一种菜豆普通花叶病毒的逆转录环介导等温检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种菜豆普通花叶病毒的逆转录环介导等温检测方法。本发明公开的一组引物，由如下（1）-（4）所示的DNA分子组成：（1）SEQ?ID?No.1所示的DNA分子；（2）SEQ?ID?No.2所示的DNA分子；（3）SEQ?ID?No.3所示的DNA分子；（4）SEQ?ID?No.4所示的DNA分子。本发明建立的一种快速、灵敏、高度特异的检测菜豆花叶病毒的方法，为该病毒的快速检测提供了新的手段。
【专利说明】一种菜豆普通花叶病毒的逆转录环介导等温检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种菜豆普通花叶病毒的逆转录环介导等温检测方法。
【背景技术】
[0002]菜普通花叶病毒(Bean common mosaic virus, BCMV)是马铃暮Y病毒属Potyvirus的成员之一,在全世界广泛分布,是菜豆上最主要的病毒病害之一。BCMV是一种典型的种传病毒，几乎可以侵染所有的食用豆作物，在菜豆上种传率高达93%。BCMV侵染菜豆后引起叶片变窄、卷曲、皱缩、花叶、豆荚斑驳或畸形等，造成严重的产量损失。
[0003]环介导等温核酸扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)最早是由Notomi T等在2000年发明的，是一种基于高灵敏链置换技术的等温核酸扩增方法，其工作原理为:针对靶基因的6个区域设计了 4个特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶-Bst (Bacillus stearothermophilus) DNA polymerase 在恒温(65°C )的条件下反应 I小时即可完成核酸扩增反应，反应产物既可通过电泳紫外观察，亦可通过荧光染色直接目测。该方法操作简便，无需特殊仪器(PCR仪)，而检测结果准确，是一种快捷而有效的检测方法。目前已广泛应用于人类和动植物各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测和快速诊断。该方法应用范围广泛，适于基层实验室进行快速检测。[0004]目前在菜豆普通花叶病毒的检测上，较常用的方法有两种:一种是分子生物学检测方法，其中以PCR最为常见，但是PCR需要30-35个循环反应，较费时并且需要特殊的仪器(PCR仪)、操作程序繁琐复杂、时间长，对检测人员较高的技术要求，大大限制了作为快速诊断方法的使用和推广；另一种是血清学检测方法，常见的有ELISA，血清学检测方法除了在灵敏度上存在不足外，其检测的特异性也受到限制。而LAMP方法很好的克服了当前这两类方法的不足，LAMP检测方法具有反应时间短，无需特殊仪器(恒温金属浴即可)，成本低，检测灵敏度高，特异性好，目前尚未见利用LAMP技术检测菜豆普通花叶病毒的报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种菜豆普通花叶病毒的逆转录环介导等温检测方法。
[0006]本发明提供的一组引物，由如下(I)- (4)所示的DNA分子组成:
[0007](I) SEQ ID N0.1 所示的 DNA 分子；
[0008](2) SEQ ID N0.2 所示的 DNA 分子；
[0009](3) SEQ ID N0.3 所示的 DNA 分子；
[0010](4) SEQ ID N0.4 所示的 DNA 分子。
[0011]一种检测菜豆普通花叶病毒的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包含所述的引物、反转录酶和Bst DNA聚合酶；
[0012]所述反转录酶为M-MLV反转录酶或AMV反转录酶。
[0013]一种检测菜豆普通花叶病毒的方法也属于本发明的保护范围，该方法是以待测样品的总RNA为模板，以所述引物为引物进行逆转录环介导等温核酸扩增，若得到逆转录环介导等温核酸扩增产物，则所述待测样品中候选含有菜豆普通花叶病毒，若得不到逆转录环介导等温核酸扩增产物，则所述待测样品中候选不含有菜豆普通花叶病毒。
[0014]上述方法中，所述PCR扩增产物是否得到的判断方法为如下(I)和/或(2):
[0015](I)将逆转录环介导等温核酸扩增反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，具有弥散状核酸电泳条带的待测样品为含有菜豆普通花叶病毒的样品，不具有弥散状核酸电泳条带的待测样品为不含有菜豆普通花叶病毒的样品；
[0016](2)将逆转录环介导等温核酸扩增反应产物与SYBR Green I反应得反应液，反应液呈翠绿色的待测样品候选为含有菜豆普通花叶病毒的样品，反应液呈橙色的待测样品候选为不含有菜豆普通花叶病毒的样品。
[0017]上述任一所述的方法中，所述引物中SEQ ID N0.1所示的DNA分子和SEQ ID N0.2所示的DNA分子为外引物，SEQ ID N0.3所示的DNA分子和SEQ ID N0.4所示的DNA分子为内引物；
[0018]所述外引物中SEQ ID N0.1所示的DNA分子与SEQ ID N0.2所示的DNA分子在所述逆转录环介导等温核酸扩增中的摩尔浓度比为1:1 ；
[0019]所述内引物中SEQ ID N0.3所示的DNA分子与SEQ ID N0.4所示的DNA分子在所述逆转录环介导等温核酸扩增中的摩尔浓度比为1:1。
[0020]所述外引物与所述内弓丨物在所述逆转录环介导等温核酸扩增中的摩尔浓度比具体为1:5。
[0021]上述任一所述的方法中，所述逆转录环介导等温核酸扩增中的反应温度为62°C。
[0022]上述任一所述的方·法中，所述逆转录环介导等温核酸扩增中的镁离子浓度为5mM。
[0023]上述任一所述的方法中，所述逆转录环介导等温核酸扩增的体系如下:
[0024]IOXThermopol buffer2.5 u L, SEQ ID N0.1 所示的 DNA 分子 0.2 y M，SEQ ID N0.2所示的DNA分子0.2 ii M，SEQ ID N0.3所示的DNA分子1.0 y M，SEQ ID N0.4所示的DNA分子1.0 ii M，dNTPsl.0mM, MgC125mM,反转录酶200U，Bst DNA聚合酶12U，所述待测样品的总RNA40ng,余量为 ddH20，体系 25 y L ;
[0025]所述IOXThermopol buffer购自纽英伦生物技术(北京)有限公司，产品目录号为 M0275 ；
[0026]所述反转录酶为M-MLV反转录酶或AMV反转录酶；
[0027]所述Bst DNA聚合酶的商品名称为Bst DNApolymerase,购自纽英伦生物技术(北京)有限公司，产品目录号为M0275 ;
[0028]所述逆转录环介导等温核酸扩增的反应条件为:62°C等温Ih ；80°C 5min。
[0029]上述任一所述的方法中，所述M-MLV反转录酶购自TaKaRa公司，产品目录号为2641A ；
[0030]所述样品具体为待测样品的叶片。
[0031]上述引物在检测菜豆普通花叶病毒中的应用也属于本发明的保护范围；
[0032]和/ 或，
[0033]上述试剂盒在检测菜豆普通花叶病毒中的应用也属于本发明的保护范围。
[0034]本发明建立了一种快速、灵敏、高度特异的检测菜豆普通花叶病毒的方法，为该病毒的快速检测提供了新的手段。【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1为RT-LAMP方法检测菜豆普通花叶病毒的引物筛选电泳结果。
[0036]图2为RT-LAMP方法检测菜豆普通花叶病毒的引物筛选荧光染色结果。
[0037]图3为RT-LAMP反应体系优化结果电泳检测。
[0038]图4为RT-LAMP反应体系优化结果荧光染色检测。
[0039]图5为电泳分析RT-LAMP方法检测菜豆普通花叶病毒的特异性和稳定性。
[0040]图6为荧光染色分析RT-LAMP方法检测菜豆普通花叶病毒的特异性和稳定性。
[0041]图7为电泳分析RT-LAMP方法检测菜豆普通花叶病毒的灵敏性。
[0042]图8为荧光染色分析RT-LAMP方法检测菜豆普通花叶病毒的灵敏性。
【具体实施方式】
[0043]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0044]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0045]未感染任何病毒的大豆和感染菜豆普通花叶病毒的大豆、菜豆和扁豆、未感染任何病毒的菜豆、感染CMV (黄瓜花叶病毒)的菜豆和感染TMV (烟草花叶病毒)的番茄均采自中国泰安，采集样品保存于_80°C冰箱中。
[0046]Bst DNApolymerase购自纽英伦生物技术(北京)有限公司，产品目录号为M0275。
[0047]M-MLV反转录酶购自TaKaRa公司，产品目录号为2641A。
[0048]dNTPs购自TaKaRa公司，产品目录号为4019。
[0049]SYBR Green I 购自 Invitrogen 公司。
[0050]IOXThermopol buffer购自纽英伦生物技术(北京)有限公司，产品目录号为M0275。
[0051]实施例1、菜豆普通花叶病毒的逆转录环介导等温扩增检测方法
[0052]一、引物设计:
[0053] 根据NCBI上已报道的菜豆普通花叶病毒核酸序列，利用LAMP引物设计软件PrimerExplorer V4设计7套特异引物，引物序列如下:
[0054]第一组引物:
[0055]F3:5， -ACGGATTGCTTCGGAATT-3，；
[0056]B3:5’ -GCCTCTCAGTATTTTCGCTG-3’ ；
[0057]FIP: 5 ’ -TCCGATGTTTTGGATGTCACC-GGGATAAAAATCTAGCTCGCT-3，；
[0058]BIP: 5，-TCGAGCCAGAGAAGCAGTAG-TACCATCAAGTCCAAACAACT-3，。
[0059]第二组引物:
[0060]F3:5， -GCATACATTGAGATGAGAAATTCC-3，；
[0061]B3:5， -CATTACCATCAAGTCCAAACA-3，；
[0062]FIP:5’ -GTAGCGAGCTAGATTTTTATCCCTC-AGAAACCGTACATGCCTAG-3’ ；
[0063]BIP:5，-GAGGTGACATCCAAAACATCGGAT-CTTGCTGCTAACGTTGCT-3，。
[0064]第三组引物:
[0065]F3:5， -ACAAGGATGTGAACGCAG-3，；[0066]B3:5’ -CATTGTACCACATTTCAAACTG-3’ ；
[0067]FIP:5’ -CACCATGGGCAAGTTCATCC-GCTCCAAAGGGAAGGTTG-3’ ；
[0068]BIP:5’ -TAGACCATCTATTGGATTACAAGCC-CATCTTTGTTGCTCTTGTGTT-3’。
[0069]第四组引物:
[0070]F3:5，-TCATGCACCATTTCTCAGA-3，；(SEQ ID N0.1)
[0071]B3:5’ -ACAACTTGCTGCTAACGT-3，；(SEQ ID N0.2)
[0072]FIP: 5 ’ -CCTCAAATTCCGAAGCAATCCG-CATTGAGATGAGAAATTCCGAG-3，；(SEQ IDN0.3)
[0073]BIP:5’-TCGCTACGCTTTTGATTTCTATGA-CTGCTGCCTTCATCTGTG-3’。(SEQ ID N0.4)
[0074]第五组引物:
[0075]F3:5， -CCAAAGGGAAGGTTGTCC-3，；
[0076]B3:5’ -CATTACAATTGACATTTGTGCA-3’ ；
[0077]FIP: 5 ’ -GGCTTGTAATCCAATAGATGGTCTA-TCAAAAGATCACAAAAAGGATGA-3，；
[0078]BIP: 5，-TTAACACAAGAGCAACAAAGATGC-CTCATACTCGCCCTTCAC-3，。
[0079]第六组引物:
[0080]F3:5， -CACGGCTTCAAAAGATCAC-3，；
[0081]B3:5’ -GCCATTCATTACAATTGACATT-3’ ；
[0082]FIP:5’ -GGCTTGTAATCCAATAGATGGTCTA-AAAAAGGATGAACTTGCCCA-3’ ；
[0083]BIP:5，-TTAACACAAGAGCAACAAAGATGC-CTCATACTCGCCCTTCAC-3，。
[0084]第七组引物:
[0085]F3:5， -ATTTGAGGGATAAAAATCTAGCT-3，；
[0086]B3:5’ -TGTGCATGTTTTGATTGACG-3’ ；
[0087]FIP:5’ -ACTGCTTCTCTGGCTCGATC-CTACGCTTTTGATTTCTATGAGG-3’ ；
[0088]BIP:5’ -TCAGCAACGTTAGCAGCAAG-AGTATTTTCGCTGGTTGTTG-3’。
[0089]二、提取感染菜豆普通花叶病毒的大豆叶片的总RNA为实验组，同时提取未感染任何病毒的大豆叶片的总RNA为阴性对照组。
[0090]三、逆转录环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)反应
[0091]反应体系如下:
[0092]IOXThermopol buffer2.5 u L (20mM Tris-HCl，IOmM KCl，2mM MgSO4,IOmM(NH4)2SO4,体积百分含量0.1%的Triton X-100),浓度为10 y M的引物F3和B3各 0.5 ii L，浓度为 10 ii M 的引物 FIP 和 BIP 各 2.0 ii L，浓度为 IOmM 的 dNTPs2.5 u L,浓度为 25mM 的 MgCl23 ii L，200U/ii L M-MLV 反转录酶 I ii L，8000U/mL 的 Bst DNApolymerasel.5 u L, 20ng/ u L 的模板 RNA2.0yL, ddH20 补足体系至 25 u L。
[0093]反应条件:62°C恒温 Ih ；80°C 5min。
[0094]模板RNA分别为步骤二提取的实验组或阴性对照组的总RNA。
[0095]经过上述反应得到实验组和阴性对照组的RT-LAMP反应产物。
[0096]四、RT- LAMP反应产物的检测
[0097](一)电泳检测:分别取5ii L实验组和阴性对照组的RT-LAMP反应产物经1.5%琼脂糖凝胶在0.5 X TBE缓冲液和155V电压条件下电泳25min，将凝胶在0.5 u g/mL的溴化乙锭(EB)中染色lOmin，染色后置于凝胶成像系统中观察。[0098]结果如图1所示。
[0099]图1中，M:Trans2K Plus DNA Marker, 1-7依次为7组引物检测感染菜豆普通花叶病毒的大豆的RT-LAMP反应产物，8-14依次为7组引物检测未感染任何病毒的大豆(阴性对照组)的RT-LAMP反应产物。
[0100]图1表明，在以感染菜豆普通花叶病毒的大豆叶片的总RNA为模板的7组引物中，可以观察到第4组引物的RT-LAMP反应产物呈弥散状的核酸泳带，而其余6组引物的RT-LAMP反应产物没有弥散状核酸电泳带，在以未感染任何病毒的大豆叶片的总RNA为模板的7组引物的RT-LAMP反应产物中均无核酸电泳条带。
[0101](二)荧光染色检测:分别向20 ii L体积实验组和阴性对照组的RT-LAMP反应产物中加入 2.5 ill SYBR Green 1(1: 1000) (1:1000 是指按 I y L SYBR Green I 加入 999uLddH20的比例对SYBR Green I稀释)，染色5min后观察结果。
[0102]结果如图2所示。
[0103]图2中，1-7依次为7组引物检测感染菜豆普通花叶病毒的大豆的RT-LAMP反应产物的荧光染色结果，8-14依次为7组引物检测未感染任何病毒的大豆的RT-LAMP反应产物(阴性对照组)的荧光染色结果。
[0104]图2表明，在以感染菜豆普通花叶病毒的大豆叶片的总RNA为模板的7组引物中，可以观察到第4组引物的RT-LAMP反应产物染色后呈翠绿色，反应为阳性，而其余6组引物的RT-LAMP反应产物以及以未感染任何病毒的大豆叶片的总RNA为模板的7组引物的RT-LAMP反应产物保持染 料的橙色，反应为阴性。
[0105]实施例2、RT-LAMP检测体系的优化
[0106]通过实例I可以筛选出最优的引物为第四组引物，但是第四组引物的核酸电泳条带不是十分明显，所以通过对构建体系的主要影响的两个因素Mg2+浓度和内外引物浓度比筛选，确定最优检测体系。
[0107]反应体系(25iiL)如下:
[0108]A: 10 X Thermopol buffer2.5 u L (20mM Tri s-HCl, IOmM KCl，2mM MgSO4,IOmM (NH4) 2S04,体积百分含量0.1%的Triton X-100 )，第四组引物中引物(F3和B3 )均为 0.2 iiM，第四组引物中引物(FIP 和 BIP)均为 1.0ii M，dNTPs 1.0mM, MgCl25mM, 200U/U L M-MLV 反转录酶 1.0 ii L，8000U/mL 的 Bst DNApolymerasel.5 u L, 20ng/ ii L 的模板RNA2.0uL, ddH20 补足体系至 25 y L ;
[0109]B: 10 X Thermopol buffer2.5 u L (20mM Tri s-HCl, IOmM KCl，2mM MgSO4,IOmM(NH4)2SO4，体积百分含量0.1%的Triton X-100)，第四组引物中引物(F3和B3)均为
0.2uM,第四组引物中引物(FIP 和 BIP)均为 0.8iiM，dNTPs 1.0mM, MgCl23mM, 200U/ u LM-MLV1.0u L, 8000U/mL 的 Bst DNApolymerasel.5 u L, 20ng/ u L 的模板 RNA2.0 u L, ddH20补足体系至25 u L ；
[0110]C: 10 X Thermopol buffer2.5 u L (20mM Tri s-HCl, IOmM KCl，2mM MgSO4,IOmM(NH4)2SO4，体积百分含量0.1%的Triton X-100)，第四组引物中引物(F3和B3)均为
0.2uM,第四组引物中引物(FIP 和 BIP)均为 0.8iiM，dNTPs 1.0mM, MgCl24mM, 200U/ u LM-MLV1.0u L, 8000U/mL 的 Bst DNApolymerasel.5 u L, 20ng/ u L 的模板 RNA2.0 u L, ddH20补足体系至25 u L ；[0111]D:10 X Thermopol buffer2.5 u L (20mM Tri s-HCl, IOmM KCl，2mM MgSO4,IOmM(NH4)2SO4，体积百分含量0.1%的Triton X-100)，第四组引物中引物(F3和B3)均为0.2iiM，第四组引物中引物(FIP 和 BIP)均为 1.2iiM，dNTPsl.0mM, MgCl24mM, 200U/ u LM-MLV1.0u L, 8000U/mL 的 Bst DNApolymerasel.5 u L, 20ng/ u L 的模板 RNA2.0 u L, ddH20补足体系至25 u L0
[0112]反应条件:62°C恒温 Ih ；80°C 5min。
[0113]提取感染菜豆普通花叶病毒的大豆叶片的总RNA为实验组，同时提取未感染任何病毒的大豆叶片的总RNA为阴性对照组，以各样品的RNA为模板分别进行上述反应，得到RT-LAMP反应产物。
[0114]RT-LAMP反应产物的检测如实施例1中步骤四。
[0115]电泳检测结果如图3所示。
[0116]图3中，M:Trans2K Plus DNA Marker, 1-4依次为以感染菜普通花叶病毒的大豆的总RNA为模板，在A、B、C和D的体系中进行RT-LAMP反应的产物；5_8依次为以未感染任何病毒的大豆(阴性对照组)的总RNA为模板，在A、B、C和D的体系中进行RT-LAMP反应的产物。
[0117]图3表明，以感染菜豆普通花叶病毒的大豆的总RNA为模板的A体系得到的RT-LAMP反应产物呈明亮的弥散状核酸电泳带，B、D体系的RT-LAMP反应产物的核酸电泳带弥散状不明显，C体系的RT-LAMP反应产物呈明亮的弥散状核酸电泳带但稍弱于A体系，阴性对照组中均无核酸电泳带。
[0118]荧光染色检测结果如图4所示。
[0119]图4中，1-4依次为以感染菜豆普通花叶病毒的大豆的总RNA为模板，在A、B、C和D的体系中进行RT-LAMP反应的产物的荧光染色结果，5-8依次为以未感染任何病毒的大豆(阴性对照组)的总RNA为模板，在A、B、C和D的体系中进行RT-LAMP反应的产物的荧光染
色结果。
[0120]图4表明，以感染菜豆普通花叶病毒的大豆的总RNA为模板，在A、B、C和D的体系中进行RT-LAMP反应的产物的荧光染色结果均呈现翠绿色，反应为阳性，以未感染任何病毒的大豆(阴性对照组)的总RNA为模板，在A、B、C和D的体系中进行RT-LAMP反应产物的荧光染色结果均呈橙色，反应为阴性。
[0121]以上结果说明A体系为最优体系。
[0122]实施例3、RT-LAMP方法检测菜豆普通花叶病毒的特异性和稳定性
[0123]提取感染菜豆普通花叶病毒的大豆、感染菜豆普通花叶病毒的扁豆、感染菜豆普通花叶病毒的菜豆的叶片的总RNA，同时提取感染CMV(黄瓜花叶病毒)的菜豆、感染TMV(烟草花叶病毒)的番茄和未感染任何病毒的菜豆(阴性对照组)叶片的总RNA，按实施例2的方法采用A体系对各组样品进行RT-LAMP反应。
[0124]电泳检测结果如图5所示。
[0125]图5中,M:Trans2K Plus DNA Marker ;泳道I为感染菜豆普通花叶病毒的大豆组的RT-LAMP反应产物；泳道2为感染菜豆普通花叶病毒的扁豆组的RT-LAMP反应产物；泳道3为感染菜豆普通花叶病毒的菜豆组的RT-LAMP反应产物；泳道4为感染CMV (黄瓜花叶病毒)的菜豆组的RT-LAMP反应产物；泳道5为感染TMV (烟草花叶病毒)的番茄组的RT-LAMP反应产物；泳道6为阴性对照组的RT-LAMP反应产物。
[0126]图5表明，感染菜豆普通花叶病毒的样品的RT-LAMP反应产物均可以观察到明亮的呈弥散状的核酸泳带，而未感染菜豆普通花叶病毒的样品的RT-LAMP反应产物均没有核酸电泳条带。
[0127]荧光染色检测结果如图6所示。
[0128]图6中，I为感染菜豆普通花叶病毒的大豆组的RT-LAMP反应产物荧光染色结果；2为感染菜豆普通花叶病毒的扁豆组的RT-LAMP反应产物荧光染色结果；3为感染菜豆普通花叶病毒的菜豆组的RT-LAMP反应产物荧光染色结果；4为感染CMV (黄瓜花叶病毒)的菜豆组的RT-LAMP反应产物荧光染色结果；5为感染TMV(烟草花叶病毒)的番茄组的RT-LAMP反应产物荧光染色结果；6为阴性对照组的RT-LAMP反应产物荧光染色结果。
[0129]图6表明，感染菜豆普通花叶病毒的样品的RT-LAMP反应产物荧光染色结果均呈现翠绿色，反应为阳性，其他未感染菜豆普通花叶病毒的样品的RT-LAMP反应产物荧光染色结果均呈橙色，反应为阴性。
[0130]结果表明，按照实施例2的方法采用A体系能够特异、稳定地检测菜豆普通花叶病毒，与其它病毒无交叉反应。
[0131]实施例4、RT-LAMP方法检测菜豆普通花叶病毒的灵敏性
[0132]提取感染菜豆普通花叶病毒的大豆叶片的总RNA，RNA浓度为20ng/ii L，用ddH20溶液将提取的RNA作IO1-1O8的倍比稀释，制成不同浓度的RNA。按照实施例2的方法采用A体系对各浓度的RNA以及ddH20 (作为空白对照)进行RT-LAMP反应。
[0133]电泳检测结果如图7所示。
[0134]图7中，M:Trans2K Plus DNA Marker ;泳道I为10倍稀释组；泳道2为IO2倍稀释组；泳道3为IO3倍稀释组；泳道4为IO4倍稀释组；泳道5为IO5倍稀释组；泳道6为IO6倍稀释组；泳道7为IO7倍稀释组；泳道8为IO8倍稀释组；泳道9为空白对照组。
[0135]图7表明，以各稀释度的感染菜豆普通花叶病毒的大豆的RNA为模板进行RT-LAMP反应的产物均可以观察到明亮的呈弥散状的核酸泳带，而空白对照组没有核酸电泳条带。
[0136]荧光染色检测结果如图8所示。
[0137]图8中，1为10倍稀释组；2为IO2倍稀释组；3为103倍稀释组；4为IO4倍稀释组；5为IO5倍稀释组；6为IO6倍稀释组；7为IO7倍稀释组；8为1O8倍稀释组；9为空白对照组。
[0138]图8表明，当20ng/ii L的感染菜豆普通花叶病毒的大豆叶片的总RNA在稀释IO8倍时，按照实施例2的方法采用A体系进行RT-LAMP反应的产物SYBR Green I染色后，还能呈现特异的翠绿色荧光，说明采用实施例2的RT-LAMP方法采用A体系进行检测菜豆普通花叶病毒灵敏性很高。
【权利要求】
1.一组引物，由如下(I) - (4)所示的DNA分子组成:
(1)SEQ ID N0.1 所示的 DNA 分子；
(2)SEQ ID N0.2 所示的 DNA 分子；
(3)SEQ ID N0.3 所示的 DNA 分子；
(4)SEQ ID N0.4 所示的 DNA 分子。
2.一种检测菜豆普通花叶病毒的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的引物、反转录酶和Bst DNA聚合酶； 所述反转录酶为M-MLV反转录酶或AMV反转录酶。
3.—种检测菜豆普通花叶病毒的方法，该方法是以待测样品的总RNA为模板，以权利要求I所述的引物为引物进行逆转录环介导等温核酸扩增，若得到逆转录环介导等温核酸扩增产物，则所述待测样品中候选含有菜豆普通花叶病毒，若得不到逆转录环介导等温核酸扩增产物，则所述待测样品中候选不含有菜豆普通花叶病毒。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于:所述逆转录环介导等温核酸扩增产物是否得到的判断方法为如下(I)和/或(2): (1)将逆转录环介导等温核酸扩增反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，具有弥散状核酸电泳条带的待测样品为含有菜豆普通花叶病毒的样品，不具有弥散状核酸电泳条带的待测样品为不含有菜豆普通花叶病毒的样品； (2)将逆转录环介导等温核酸扩增反应产物与SYBRGreen I反应得反应液，反应液呈翠绿色的待测样品候选为含有菜豆普通花叶病毒的样品，反应液呈橙色的待测样品候选为不含有菜豆普通花叶病毒的样品。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于:所述权利要求1所述的引物中SEQIDN0.1所示的DNA分子和SEQ ID N0.2所示的DNA分子为外引物，SEQ ID N0.3所示的DNA分子和SEQ ID N0.4所示的DNA分子为内引物； 所述外引物中SEQ ID N0.1所示的DNA分子与SEQ ID N0.2所示的DNA分子在所述逆转录环介导等温核酸扩增中的摩尔浓度比为1:1 ; 所述内引物中SEQ ID N0.3所示的DNA分子与SEQ ID N0.4所示的DNA分子在所述逆转录环介导等温核酸扩增中的摩尔浓度比为1:1。 所述外引物与所述内引物在所述逆转录环介导等温核酸扩增中的摩尔浓度比具体为1:5。
6.根据权利要求3-5任一所述的方法，其特征在于:所述逆转录环介导等温核酸扩增中的反应温度为62°C。
7.根据权利要求3-6任一所述的方法，其特征在于:所述逆转录环介导等温核酸扩增中的镁离子浓度为5mM。
8.根据权利要求3-7任一所述的方法，其特征在于:所述逆转录环介导等温核酸扩增的体系如下:
IOXThermopol buffer2.5 u L, SEQ ID N0.1 所示的 DNA 分子 0.2 y M，SEQ ID N0.2 所示的 DNA 分子 0.2 ii M，SEQ ID N0.3 所示的 DNA 分子 1.0 y M，SEQ ID N0.4 所示的 DNA 分子1.0 ii M，dNTPsl.0mM, MgC125mM,反转录酶200U，Bst DNA聚合酶12U，所述待测样品的总RNA40ng,余量为 ddH20，体系 25 y L ;所述IOXThermopol buffer购自纽英伦生物技术(北京)有限公司，产品目录号为M0275 ； 所述反转录酶为M-MLV反转录酶或AMV反转录酶； 所述Bst DNA聚合酶的商品名称为Bst DNApolymerase,购自纽英伦生物技术(北京)有限公司，产品目录号为M0275 ； 所述逆转录环介导等温核酸扩增的反应条件为:62°C等温1h ；80°C 5min。
9.根据权利要求3-8任一所述的方法，其特征在于:所述M-MLV反转录酶购自TaKaRa公司，产品目录号为2641A ； 所述样品具体为待测样品的叶片。
10.权利要求1所述的引物在检测菜豆普通花叶病毒中的应用； 和/或， 权利要求2所述的试剂盒在检测菜豆普通花叶病毒中的应用。
【文档编号】C12R1/94GK103667528SQ201310643147
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月3日 优先权日:2013年12月3日
【发明者】竺晓平, 李刚, 赵黎明 申请人:山东农业大学