存于4°C。
5.如权利要求1所述海洋球石藻真核表达载体的构建方法，其特征在于在步骤6)、10)和14)中，所述质粒采用pMD19-T质粒。
6.如权利要求1所述海洋球石藻真核表达载体的构建方法，其特征在于在步骤6)和7)中，所述双酶切采用的酶为Pst I和Sal I。
7.如权利要求1所述海洋球石藻真核表达载体的构建方法，其特征在于在步骤10)和11)中，所述双酶切采用EcoRI和Sac I。
8.如权利要求1所述海洋球石藻真核表达载体的构建方法，其特征在于在步骤14)和15)中，所述双酶切采用Xba I和BamH I。
9.如权利要求1所述海洋球石藻真核表达载体的构建方法，其特征在于在步骤16)中，所述去除细胞表面碳酸钙采用MES-NaOH缓冲液，其配方为:0.5mol/L2-N-吗啉代-乙磺酸，PH5.5。
10.如权利要求1所述海洋球石藻真核表达载体的构建方法，其特征在于在步骤17)中，所述电转化方法采用Ifepes电击缓冲液，其配方为:0.080mol/L KCl, 0.005mol/LCaCl2,0.2mol/L甘露醇，0.2mol/L山梨醇，0.01mol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，pH7.2。
【文档编号】C12N15/66GK103642831SQ201310626234
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】刘静雯, 蔡慧农, 蔡艺钦 申请人:集美大学