解淀粉芽胞杆菌及微生物菌剂和它们的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种解淀粉芽胞杆菌（Bacillus?amyloliquefaciens），其保藏编号为CCTCC?NO.M2013501。本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂包含培养基和菌体，所述菌体包括保藏编号为CCTCC?NO.M2013501的解淀粉芽胞杆菌，且所述菌体还包括枯草芽胞杆菌（Bacillus?subtilis）和地衣芽胞杆菌（Bacillus?lincheniformis）。本发明还提供了如上所述的解淀粉芽胞杆菌和如上所述的微生物菌剂在盐碱地改良中、增加植物耐旱性中、防治小麦纹枯病中和在防治黄瓜枯萎病中的应用。
【专利说明】解淀粉芽胞杆菌及微生物菌剂和它们的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业生物【技术领域】，具体地，涉及一种解淀粉芽胞杆菌、一种微生物菌剂和它们的应用。
【背景技术】
[0002]土地盐碱化是影响农业生产和生态环境的严重问题。全世界约有20%的耕地和接近50%的灌溉农田产量严重受土壤高浓度盐碱的影响。在中国，约有I亿亩次生盐溃化农田，占耕地总面积的10%。如何确实改良和有效利用盐碱地，提高农林业生产的经济、社会和生态效益，是现代农林业所关注的重大问题。 [0003]在国内外盐碱地改良研究领域，先后提出了 “种稻改碱”农业改良措施，“灌水洗盐”工程改良措施，以及利用石膏、氯化钙、工业废酸、燃煤烟气脱硫物等化学改良措施。这些措施见效快，取得了显著成果。但是改良成本高，资源耗费大，且产生养分流失、污染下游、改良效果不稳定、容易返盐等问题。
[0004]近年来，在长期研究成果的基础上，人们从恢复生态学的角度逐渐认识到把盐碱地的改良和利用结合起来，即“寓改良到利用中，改良与利用并行”，以生物利用为核心的生态恢复技术是未来盐碱地改良修复的突破口。目前，生物改良包括种植耐盐碱植物、使用微生物菌肥等。而开发高效的微生物菌肥制剂，首先就要获得耐受盐碱且对盐碱具有去除作用的微生物菌株，但是，现有的微生物菌株去除盐碱的效果仍然较差。
【发明内容】
[0005]为了克服现有的微生物菌株去除盐碱的效果较差的缺陷，本发明提供了一种解淀粉芽胞杆菌，该解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的保藏编号为CCTCCN0.M2013501。
[0006]本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂包含培养基和菌体，所述菌体包括保藏编号为CCTCC N0.M2013501的解淀粉芽胞杆菌，且所述菌体还包括枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)和地衣芽胞杆菌(Bacillus lincheniformis)。
[0007]本发明还提供了如上所述的解淀粉芽胞杆菌和如上所述的微生物菌剂在盐碱地改良中的应用。
[0008]本发明还提供了如上所述的解淀粉芽胞杆菌和如上所述的微生物菌剂在增加植物耐旱性中的应用。
[0009]本发明还提供了如上所述的解淀粉芽胞杆菌和如上所述的微生物菌剂在防治小麦纹枯病中的应用。
[0010]本发明还提供了如上所述的解淀粉芽胞杆菌和如上所述的微生物菌剂在防治黄瓜枯萎病中的应用。
[0011]通过上述技术方案，本发明可以更加有效地去除盐碱，例如可以将土壤脱盐率提高至55%以上。[0012]本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
[0013]生物材料保藏
[0014]本发明的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是本发明的发明人从山东陵县土壤中分离的纯培养物，其保藏编号为CCTCC N0.M2013501，保藏日期为2013年10月24日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，分类命名为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
【具体实施方式】
[0015]以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0016]本发明提供了一种解淀粉芽胞杆菌，该解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的保藏编号为 CCTCC N0.M2013501。
[0017]本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂包含培养基和菌体，所述菌体包括保藏编号为CCTCC N0.M2013501的解淀粉芽胞杆菌，且所述菌体还包括枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)和地衣芽胞杆菌(Bacillus lincheniformis)。
[0018]其中，所述微生物菌剂中含有的菌体的量可以在很大范围内改变，优选情况下，每克所述微生物菌剂所含的总活菌数可以为2-20X 107CFU。
[0019]优选地，以活菌体的数目计，相对于每份所述解淀粉芽胞杆菌，所述枯草芽胞杆菌的含量为0.05-0.2份，所述地衣芽胞杆菌的含量为0.05-0.2份。在该优选情况下，所述微生物菌剂具有更加优良的去除盐碱的能力。
[0020]根据本发明，所述培养基的种类可以在很大范围内改变，可以为各种能够用于培养解淀粉芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌的培养基，例如，可以为牛肉膏蛋白胨培养基、肉汤培养基、LB培养基等常`用培养基作为种子培养基，用于菌种的保存；而发酵的培养基一般用于生产，这些培养基的种类也为本领域技术人员所公知。上述培养基能够商购得到或者根据“微生物培养基手册”(Microbiology Culture Media Manual)的记载制备得到。例如，牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15-20g，蒸馏水1000ml, pH值7.0-7.2，121°C灭菌20min ;发酵培养基:葡萄糖15g，淀粉lg，豆饼粉25g，硫酸锰lg，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁0.5g，酵母膏0.2g，氯化铁0.1g,碳酸钙0.lg, pH值
7.0-7.2，115°C灭菌 20min。
[0021]其中，所述微生物菌剂的制备方法可以包括:将解淀粉芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌分别接种于培养基中进行培养。其中，可以在各自独立的培养体系中分别培养解淀粉芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌，并将分别培养得到的微生物按照比例混合。优选情况下，通过在各自独立的培养体系中的培养及培养后的混合，使得到的每克微生物菌剂的总活菌数为2-20X 107CFU。
[0022]根据本发明，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的培养方法没有特别的限制为本领域技术人员所公知，例如，可以先将枯草芽孢杆菌在种子培养基(LB培养基)中培养至菌密度0D_值为0.6-0.8，得到菌液，然后在100重量份的生产培养基(葡萄糖5g，豆柏30g，蛋白胨2g，蒸馏水1000ml, ρΗ7.0-7.2)中接种2-5重量份的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的菌液，37°C培养,直至枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的活菌数为2-20 X IO7个/克的培养基。
[0023]所述地衣芽孢杆菌(Bacillcus Iincheniformis)的培养方法没有特别的限制为本领域技术人员所公知，例如，可以先将地衣芽孢杆菌在种子培养基(LB培养基)中培养至菌密度OD6tltl值为0.6-0.8，得到菌液，然后在100重量份的培养基(玉米浆0.45g，蛋白胨1.50g，豆饼粉浸汁为1:15，葡萄糖1.50g，pH值7.5)中接种2_5重量份的地衣芽抱杆菌(Bacillcus Iincheniformis)的菌液，37 V培养，直至地衣芽抱杆菌(Bacillcuslincheniformis)的活菌数为2-20X 1O7个/克的培养基。
[0024]所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的培养方法没有特别的限制，例如，可以先将解淀粉芽孢杆菌在种子培养基(LB培养基)中培养至菌密度OD6tltl值为0.6-0.8，得到菌液，然后在100重量份培养基(豆饼粉50g，蔗糖20g，硫酸铵5g，柠檬酸三钠2.5g，磷酸二氢钾0.3g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.05g，pH7.0-7.2)中接种2_5重量份的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的菌液,37°C培养,直至解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的活菌数为 2-20X IO7 个 / 克的培养基。
[0025]通过在各自独立的培养体系中的培养及培养后按照比例的混合，所述混合的条件没有特别的限制，优选能够使得到的微生物菌剂满足以下条件:以活菌体的数目计，相对于每份所述解淀粉芽孢杆菌，所述枯草芽胞杆菌的含量为0.05-0.2份，所述地衣芽胞杆菌的含量为0.05-0.2份。
[0026]根据本发明，所述枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)和地衣芽胞杆菌(Bacilluslincheniformis)的菌种可以通过商购得到。例如,所述枯草芽胞杆菌购自中国农业微生物囷种保减中心且编号为ACCC03221，所述地衣牙胞杆囷购自中国农业微生物囷种保减中心且编号为ACCC02698。
[0027]本发明还提供了如上所述的解淀粉芽胞杆菌和如上所述的微生物菌剂在盐碱地改良中的应用。
[0028]其中，所述盐碱地土壤中Cl—的浓度可以为至少0.15mol/kg，pH值可以为8以上，本发明的解淀粉芽胞杆菌可以在具有0.15mol/kg以上Cl—浓度和8以上的pH值的盐碱地土壤中良好生长并起到降低Cl—的作用。
[0029]本发明还提供了如上所述的解淀粉芽胞杆菌和如上所述的微生物菌剂在增加植物耐旱性中的应用。
[0030]其中，所述植物可以为西瓜、甜瓜、黄瓜、番茄、辣椒、茄子、苜蓿、水稻、苹果、梨、葡萄、桃、杏或草莓等等。
[0031]本发明还提供了如上所述的解淀粉芽胞杆菌和如上所述的微生物菌剂在防治小麦纹枯病中的应用。
[0032]本发明还提供了如上所述的解淀粉芽胞杆菌和如上所述的微生物菌剂在防治黄瓜枯萎病中的应用。
[0033]以下通过实施例进一步详细说明本发明:
[0034]实施例1
[0035]本实施例用于说明本发明的解淀粉芽胞杆菌及其性能。
[0036]将保藏编号为CCTCC N0.M2013501的解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)接种到LB培养基(含胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaC110g/L)中，培养至菌密度0D_值为0.6-0.8，得到菌液。
[0037]在LB培养基中加入NaCl调整NaCl的浓度为220g/L，并且加入NaOH调整pH值为
9.5，得到盐碱胁迫培养基。
[0038]将3mL上述菌液加入盐碱胁迫培养基中，使起始OD6tltl为0.1，于30°C，180转每分下振荡培养，每隔4h取样测定发酵液中菌密度(OD6J。结果显示，发酵液第0、4、8、12、16、20、24小时的0D_分别为0.1,0.12,0.17、0.22、0.37、0.54。由此说明，保藏编号为CCTCCN0.M2013501的解淀粉芽胞杆菌能够在NaCl的浓度为220g/L且pH值为9.5的盐碱胁迫培
养基中良好生长。
[0039]在LB培养基中加入无水氯化钙调整氯化钙的浓度为0.5g/L，加入MgSO4调整MgSO4的浓度为30g/L，并将pH值调整为9.5，得到盐碱清除测试培养基。
[0040]将3mL上述菌液加入150mL的盐碱清除测试培养基中，于30°C，180转每分下振荡培养，隔24h后取样测定发酵液中Cl—的浓度和pH值，结果显示，Cl—的浓度下降了 21.2%，pH值下降为8.2， 证明保藏编号为CCTCC N0.M2013501的解淀粉芽胞杆菌具有优异的盐碱清除能力。
[0041]对比例I
[0042]将购自中国农业微生物菌种保藏中心且编号为ACCC01855的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)接种到LB培养基(含胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaC110g/L)中，培养至菌密度0D_值为0.6-0.8，得到菌液。
[0043]在LB培养基中加入NaCl调整NaCl的浓度为220g/L，并且加入NaOH调整pH值为9.5，得到盐碱胁迫培养基。
[0044]将3mL上述菌液加入盐碱胁迫培养基中，使起始OD6tltl为0.1，于30°C，180转每分下振荡培养，每隔4h取样测定发酵液中菌密度(OD6J。结果显示，发酵液第0、4、8、12、16、
20、24小时的OD6tltl分别为0.1,0.1,0.1,0.1,0.1,0.1。由此说明，购自中国农业微生物菌种保藏中心且编号为ACCC01855的解淀粉芽胞杆菌不能在NaCl的浓度为220g/L且pH值为9.5的盐碱胁迫培养基中生长。
[0045]在LB培养基中加入无水氯化钙调整氯化钙的浓度为0.5g/L，加入MgSO4调整MgSO4的浓度为30g/L，并将pH值调整为9.5，得到盐碱清除测试培养基。
[0046]将3mL上述菌液加入150mL的盐碱清除测试培养基中，于30°C，180转每分下振荡培养，隔24h后取样测定发酵液中Cl—的浓度和pH值，结果显示，Cl—的浓度下降了 1.5%，pH值下降为9.3，证明购自中国农业微生物菌种保藏中心且编号为ACCC01855的解淀粉芽胞杆菌基本不具有盐喊清除能力。
[0047]实施例2
[0048]本实施例用于说明本发明的微生物菌剂及其性能。
[0049](I)在100重量份的培养基(葡萄糖5g，豆柏30g，蛋白胨2g，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2)中接种5重量份的枯草芽胞杆菌菌液(购自中国农业微生物菌种保藏中心且编号为ACCC03221，在如上相同LB培养基中培养至菌密度OD6tltl值为0.6-0.8，得到菌液)，37°C培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至枯草芽胞杆菌的活菌数为2 X IO7CFU/克的培养基。
[0050](2)在100重量份的培养基(玉米浆0.45g，蛋白胨1.50g，豆饼粉浸汁为1:15，葡萄糖1.50g, pH值7.5)中接种5重量份的地衣芽胞杆菌菌液(购自中国农业微生物菌种保藏中心且编号为ACCC02698，在如上相同LB培养基中培养至菌密度0D_值为0.6-0.8，得到菌液)，37°C培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至地衣芽胞杆菌的活菌数为2X IO7CFU/克的培养基。
[0051](3)在100重量份的培养基(葡萄糖15g，淀粉lg，豆饼粉25g，硫酸锰lg，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁0.5g，酵母膏0.2g，氯化铁0.lg，碳酸钙0.lg，pH7.0-7.2)中接种5重量份的解淀粉芽胞杆菌菌液(保藏编号为CCTCCN0.M2013501，在如上相同LB培养基中培养至菌密度0D600值为0.6-0.8，得到菌液)，37°C培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至解淀粉芽胞杆菌的活菌数为2 X IO7CFU/克的培养基。
[0052](4)将步骤(1)至(3)中分别得到的枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌按照比例进行混合，混合比例使得到的微生物菌剂中，以活菌体的数目计，相对于每份所述解淀粉芽胞杆菌，所述枯草芽胞杆菌的含量为0.1份,所述地衣芽胞杆菌的含量为0.1份，得到本实施例的微生物菌剂。
[0053]实施例3
[0054]本实施例用于说明本发明的微生物菌剂及其性能。
[0055]按照实施例2的方法，将步骤(1)至(3)中分别得到的枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌按照比例进行混合，所不同的是，混合比例使得到的微生物菌剂中，以活菌体的数目计，相对于每份所述解淀粉芽胞杆菌，所述枯草芽胞杆菌的含量为0.2份，所述地衣芽胞杆菌的含量为0.5份， 得到本实施例的微生物菌剂。
[0056]实施例4
[0057]本实施例用于说明本发明的微生物菌剂及其性能。
[0058]按照实施例2的方法，将步骤(1)至(3)中分别得到的枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌按照比例进行混合，所不同的是，混合比例使得到的微生物菌剂中，以活菌体的数目计，相对于每份所述解淀粉芽胞杆菌，所述枯草芽胞杆菌的含量为0.2份，所述地衣芽胞杆菌的含量为0.05份，得到本实施例的微生物菌剂。
[0059]实施例5
[0060]本实施例用于说明本发明的微生物菌剂及其性能。
[0061]按照实施例2的方法，将步骤(1)至(3)中分别得到的枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌按照比例进行混合，所不同的是，混合比例使得到的微生物菌剂中，以活菌体的数目计，相对于每份所述解淀粉芽胞杆菌，所述枯草芽胞杆菌的含量为2份，所述地衣芽胞杆菌的含量为5份，得到本实施例的微生物菌剂。
[0062]实施例6
[0063]本实施例用于说明本发明的微生物菌剂及其性能。
[0064]按照实施例2的方法制备微生物菌剂，不同的是，将步骤(2)至(3)中分别得到的地衣芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌按照比例进行混合，但不加入枯草芽胞杆菌，得到本实施例的微生物菌剂。
[0065]对比例2
[0066]按照实施例2的方法制备微生物菌剂，不同的是，所用的解淀粉芽胞杆菌为购自中国农业微生物菌种保藏中心且编号为ACCC01855的解淀粉芽胞杆菌。[0067]测试实施例1
[0068]本测试实施例通过室外盆栽实验测定实施例2-6和对比例2的微生物菌剂在盐碱地改良中的效果。
[0069]室外盆栽使用的基质土壤购自北京花卉市场的花卉土，土壤有机质含量10.24g/kg、全氮 0.561g/kg、全磷 1.14g/kg、全钾 14.98g/kg、速效氮 39.19mg/kg、速效磷 16.26mg/kg、速效钾160.07mg/kg、pH6.5。并且，在基质土壤中添加NaCl溶液，使得Cl—的浓度为0.19mol/kg，添加NaOH，使得pH值为9.0，得到实验土壤。盆栽试验盆高21cm、上直径20cm、下直径13cm，每盆加土 3.8kg，分别加入实施例2-6和对比例2的微生物菌剂0.05kg。
[0070]在盆中种入紫花苜猜，当紫花苜蓿平均株高达到20cm时，按照《NY/Tl 121.17-2006 土壤检测第17部分:土壤氯离子含量的测定》中的方法测定土壤中的Cl_的浓度，并计算Cl—的去除率，结果如表1所示。
[0071]表1
[0072]
【权利要求】
1.一种解淀粉芽胞杆菌，其特征在于:该解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的保藏编号为 CCTCC N0.M2013501。
2.一种微生物菌剂，该微生物菌剂包含培养基和菌体，其特征在于:所述菌体包括保藏编号为CCTCC N0.M2013501的解淀粉芽胞杆菌，且所述菌体还包括枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)和地衣芽胞杆菌(Bacillus lincheniformis)。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于:每克所述微生物菌剂所含的总活菌数为 2-20X 107CFU。
4.根据权利要求2或3所述的微生物菌剂，其特征在于:以活菌体的数目计，相对于每份所述解淀粉芽胞杆菌，所述枯草芽胞杆菌的含量为0.05-0.2份，所述地衣芽胞杆菌的含量为0.05-0.2份。
5.根据权利要求2或3所述的微生物菌剂，其特征在于:所述培养基为牛肉膏蛋白胨培养基、肉汤培养基和LB培养基中的至少一种。
6.权利要求1所述的解淀粉芽胞杆菌和权利要求2-6中任意一项所述的微生物菌剂在盐碱地改良中的应用。
7.权利要求1所述的解淀粉芽胞杆菌和权利要求2-6中任意一项所述的微生物菌剂在增加植物耐旱性中的应用。
8.权利要求1所述的解淀 粉芽胞杆菌和权利要求2-6中任意一项所述的微生物菌剂在防治小麦纹枯病中的应用。
9.权利要求1所述的解淀粉芽胞杆菌和权利要求2-6中任意一项所述的微生物菌剂在防治黄瓜枯萎病中的应用。
【文档编号】C12N1/20GK103773711SQ201310628798
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2013年11月28日 优先权日:2013年11月28日
【发明者】阮志勇, 王彦伟, 宋金龙, 赵秉强, 李燕婷, 孔德龙, 刘艳伟, 王慧敏, 陈小蓉, 刘小飞 申请人:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所