神经干细胞来源Exosomes制备及在神经系统疾病中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种神经干细胞来源胞外体（Exosomes）的制备、纯化及鉴定的方法及该胞外体在制备治疗神经系统疾病药物中的应用。该胞外体来源的神经干细胞属悬浮型干细胞，包括鼠神经干细胞以及从间充质干细胞诱导的神经干细胞。其中制备步骤为：无菌条件下，收集3-10代各类型干细胞的完全培养基上清液进行离心，20000g*20min，收集上清液，经0.22μm无菌滤膜过滤除杂，将得到的液体再次离心，120000g*60min，弃上清，取沉淀，得到Exosomes，并运用免疫磁珠法进行纯化处理。Exosomes作为干细胞分泌的一种具有完整胞膜且携带胞质及胞膜中各类活性蛋白及信号分子的囊状小体，可部分或全部发挥神经干细胞的作用，可用于神经系统疾病的治疗。本发明为替代神经干细胞治疗神经系统疾病提供了新的治疗手段与技术支持。
【专利说明】神经干细胞来源Exosomes制备及在神经系统疾病中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及干细胞研究，属表观遗传学、细胞生物学、分子生物学领域及临床应用，具体涉及人脐带间充质干细胞诱导的神经干细胞及大鼠的神经干细胞所分泌、释放的胞外体(Exosomes)的制备、纯化、鉴定方法，以及Exosomes在治疗神经系统疾病中的应用，为替代神经干细胞治疗神经系统疾病提供了新的治疗手段与技术支持。
[0002]
【背景技术】
[0003]神经干细胞(neural stem cell,NSC)是一种终身具有自我更新能力的细胞,其子细胞能分化产生神经系统的各类细胞，干细胞经过不对称分裂产生一个祖细胞和另一个干细胞，祖细胞具有有限的自我更新能力，并自发分化产生成神经元细胞和成胶质细胞等，从而生成神经元及神经胶质细胞。以往认为中枢神经系统的神经元再生于出生前或出生后不久就停止了。近年的一些研究表明成年哺乳动物的脑组织仍然可不断产生新的神经元，并且证实在人脑组织中同样存在神经干细胞。因此，人们对神经系统再生的机理和神经系统疾病的治疗均有新的认识。
[0004]对于神经干细胞具体是如何让发挥作用的，人们根据国内外大量的动物实验和临床实践，推测神经干细胞移植可以通过两种途径进行神经损伤修复:1、移植的神经干细胞可以自我分辨并迁移到损伤的神经部位，通过细胞替代作用更换机体已经死亡或受损伤的神经细胞，修复受损神经网络；2、中枢神经系统(包括脑和脊髓)损伤后，损伤中心周边的大量神经细胞虽然健存，但受到损伤的影响，转入休眠或功能抑制状态。移植的神经干细胞可以分泌大量神经营养因子，激活这些神经细胞，从而改善机体的神经功能。
[0005]我们通过实验发现神经干细胞可以分泌一种胞外体(Exosome)，它直径50—150nm,包裹着神经干细胞内特殊的蛋白质、mRNA、microRNA及DNA碎片等活性物质。与神经干细胞分泌的其他囊泡相比，Exosomes具有更清晰的生物学特性，并且我们通过动物实验证实了由神经干细胞分泌的这种胞外体可发挥神经干细胞功能，对神经元具有刺激修复功能。
[0006]近年来Exosomes生物学特性的研究其来源集中于树突状细胞及肿瘤细胞，神经干细胞来源的Exosomes尚未见报道。本实验室经研究提出Exosomes是神经干细胞发挥治疗作用的核心机制。Exosomes既具有神经干细胞类似的生物学功能，又具有不同于干细胞的众多优点。Exosomes避免了干细胞应用时的生物安全问题(肿瘤，基因污染，感染)、伦理问题、保存和运输问题等。Exosomes离体条件下可在_20°C保存6个月，无潜在毒性，且生物化学活性不受影响；其表面的复合分子为其靶向特定组织及微环境提供了一个潜在的归巢机制；可使治疗性的蛋白质、RNA通过吞噬、食菌、膜融合的方式进入受损细胞；具有足够的潜力参与广泛的生物化学及细胞活性反应。在临床上比干细胞具有更强的应用性，是一种全新的非干细胞的“干细胞”治疗途径。[0007]根据Exosomes结构和功能的特性，通过工艺的改良，可达到“低投入、高产出”的目的。并且我们认为Exosomes可进行人工或半人工的制备，既保留了与干细胞相同的生物学特性与功能，又可对其进行靶向加工，突破干细胞的局限性，制成更加具有临床应用前景且能够替代干细胞治疗的“Super Exosomes”。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供了人源性和鼠源性两种来源的神经干细胞分泌的胞外体(Exosomes)的制备、纯化工艺，并提供了该胞外体在治疗神经系统疾病中的应用。通过动物实验证实了所提取的神经干细胞来源的Exosomes具有类似于神经干细胞的功能，是神经干细胞治疗中发挥作用的核心物质，可作为神经干细胞的替代物治疗神经系统疾病。 [0009]本发明中的要点之一:Exosomes具有源细胞胞膜脂质成分及其表面标记蛋白，不进行代谢，可发挥干细胞类似的功能作用，但又具有不同于细胞的众多优点，是一种介导细胞间信息传递的亚细胞结构信息复合体。
[0010]本发明要点之二 =Exosomes不能够分裂增殖,既是干细胞治疗中发挥作用的核心物质，又无致瘤性，安全性高，易于保存，可成为替代干细胞治疗的治疗手段。
[0011]本发明要点之三:提高干细胞源胞外体的提取率及其活性的维持，从而进行治疗目的规模生产，本发明公开了胞外体的制备、纯化及鉴定方法，具体方法均为现有技术，但整个提取过程，耗时短，产量高，所得胞外体保持了其较高的生物活性，形态结构完整，均一度高。更好地为新的非干细胞的“干细胞”治疗途径提供技术支持。
[0012]本发明提供一种神经干细胞来源的胞外体，该胞外体具有神经干细胞的非特异性成分和神经干细胞内特殊的蛋白质、mRNA、miCix)RNA及DNA碎片等活性物质，是一种亚细胞结构的复合信息体。
[0013]其中，所述胞外体的来源的神经干细胞包括人脐带间充质干细胞诱导的神经干细胞和大鼠神经干细胞。
[0014]其中，所述胞外体含有神经干细胞细胞表面标记⑶133、Nestin，同时包含其自身表面标记⑶63。
[0015]本发明还提供了一种神经干细胞来源的胞外体的制备方法，制备神经干细胞的条件培养基，在4°C条件下配伍使用用超速离心法与微孔滤膜,分离提取胞外体(Exosomes),其具体步骤如下:在无菌条件下，收集3-10代各类型干细胞的完全培养基上清液进行离心，20 000g*20min，收集上清液，经0.22 μπι无菌滤膜过滤除杂，将得到的液体再次离心，120 000g*60min,弃上清,取沉淀,得到 Exosomes。
[0016]其中，所述制备方法还包括纯化步骤，具体为使用免疫磁珠法高效提纯胞外体，对胞外体进行⑶9+、⑶63+、⑶133+亚群的分离。
[0017]额外的，本发明还提供神经干细胞来源的胞外体在制备治疗神经系统疾病药物中的应用，所述胞外体具有完整胞膜且携带胞质及胞膜中各类活性蛋白及信号分子的囊状小体，可部分或全部发挥神经干细胞的作用。
[0018]其中，所述神经系统疾病为大脑中动脉局灶性脑缺血。
[0019]本发明专利的优点:
1.本发明率先提出从神经干细胞中提取Exosomes，既有原代培养，也涉及诱导培养，使Exosomes的来源更加广泛。
[0020]2.本发明中涉及到的神经干细胞来源不同，但其制备纯化方法相似，与传统的差速离心法相比，本专利的提取工艺耗时短，操作简便，产量高，所得胞外体形态结构完整，保持了其较高的生物活性，均一度高。
[0021]3.本发明中Exosomes易于保存运输，其保存时间达6个月以上，避免了干细胞冻存复苏的不便，也为规模制备Exosomes提供技术基础；
4.本发明中Exosomes是一种亚细胞结构的信息复合体，具有归巢作用，其结构与功能决定了其发挥作用时具有较高的安全性(无毒、副作用少)；
5.本发明中Exosomes的制备和应用开辟了一种新型的无创治疗手段，为临床治疗神经系统疾病提供了新方法，进一步为其替代神经干细胞治疗提供技术支持。
[0022]【专利附图】
【附图说明】:
图1 A、人脐带间充质干细胞在诱导为神经干细胞前的细胞形态。可以见到细胞呈成纤维细胞样细胞，形态均匀一致，成漩涡状生长。B、人脐带间充质干细胞在诱导为神经干细胞后的细胞形态。可见细胞呈圆形、椭圆形，有O~2个突起不等，成簇状分布。
[0023]图2大鼠胚胎大脑皮层组织直接原代培养的神经干细胞细胞形态。可见细胞呈圆形、椭圆形，有O~2个突起不等,成簇状分布。
[0024]图3 Exosomes电镜下形态，直径50— 150nm，有完整胞膜，胞内为低电子密度成分，呈圆形或椭圆形的膜性囊泡状结构。
[0025]图4 Western blot检测分析Exosomes表达神经干细胞相关蛋白Nesitin,同时表达CD63分子。
[0026]图5大鼠分别于造模后I天，3天，7天时，采用国际公认的神经功能损伤程度评分(modified neurological severity score, mNSS)进行神经功能缺损评定结果。经过相应的治疗，NSC组与Exosomes组大鼠的神经功能障碍得到改善，其治疗效果基本一致，说明Exosomes能够发挥与神经干细胞类似的作用。
[0027]图6免疫组化观察大鼠第10天大脑海马组织DCX表达。A图为模型组；B图为NSC组；C图为Exosomes。NSC组与Exosomes组之间无明显差异，进一步说明Exosomes能够发挥类似神经干细胞的治疗作用，可应治疗神经系统疾病。
[0028]表1 神经功能损伤程度评分表(modified neurological severity score, mNSS)评分体系主要包括运动试验及平衡木实验。总分为12分，1-3分为轻度损害，4一7分为中度fe咅，8 —12分为重度fe咅。
[0029]
实施例
[0030]实施例1:脐带来源的间充质干细胞诱导分化为神经干细胞
无菌条件下取健康足月剖宫产新生儿脐带于4小时之内处理，经磷酸盐溶液(PBS)洗涤并剔除动静脉后，剪碎至直径约f 2mm大小，分装入T-25培养瓶中，加入完全培养基(含10%胎牛血清、200ug/mL青霉素、200ug/mL链霉素的a -MEM培养基)5飞ml，震荡至组织块在培养瓶中分布均匀。于37°C、5%C02细胞培养箱中培养，第4d半量换液，之后每3d换液。当细胞生长到80%融合时进行传代接种(图1-A)。[0031]将P3-P5代的间充质干细胞细胞悬液接种于直径40mm塑料培养皿中，细胞生长达80%~90%融合时开始进行诱导分化.吸弃培养液，PBS轻轻冲洗细胞表面，加入预诱导液DMEM培养基/体积分数为10%的FBS/ 10 ug/LbFGF培养24 h,而后换为诱导液DMEM 培养基 / 2%DMS0/ 6 mmol/ L BME 诱导 4 h。(图 1-B)
实施例2:大鼠神经干细胞培养
无菌条件下取SD大鼠胚胎(孕14 一 16d)大脑皮层组织，D-Hanks液充分漂洗后，在解剖显微镜下剥离脑膜，准确分离海马，用眼科剪将海马剪碎，再转移到DMEM/F12 (1:1)、B27、bFGF、EGF的无血清培养基中，吸管吹打机械分离制作单细胞悬液。每3d半量换液一次，补加细胞因子bFGF、EGF。取状态良好的P3~P5代细胞，当培养的细胞融合率达70%-80%时,用于Exosomes的制备。(图2)
实施例3:超速离心法与滤膜配伍制备胞外体(Exosome)
在无菌条件下，收集3-5代各类型干细胞的完全培养基上清液，于4°C条件下20000g*20min进行离心，弃沉淀，收集上清液，经0.22 μ m无菌滤膜过滤除杂，将得到的滤液再次离心，120 000g*60min,弃上清,用PBS吹打重悬沉淀,收取沉淀悬液,得到Exosomes。
[0032]实施例4:免疫磁珠法进一步纯化Exosomes
①所得Exosomes悬液与PBE孵育液(0.5% BSA,0.08% EDTA PH7.2 PBS，真空抽滤除菌及液体内气体)1:1体积充分混悬，加入一抗(⑶133、Nestin、⑶9、⑶63、⑶81，均为阳性，10~20 μ g/ml终浓度)，4°C孵育30分钟；②将分离柱安装入磁场中，加入0.5ml PBE，在重力作用下自然流尽，以预处理分离柱.将孵育完毕的细胞悬液添加到分离柱中，自然流尽；④以0.5ml PBE加入分离柱中，自然流尽，洗柱一次；?从磁场中取下分离柱，插在试管口上，加入1-2πι1 ΡΒΕ，用针芯用力推尽液体，冲出阳性结合的Exosomes，用PBS洗一次，离心，_80°C保存待用。
[0033]实施例5:Exosomes的鉴定
5.1电镜观察胞外体形态
取6uLExosomes原液悬置均匀后滴加于直径3mm的载样铜网上，室温(24 °C )静置Imin,用滤纸从铜网边缘轻轻吸干液体,滴加2%磷鹤酸溶液(pH6.8)于铜网上，室温负染lmin，滤纸吸干负染液，在白炽灯下烤干，透射电镜下观察。胞外体特征在于:透射电镜下观察神经干细胞来源胞外体，直径50— 150nm，有完整胞膜，胞内为低电子密度成分，呈圆形或椭圆形的膜性囊泡状结构。(图3)
5.2 Western blot 检测 Exosomes 相关蛋白 CD63、Nesitin
配制12 % SDS-PAGE电泳胶，将变性的Exosomes按60ug蛋白总量上样，经85V恒压电泳，再用电转装置经350mA恒流电转2h后，将蛋白转到PVDF膜上。5%脱脂牛奶封闭Ih后，参照各抗体说明书，按一定的稀释比例稀释一抗，4°C孵育过夜:取出后用TBS / T洗膜，IOmin X 3次，用辣根过氧化物酶标记的相应二抗，37 °C孵育30min，孵育结束后用TBST洗膜，IOminX3 次。(图 4)
实施例6:动物实验
6.1实验分组
取Wistar大鼠50只，建立大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型。分为模型组、NSC组、Exosomes组。每组15只,其中有动物死亡,则随机补充。[0034]根据文献采用线栓法制备大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型。大鼠用10%水合氯醒麻醉，大约15min后仰卧位固定,局部备皮、消毒,选择颈正中偏右切口，分离暴露右侧颈总、颈内、颈外动脉。结扎颈内、颈外动脉，右侧颈总动脉剪口，将头端烧成圆钝形直径为
0.28mm的尼龙鱼线插入2cm，大约在大脑中动脉起始端堵塞大脑中动脉，然后将颈总动脉连同尼龙鱼线一起结扎，缝合皮肤。伤口给予碘伏消毒，喷洒链霉素与青霉素注射液防止感染。Ih后将鱼线抽出lcm，大鼠清醒后放回笼中。已苏醒后大鼠左上肢屈曲、行走向左旋转或左侧肢体瘫痪的大鼠为造模成功者经行实验。
[0035]模型组:每只小鼠尾静脉注射生理盐水Iml。
[0036]NSC组:每只小鼠尾静脉注射神经干细胞1*106 /ml ο
[0037]Exosomes组:每只小鼠尾静脉注射Exosomes制剂10ug。
[0038]6.2实验结果 6.2.1实验动物神经功能评分
各实验组大鼠分别于造模后I天，3天，7天时，采用国际公认的神经功能损伤程度评分(modified neurological severity score, mNSS)进行神经功能缺损评定。(表 I)评分体系主要包括运动试验及平衡木实验。总分为12分，I一3分为轻度损害，4一7分为中度损害，8 —12分为重度损害。
[0039]评分结果(见图5)，各组大鼠在第I天、第3天及第7天进行神经功能缺损评分，所得实验数据与模型组比较均有统计学意义(p〈0.05)。提示经过相应的治疗，NSC组与Exosomes组大鼠的神经功能障碍得到改善,其治疗效果基本一致,说明Exosomes能够发挥与神经干细胞类似的作用。
[0040]6.2.2免疫组化观察大鼠脑组织DCX表达
DCX是未成熟神经元的一个标记，DCX阳性表达细胞被认为是神经元前体细胞,我们用DCX阳性表达的细胞作为检测新生神经元的指标。
石蜡切片常规脱蜡至水。0.3%H202水溶液lOmin，灭活内源性过氧化物酶。再用ph6.0的柠檬酸盐抗原修复液高压修复2min。加入羊抗DCX，1:100稀释，40C过夜，PBS洗5min*3次。分别滴加羊抗1〖6，370(:，301^11，？83洗31^11*3次。DAB显色，室温下显色IOmin后蒸馏水洗涤。苏木素轻度复染，盐酸酒精分化，脱水、透明、中性树胶封片。(图6-A、图6-B、图
6-C)
图6是我们观察到的第8天的各组大鼠脑内新生神经细胞改变。我们发现NSC组与Exosomes组新生的神经元显著高于模型组；NSC组与Exosomes组之间无明显差异,进一步说明Exosomes能够发挥类似神经干细胞的治疗作用，可应治疗神经系统疾病。
【权利要求】
1.一种神经干细胞来源的胞外体，其特征在于:所述胞外体具有神经干细胞的非特异性成分和神经干细胞内特殊的蛋白质、mRNA、miCix)RNA及DNA碎片等活性物质，是一种亚细胞结构的复合信息体。
2.根据权利要求1所述的胞外体，其特征在于:所述胞外体的来源的神经干细胞包括人脐带间充质干细胞诱导的神经干细胞和大鼠神经干细胞。
3.如权利要求1一 2所述的胞外体，其特征在于所述胞外体含有神经干细胞细胞表面标记⑶133、Nestin,同时包含其自身表面标记⑶63。
4.如权利要求1一 3所述的胞外体的制备方法，其特征在于:制备神经干细胞的条件培养基，在4°C条件下配伍使用用超速离心法与微孔滤膜，分离提取胞外体(Exosomes)，其具体步骤如下:在无菌条件下，收集3-10代各类型干细胞的完全培养基上清液进行离心，20 000g*20min，收集 上清液，经0.22 μ m无菌滤膜过滤除杂，将得到的液体再次离心，120000g*60min,弃上清,取沉淀,得到Exosomes。
5.如权利要求4所述胞外体的制备方法，其特征在于该制备方法还包括纯化步骤，具体为使用免疫磁珠法高效提纯胞外体，对胞外体进行⑶9+、⑶63+、⑶133+亚群的分离。
6.如权利要求1一 2所述的胞外体在制备治疗神经系统疾病药物中的应用，其特征在于:所述胞外体具有完整胞膜且携带胞质及胞膜中各类活性蛋白及信号分子的囊状小体，可部分或全部发挥神经干细胞的作用。
7.如权利要求6所述的胞外体在制备治疗神经系统疾病药物中的应用，其特征在于:所述神经系统疾病为大脑中动脉局灶性脑缺血。
【文档编号】C12N5/0797GK103740645SQ201310650623
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月6日 优先权日:2013年12月6日
【发明者】田新瑞, 徐文婧, 牛勃, 张霆, 陈彦, 王建华, 周楠, 季成, 杨利军 申请人:山西医科大学