人树突状细胞疫苗的制备方法
【专利摘要】本发明属于细胞免疫学【技术领域】，具体地说是一种人树突状细胞疫苗的制备方法。本发明包括如下步骤：(1)通过贴壁法从外周血单个核细胞中分离单核细胞；(2)使用DC培养基诱导单核细胞向DC分化并在第三天加入肿瘤抗原；(3)第五天加入IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ和Mtb-HAg组合型DC促成熟剂；(4)第6～7天进行DC的成熟度和IL-12分泌量检测。通过本发明所制备的DC，其应用主要为癌症病人的治疗或者癌症高危人群的预防。本发明的优点是制备的DC能够分泌大量的IL-12，从而促使T细胞向Th1型免疫应答方向分化，同时具有制备工艺简单、成本低廉、易于规模化生产等优势。
【专利说明】人树突状细胞疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞免疫学【技术领域】，具体地说是一种人树突状细胞疫苗的制备方法。
【背景技术】
[0002]树突状细胞(dendritic cell，DC)是目前所知功能最强的抗原递呈细胞(antigen-presenting cell, APC),最大特点是能够刺激初始型T细胞(naifve T cell)活化和增值，是特异性免疫应答的使动者。因此，DC在肿瘤免疫细胞治疗中有着广泛的应用前景。然而，DC在人外周血中的比例非常低，而且肿瘤患者体内DC的功能大多处于抑制状态。因此，如何获得足够数量并具有诱导T细胞向Thl型免疫应答方向分化为细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes, CTL)的DC,贝U成为临床应用的关键。
[0003]目前，DC常规的扩增方案很多，如经典的GM-CSF、IL_4诱导DC分化，然后用TNF-a或者组合细胞因子IL-1 β、IL-6、TNF- a、PGE-2等，或者联合聚肌胞苷酸(polyinosinic:polycytidylic acid,poly-1:C)、细菌脂多糖(bacterial lipopolysaccharide,LPS)等促进其成熟，然而上述促DC成熟剂仅能使成熟DC低水平分泌IL-12，而IL-12是DC促进T细胞向Thl型免疫应答方向分化的关键分子。因此，如何诱导DC成熟并分泌高水平的IL-12，对免疫细胞实施杀伤肿瘤细胞则起到核心作用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用于肿瘤免疫细胞治疗用树突状细胞疫苗的制备方法， 有效的培养出足量的、能够促进T细胞向Thl型免疫应答方向分化的DC。
[0005]1.为实现上述目的，设计人树突状细胞疫苗的制备方法，包括如下步骤:
[0006]I)从分离的外周血单核细胞中进一步分离并获取单核细胞；
[0007]2)诱导单核细胞向DC分化；
[0008]3)诱导已分化为未成熟DC的单核细胞成为成熟的DC ;在步骤3)诱导已分化为未成熟DC的单核细胞成为成熟DC的培养过程中，加入IL-1 β、IL-6、TNF-α，或者IL-1 β、IL-6、TNF- α与Mtb-HAg及IFN- Y中的一种或者两种的组合；
[0009]4)继续培养1-2天，进行DC成熟度和IL-12含量检测。
[0010]作为优选，所述步骤3)中，加入的IL-1 β终浓度为8-15ng/mL，IL-6终浓度为50-150ng/mL, TNF- α 终浓度为 8_15ng/mL，Mtb-Hag 终浓度为 5 ~10 μ g/ml, IFN- Y 终浓度为 100 ~1000IU/ml。
[0011]进一步地，所述步骤3)中，加入的IL-1 β终浓度为10ng/mL，IL-6终浓度为100ng/mL, TNF- α 终浓度为 10ng/mL，Mtb-Hag 终浓度为 8 μ g/ml, IFN- Y 终浓度为 1000IU/ml 。
[0012]作为优选，所述步骤I)具体为釆用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心法获得外周血单个核细胞，然后将外周血单个核细胞重悬于PAA?培养基、GT-T551?培养基、Opt1-MEM?培养基的任意一种培养基中，调整细胞密度为(5~10) X 106/ml，进行贴壁培养l_2h，轻轻晃动培养瓶，使未贴壁细胞重新悬浮，然后吸弃悬浮的未贴壁细胞；补加培养基，轻轻晃动培养瓶，使未贴壁细胞重新悬浮，然后吸弃悬浮的未贴壁细胞，重复I~2次；获得贴壁细胞即为单核细胞。
[0013] 作为优选，所述步骤2)将有8-10 %自体血浆、800-1000IU/ml GM-CSF,800-1000IU/ml IL-4的X-VIV0-15?培养基或者AIM-V?培养基加入步骤I中获得单核细胞培养瓶内，继续培养2-3天；更换新鲜培养基，并在更换的培养基内添加I~20 μ g/ml的肿瘤抗原。
[0014]作为优选，所述步骤2)具体为:
[0015]a):将 20ml 含有 10% 自体血浆、800IU/ml GM-CSF、1000IU/ml IL-4 的 X-VIVO-15?培养基或者AIM-V?培养基加入步骤I中获得单核细胞的培养瓶内，然后置于37°C、5% C02和饱和湿度的培养箱内培养；
[0016]b):第三天(72h)，吸弃IOml培养瓶内的培养基，并补加IOml新鲜的含有10%自体血浆、800IU/ml GM-CSF、1000IU/ml IL-4U0y g/ml 的肿瘤抗原的 X-VIV0-15? 培养基或者AIM-V?培养基；
[0017]作为优选，所述步骤4) DC成熟度的检测方法为流式细胞术，IL-12含量检测方法为 ELISA。
[0018]步骤(2)中的肿瘤抗原包括CD19、CD20、WT-UMUCl、LMP2、HPV E6E7、EGFRvII1、HER-2/neu,Idiotype,MAGE A3、p53、NY_ES0_l、PSMA、⑶2、CEA、MelanA/MARTl、Ras mutant、gplOO、p53mutant、Proteinase3、bcr—abl、Tyrosinase、Surviving PSA、hTERT、Sarcoma、EphA2、PAP、ML-1AP, AFP、EpCAM、ERG、NA17、PAX3、ALK, Androgen receptor, Cyclin B1、Polysialic acid、MYCN、RhoC, TRP-2、⑶3、Fucosyl GMU Mesothelin、PSCA、MAGE Al、sLe (animal)、CYPlBU PLACU GM3、BORIS、Tn等。上述的肿瘤抗原所针对的肿瘤细胞包括B淋巴细胞肿瘤细胞、白血病细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、结直肠癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞和宫颈癌细胞等。利用本发明所述的方法制备的成熟DC主要用于癌症病人的治疗或者癌症高危人群的预防。
[0019]本发明所用的原料和试剂除有特殊说明外，均市售可得。
[0020]本发明同现有技术相比:从有限的PBMCs中能够获取足够数量的成熟的DC，相比于其他促成熟剂，本发明所制备的DC能够分泌大量的IL-12，从而促使T细胞向Thl型免疫应答方向分化。此外，该技术相比转基因修饰的DC技术，工艺简单、成本低廉、而且更容易规模化生产等优势。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1流式细胞术检测不同组合DC促成熟剂诱导DC成熟第7天成熟度检测(η =8);第一列至第四列分别代表DC表面分子⑶80、⑶83、⑶86和HLA-DR，第一行至第四行分别代表 IL-1 β、IL-6、TNF- α、PGE2, IL-1 β、IL-6, TNF- α、IFN- y，IL-1 β、IL-6, TNF- α、Mtb-HAg 和 IL-1 β、IL-6、TNF- α、IFN- y、Mtb-HAg 等不同组合 DC 促成熟剂。
[0022]图2不同组合DC促成熟剂对DC产生IL-12的影响(n = 8) ；IFN- Y和Mtb-HAg对DC产生IL-12均有促进作用，特别是两者与IL-1 β、IL-6和TNF- α进行组合诱导促进DC分泌IL-12的量不低于IL-1 β、IL-6、TNF- α和PGE2组合诱导的1000倍。
【具体实施方式】
[0023]下面用实例来具体说明本发明，但本发明并不受其限制。下面实例中凡未注明具体条件的实验方法，均为遵照常规方法和厂家提供的操作说明执行。
[0024]实施例1人树突状细胞疫苗的制备及成熟度和IL-12分泌量的检测
[0025]第一步:从分离获得的PBMCs中进一步分离并获取单核细胞，包括以下步骤:
[0026](I)采集患者外周静脉血50ml，经聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心获得单个核细胞。具体步骤为:1500转/分，离心10分钟，吸取上层血浆层，56°C灭活30分钟后离心备用，用生理盐水对倍稀释沉淀的血细胞，人淋巴细胞分离液与稀释血液按1: 2的比例加入离心管中，2000转/分，离心20分钟，小心吸取白膜层，用生理盐水洗涤2次，转速分别为1600转/分，1300转/分，均离心7分钟，即得到外周血单个核细胞。
[0027](2)将上述分离的PBMCs重悬于PAA?培养基、GT-T551?培养基、Opt1-MEM?培养基的任意一种培养基中，调整细胞密度为(5~10) X 106/ml，总体积为IOml加入T75ml的细胞培养瓶内，于37°C、5% C02和饱和湿度的培养箱内贴壁2h。
[0028](3)轻轻晃动培养瓶，使未贴壁细胞重新悬浮，然后吸弃悬浮的未贴壁细胞；补加lOmlPAA?培养基、GT-T551?培养基、Opt1-MEM?培养基的任意一种培养基，轻轻晃动培养瓶，使未贴壁细胞重新悬浮，然后吸弃悬浮的未贴壁细胞，该步骤重复I~2次，则留下的贴壁细胞即为单核细胞。
[0029]第二步:诱导单核细胞向DC分化，包括以下步骤:
[0030](I)将 20ml 含有 10% 自体血浆、800IU/ml GM-CSF、1000IU/ml IL-4 的 X-VIV0-15?培养基或者AM-V?培养基加入上述T75的培养瓶内，然后置于37°C、5% C02和饱和湿度的培养箱内培养。
[0031](2)第三天(72h)后吸弃IOml培养瓶内的培养基，并补加IOml新鲜的含有10%自体血浆、800IU/ml GM-CSF、1000IU/ml IL-4U0y g/ml 的肿瘤抗原的 X-VIV0-15?培养基或者AIM-V?培养基。
[0032]第三步:诱导已向DC分化的单核细胞成为成熟的DC，包括以下步骤:
[0033]在细胞培养的第五天，加入IL-1 β (10ng/mL), IL-6 (100ng/mL)，TNF-a (lOng/mL)，Mtb-HAg 终浓度为 8 μ g/ml, IFN- Y 终浓度为 1000IU/ml。
[0034]第四步:进行成熟度和IL-12分泌量的检测
[0035]细胞培养的第6~7天，分别通过流式细胞术和ELISA进行DC的成熟度和IL-12分泌量检测。
[0036]本发明相对原有培养基培养出的DC成熟度不高和IL-12分泌不足的情况下，其成熟度和IL-12的分泌均较高。参见图1和图2。
【权利要求】
1.人树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，包括步骤:1)从分离的外周血单核细胞中进一步分离并获取单核细胞；2)诱导单核细胞向DC分化；3)诱导已分化为未成熟DC的单核细胞成为成熟的DC;在步骤3)诱导已分化为未成熟DC的单核细胞成为成熟DC的培养过程中，加入IL-1 β、IL-6、TNF-α，或者IL-1 β、IL-6、TNF- α与Mtb-HAg及IFN- Y中的一种或者两种的组合； 4)继续培养1-2天，进行DC成熟度和IL-12含量检测。
2.如权利要求1所述的人树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于:所述步骤3)中，加入的IL-1 β终浓度为8-15ng/mL，IL-6终浓度为50_150ng/mL，TNF- α终浓度为8_15ng/mL, Mtb-Hag 终浓度为 5 ~10 μ g/ml, IFN- Y 终浓度为 100 ~1000IU/ml。
3.如权利要求1或2所述的人树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于:所述步骤3)中，加入的IL-1 β终浓度为10ng/mL, IL-6终浓度为100ng/mL，TNF-α终浓度为10ng/mL,Mtb-Hag 终浓度为 8 μ g/ml, IFN- Y 终浓度为 1000IU/ml。
4.根据权利要求1或2所述树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤I)具体为采用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心法获得外周血单个核细胞，然后将外周血单个核细胞重悬于PAA?培养基、GT-T551?培养基、Opt1-ΜΕΜ?培养基的任意一种培养基中，调整细胞密度为(5~10) X106/ml，进行贴壁培养l_2h，轻轻晃动培养瓶，使未贴壁细胞重新悬浮，然后吸弃悬浮的未贴壁细胞；补加培养基，轻轻晃动培养瓶，使未贴壁细胞重新悬浮，然后吸弃悬浮的未贴壁细胞，重复I~2次；获得贴壁细胞即为单核细胞。
5.根据权利要求1或2所述树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤2)将有 8-10% 自体血浆、800-1000IU/ml GM-CSF、800_1000IU/ml IL-4 的 X-VIV0-15?培养基或者AIM-V?培养基加入步骤I中获得单核细胞培养瓶内，继续培养2-3天；更换新鲜培养基，并在更换的培养基内添加I~20 μ g/ml的肿瘤抗原。
6.根据权利要求5所述树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤2)具体为:a):将20ml 含有 10% 自体血浆、800IU/ml GM-CSF、1000IU/ml IL-4 的 X-VIV0-15? 培养基或者AIM-V?培养基加入步骤I中获得单核细胞的培养瓶内，然后置于37°C、5% C02和饱和湿度的培养箱内培养；b):第三天(72h)，吸弃IOml培养瓶内的培养基，并补加IOml新鲜的含有10%自体血浆、800IU/ml GM-CSF、1000IU/ml IL-4U0y g/ml 的肿瘤抗原的 X-VIV0-15? 培养基或者AIM-V?培养基。
7.根据权利要求1所述树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤4)DC成熟度的检测方法为流式细胞术，IL-12含量检测方法为ELISA。
【文档编号】C12N5/0784GK103599528SQ201310638796
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年12月4日 优先权日:2013年12月4日
【发明者】马飞, 王宇环, 罗晓玲 申请人:深圳市合一康生物科技有限公司