采用胶质类芽孢杆菌生产微生物絮凝剂的方法

采用胶质类芽孢杆菌生产微生物絮凝剂的方法
【专利摘要】本发明属于微生物多糖的制备，特别是指一种采用胶质类芽孢杆菌生产微生物絮凝剂的方法。采用热冲击方法对胶质类芽孢杆菌ACCC10013进行菌种驯化，在含有碳源、氮源和生长因子的无菌发酵培养基内通气培养步骤A中驯化后的胶质类芽孢杆菌ACCC10013，获得含有微生物絮凝剂的发酵液，采用大孔吸附树脂对步骤B中制备的含有微生物絮凝剂的发酵液进行分离，制成微生物絮凝剂。本发明解决了现有技术存在的成本高、絮凝剂的纯度低等问题，具有制备过程工艺成本低、收率高、产品纯度及活性高等优点。
【专利说明】采用胶质类芽孢杆菌生产微生物絮凝剂的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物多糖的制备，特别是指一种采用胶质类芽孢杆菌生产微生物絮凝剂的方法。
【背景技术】[0002]微生物絮凝剂是利用现代生物技术，经过微生物的发酵提取精制等工艺从微生物或其分泌物中制备具有凝聚性的代谢产物，是一种无毒的生物高分子化合物，主要有糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素和DNA以及有絮凝活性的菌体等。微生物絮凝剂具有絮凝范围广，絮凝活性高安全无害无污染等特点，且絮凝剂产生菌的种类多，生长快，易于实现工业化生产。目前絮凝剂一般可分为无机絮凝剂、有机合成高分子絮凝剂和天然有机高分子絮凝剂。无机絮凝剂和有机合成高分子絮凝剂由于其良好的絮凝效果和较低的使用成本而被广泛应用。然而，这些絮凝剂存在着较大的不安全性和潜在的二次污染问题。如无机絮凝剂中的铝离子容易引起老年痴呆症，铁盐絮凝剂对设备有腐蚀作用及易形成某些难絮凝沉淀的化合物；某些有机合成絮凝剂如聚丙烯酰胺等，不易降解，单体致癌，在某些领域已限制或禁止使用。因此，开发一种安全无毒、絮凝活性高、无二次污染的新型絮凝剂对产品的生产工艺改进、人类的健康和环境保护都具有很重要的现实意义。利用微生物絮凝剂代替传统的絮凝剂是水处理发展的一个必然趋势。
[0003]胶质类芽抱杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)ACCC10013在生长过程中产生大量荚膜，荚膜的主要成分为多糖，通过实验证明，此发酵液中多糖可以作为絮凝剂很好地应用于工业水处理、食品等行业。且此絮凝剂的絮凝效果好，成本低。
[0004]目前，传统的微生物絮凝剂的生产方法为筛选絮凝剂产生菌，优化发酵条件，利用醇沉的方法来提纯，传统的醇沉的方法需设立酒精回收装置，进行酒精蒸馏流回收，成本较高，且存在污染，不适合工业化生产。
[0005]利用大孔吸附树脂对多糖粗提物进行脱色和脱蛋白是近年来新发展起来的一种方法。大孔吸附树脂是一类新型的高分子聚合物，它具有物理、化学稳定性高、吸附选择性高、不受无机盐类存在的影响、解吸条件温和、使用周期长、再生简便、成本低等诸多优点。利用大孔树脂的选择性吸附特点将多糖分离出来。利用大孔吸附树脂脱色脱蛋白的最大优点是:其操作条件温和，不会破坏多糖的结构和活性，且能同时去除多糖粗提物中的色素和蛋白等杂质，满足试验要求。采用大孔吸附树脂对微生物絮凝剂进行后处理未见相关报道。

【发明内容】

[0006]本发明的目的在于提供一种采用胶质类芽孢杆菌生产微生物絮凝剂的方法，该方法的成本较低且收率高，所制备的微生物絮凝剂纯度及活性高。
[0007]本发明的整体技术构思是:
[0008]采用胶质类芽孢杆菌生产微生物絮凝剂的方法，包括如下工艺步骤:
[0009]A、采用热冲击方法对胶质类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)ACCCIOO13进行菌种驯化；
[0010]B、在含有碳源、氮源和生长因子的无菌发酵培养基内通气培养步骤A中驯化后的胶质类芽孢杆菌ACCC10013，获得含有微生物絮凝剂的发酵液；
[0011]C、采用大孔吸附树脂对步骤B中制备的含有微生物絮凝剂的发酵液进行分离，制成微生物絮凝剂。
[0012]本发明的具体技术内容还有:
[0013]为便于微生物絮凝剂的生产，提高产品的收率并提高产品的纯度及活性，优选的技术方案是，所述的步骤A包括如下 工艺步骤:
[0014]Al、在无菌条件下将试管斜面中的菌种孢子加入无菌水，振荡洗下孢子制成孢子悬液；
[0015]A2、将装有孢子悬液的无菌容器置于沸水中，均匀加热，1-10分钟后将无菌容器取出并迅速冷却。
[0016]所述的步骤Al中的试管斜面采用高产孢子斜面。
[0017]所述的步骤B中的发酵培养基由如下质量百分含量的组分组成:
[0018]淀粉5%_20%，蔗糖5%_10%，硫酸铵0.5%_2%，磷酸氢二钾1%_2%，三氯化铁
0.01%-0.5%,吐温-800.001%-0.01%，酵母膏 0.1%_3%，余量为自来水，pH=7.5。
[0019]所述的步骤B中的培养条件是:
[0020]
0-12小时通风量1:0.2vvm 温度30-32-C;
13-18小时通风量1: 0.2vvm 30-37°C反复变温培养I小时；
19-26小时通风量l:0.6vvm 温度30-32°C;
27_42小时通风量1:0.4vvm 温度30-32°C，流加吐温-80;
43-60小时通风量1:0.3vvm 温度28_30°C;
[0021]接种量为菌种:无菌发酵培养基的质量比=4%_8%。
[0022]所述的步骤B中的反复变温培养I小时是指在培养进行至15-16小时，升温至350C _37°C培养10分钟，再降温至30°C _32°C培养10分钟，变温培养过程往复循环I小时。
[0023]所述的步骤C中的大孔树脂选用S-8大孔吸附树脂。
[0024]采用大孔吸附树脂对含有微生物絮凝剂的发酵液进行后处理优选的技术方案是，所述的步骤C包括如下工艺步骤:
[0025]Cl、发酵液的固液分离:将步骤B中制备的含有微生物絮凝剂的发酵液进行固液分离；
[0026]C2、树脂的预处理:选用大孔吸附树脂，先用质量百分比为5%HC1溶液浸泡4小时后用蒸懼水冲洗至pH为中性,再用质量百分比为5%Na0H溶液浸泡后后用蒸懼水冲洗至pH为中性，而后用质量百分比为95%的乙醇溶液浸满树脂，最后用蒸馏水充分淋洗洗掉乙醇溶液；
[0027]C3、树脂的吸附
[0028]C3-1:将经预处理的树脂以湿法装入树脂柱中，用去离子水充分淋洗，然后用pH为5-7、浓度为0.005-0.02mol/L的磷酸盐缓冲液以2BV/h_5BV/h的流速进行淋洗，使树脂层析柱达到平衡状态；[0029]C3-2:调节步骤Cl中制备的滤液的pH，使其与步骤C3_l中的磷酸盐缓冲液相等；
[0030]C3-3:将步骤C3-2中调好pH的滤液以lBV/h_4BV/h的流速通过步骤C3-1中达到平衡状态的树脂层析柱，当树脂层析柱吸附IOBV滤液后停止加液；
[0031]C4、微生物絮凝剂的洗脱收集
[0032]C4-1:用 pH=5-7、浓度为 0.005-0.02mol/L 的磷酸盐缓冲液 IBV 以 lBV/h_4BV/h 的流速淋洗步骤C3-3中吸附滤液后的树脂层析柱；
[0033]C4-2:用pH=5-7的磷酸盐+氯化钠缓冲液以lBV/h_4BV/h的流速洗脱树脂层析柱上的絮凝剂，待流出液有絮凝剂出现时开始收集洗脱液，直到絮凝剂经检测被全部洗脱。
[0034]为便于工业化生产，优选且较为常见的技术方案是，所述的步骤A、B之间还包括种子液的制备，其中种子培养基由如下质量百分含量的组分组成:
[0035]淀粉0.5-5g,磷酸氢二钾0.5-5g,蛋白胨0.5_5g，酵母膏0.5_5g，硫酸铵
0.05-0.5g，硫酸镁 0.05-0.5g，蒸馏水 1000ml，琼脂 18g ；
[0036]种子液的制备过程如下:将种子培养基配制完毕后分装克式瓶进行灭菌；将驯化后的菌种进行活化后接种至灭菌后的种子培养基，在温度28-32°C下培养36-60小时。
[0037]所述的种子液的制备中驯化后的菌种活化是在常温下进行，时间为4小时。
[0038]本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于:
[0039]1、本发明所述的方法中采用发酵工艺得到的絮凝剂成分较单一，主要成分为弱酸性多糖，活性基主要为羟基，选择合适的大孔吸附树脂，进行选择性吸附，可达到较好地分离纯化及浓缩效果，工艺收率高，大大缩短了工艺时间，降低了工艺成本，减少了对环境的污染，所得的絮凝剂纯度高，可以用于食品业。
[0040]2、所制备的絮凝剂纯度及活性高，絮凝剂产量最高可达8.lg/ml,絮凝剂的收率可以达到90%以上，絮凝活性可达到95%以上，絮凝剂的纯度至少达到97% (最高可达到99%)。
【具体实施方式】
[0041]以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书作出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
[0042]实施例1
[0043]采用胶质类芽孢杆菌生产微生物絮凝剂的方法，包括如下工艺步骤:
[0044]A、采用热冲击方法对胶质类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)ACCC10013进行菌种驯化；
[0045]B、在含有碳源、氮源和生长因子的无菌发酵培养基内通气培养步骤A中驯化后的胶质类芽孢杆菌ACCC10013，获得含有微生物絮凝剂的发酵液；
[0046]C、采用大孔吸附树脂对步骤B中制备的含有微生物絮凝剂的发酵液进行分离，制成微生物絮凝剂。
[0047]所述的步骤A包括如下工艺步骤:[0048]Al、在无菌条件下将试管斜面中的菌种孢子加入无菌水，振荡洗下孢子制成孢子悬液；
[0049]A2、将装有孢子悬液的无菌容器置于沸水中，均匀加热，1-10分钟后将无菌容器取出并迅速冷却。
[0050]所述的步骤Al中的试管斜面采用高产孢子斜面。
[0051]所述的步骤B中的发酵培养基由如下质量百分含量的组分组成:
[0052]淀粉5%，蔗糖5%，硫酸铵0.5%，磷酸氢二钾1%，三氯化铁0.01%,吐温-800.001%,酵母膏0.1%，余量为自来水，pH=7.5。
[0053]所述的步骤B中的培养条件是:
[0054]
0-12小时通风量1: 0.2vvm 温度3(TC;
13-18小时通风量1: 0.2vvm 30-37°C反复变温培养I小时；
19_26小时通风量1:0.6vvm 温度301:;
27_42小时通风量1:0.4vvm 温度3(TC,流加吐温-80;
43-60小时通风量1:0.3vvm 温度WC;
[0055]接种量为菌种:无菌发酵培养基的质量比=4%_8%。
[0056]所述的步骤B中的反复变温培养I小时是指在培养进行至15-16小时，升温至350C _37°C培养10分钟，再降温至30°C _32°C培养10分钟，变温培养过程往复循环I小时。
[0057]所述的步骤C中的大孔树脂选用S-8大孔吸附树脂。
[0058]采用大孔吸附树脂对含有微生物絮凝剂的发酵液进行后处理优选的技术方案是，所述的步骤C包括如下工艺步骤:
[0059]Cl、发酵液的固液分离:将步骤B中制备的含有微生物絮凝剂的发酵液进行固液分离；
[0060]C2、树脂的预处理:选用大孔吸附树脂，先用质量百分比为5%HC1溶液浸泡4小时后用蒸懼水冲洗至pH为中性,再用质量百分比为5%Na0H溶液浸泡后后用蒸懼水冲洗至pH为中性，而后用质量百分比为95%的乙醇溶液浸满树脂，最后用蒸馏水充分淋洗洗掉乙醇溶液；
[0061]C3、树脂的吸附
[0062]C3-1:将经预处理的树脂以湿法装入树脂柱中，用去离子水充分淋洗，然后用pH为5、浓度为0.005mol/L的磷酸盐缓冲液以2BV/h的流速进行淋洗，使树脂层析柱达到平衡状态；
[0063]C3-2:调节步骤Cl中制备的滤液的pH，使其与步骤C3_l中的磷酸盐缓冲液相等；
[0064]C3-3:将步骤C3-2中调好pH的滤液以lBV/h的流速通过步骤C3-1中达到平衡状态的树脂层析柱，当树脂层析柱吸附IOBV滤液后停止加液；
[0065]C4、微生物絮凝剂的洗脱收集
[0066]C4-1:用pH=5、 浓度为0.005mol/L的磷酸盐缓冲液IBV以lBV/h的流速淋洗步骤C3-3中吸附滤液后的树脂层析柱；[0067]C4-2:用pH=5的磷酸盐+氯化钠缓冲液以lBV/h的流速洗脱树脂层析柱上的絮凝剂，待流出液有絮凝剂出现时开始收集洗脱液，直到絮凝剂经检测被全部洗脱。
[0068]所述的步骤A、B之间还包括种子液的制备，其中种子培养基由如下质量百分含量的组分组成:
[0069]淀粉0.5g,磷酸氢二钾0.5g,蛋白胨0.5g,酵母膏0.5g,硫酸铵0.05g，硫酸镁
0.05g,蒸懼水 1000ml,琼脂 18g。
[0070]种子液的制备过程如下:将种子培养基配制完毕后分装克式瓶进行灭菌；将驯化后的菌种进行活化后接种至灭菌后的种子培养基，在温度28°C下培养36小时。
[0071]所述的种子液的制备中驯化后的菌种活化是在常温下进行，时间为4小时。
[0072]采用如下方法对絮凝剂的活性进行测定:
[0073]在100ml量筒中加入0.5g高岭土悬浊液，5mll% (wt%) CaCl2溶液和2ml待测液，先快速搅拌I分钟，再慢搅5分钟，后静置10分钟，用721分光光度计测定其吸光度，波长选用550nm。以作CaCl2溶液作为对照，通过下面的公式确定絮凝率。
[0074]絮凝率(％)= (A-B ) /A X 100%
[0075]A为对照上清液550nm处的光密度值；B为样品上清液550nm处的光密度值。
[0076]实施例1中絮凝剂产量为8.lg/ml,絮凝剂的收率为92%，絮凝活性为95%，絮凝剂的纯度为97%。
[0077]实施例2
[0078]本实施例与实施例1的区别是:
[0079]所述的步骤B中的发酵培养基由如下质量百分含量的组分组成:
[0080]淀粉20%，蔗糖10%，硫酸铵2%，磷酸氢二钾2%，三氯化铁0.5%，吐温-800.01%,酵母膏3%，余量为自来水，pH=7.5。
[0081]所述的步骤B中的培养条件是:
[0082]
0-12小时通风量1:0.2VVm 温度32°C;
13-18小时通风量1: 0.2vvm 30-37°C反复变温培养I小时；
19-26小时通风量1:0.6vvm 温度32°C;
27_42小时通风量1:0.4vvm 温度32°C,流加吐温-80;
43-60小时通风量l:0.3vvm 温度30。0，
[0083]接种量为菌种:无菌发酵培养基的质量比=4%_8%。
[0084]所述的步骤A、B之间还包括种子液的制备，其中种子培养基由如下质量百分含量的组分组成:
[0085]淀粉5g,磷酸氢二钾5g,蛋白胨5g,酵母膏5g,硫酸铵0.5g,硫酸镁0.5g,蒸懼水 1000ml,琼脂 18g。
[0086]所述的步骤C中的大孔树脂选用S-8大孔吸附树脂。
[0087]采用大孔吸附树 脂对含有微生物絮凝剂的发酵液进行后处理优选的技术方案是，所述的步骤C包括如下工艺步骤:[0088]Cl、发酵液的固液分离:将步骤B中制备的含有微生物絮凝剂的发酵液进行固液分离；
[0089]C2、树脂的预处理:选用大孔吸附树脂，先用质量百分比为5%HC1溶液浸泡4小时后用蒸懼水冲洗至pH为中性,再用质量百分比为5%Na0H溶液浸泡后后用蒸懼水冲洗至pH为中性，而后用质量百分比为95%的乙醇溶液浸满树脂，最后用蒸馏水充分淋洗洗掉乙醇溶液；[0090]C3、树脂的吸附
[0091]C3-1:将经预处理的树脂以湿法装入树脂柱中，用去离子水充分淋洗，然后用pH为7、浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲液以5BV/h的流速进行淋洗，使树脂层析柱达到平衡状态；
[0092]C3-2:调节步骤Cl中制备的滤液的pH，使其与步骤C3_l中的磷酸盐缓冲液相等；
[0093]C3-3:将步骤C3-2中调好pH的滤液以4BV/h的流速通过步骤C3_l中达到平衡状态的树脂层析柱，当树脂层析柱吸附IOBV滤液后停止加液；
[0094]C4、微生物絮凝剂的洗脱收集
[0095]C4-1:用pH=5-7、浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲液IBV以4BV/h的流速淋洗步骤C3-3中吸附滤液后的树脂层析柱；
[0096]C4-2:用pH=7的磷酸盐+氯化钠缓冲液以4BV/h的流速洗脱树脂层析柱上的絮凝剂，待流出液有絮凝剂出现时开始收集洗脱液，直到絮凝剂经检测被全部洗脱。
[0097]本实施例中絮凝剂产量为7.9g/ml,絮凝剂的收率为90%，絮凝活性为96%，絮凝剂的纯度为98%。
[0098]其余技术内容同实施例1。
[0099]实施例3
[0100]本实施例与实施例1的区别在于:
[0101]所述的步骤B中的发酵培养基由如下质量百分含量的组分组成:
[0102]淀粉10%，蔗糖8%，硫酸铵1%，磷酸氢二钾1.5%，三氯化铁0.2%，吐温-800.005%,酵母膏1%，余量为自来水，pH=7.5。
[0103]所述的步骤B中的培养条件是:
[0104]
O-12小时通风量1:0.2VVm 温度30°C;
13-18小时通风量1: 0.2vvm 30-37°C反复变温培养I小时；
19-26小时通风量1:0.6vvm 温度32°C;
27-42小时通风量l:0.4vvm 温度32°C,流加吐温-80;
43-60小时通风量l:0.3vvm 温度30°C;
[0105]所述的步骤A、B之间还包括种子液的制备，其中种子培养基由如下质量百分含量的组分组成:
[0106]淀粉3g,磷酸氢二钾2g,蛋白胨3g,酵母膏3g,硫酸铵0.3g,硫酸镁0.3g,蒸懼水 1000ml,琼脂 18g。[0107]所述的步骤C中的大孔树脂选用S-8大孔吸附树脂。
[0108]采用大孔吸附树脂对含有微生物絮凝剂的发酵液进行后处理优选的技术方案是，所述的步骤C包括如下工艺步骤:
[0109]Cl、发酵液的固液分离:将步骤B中制备的含有微生物絮凝剂的发酵液进行固液分离；
[0110]C2、树脂的预处理:选用大孔吸附树脂，先用质量百分比为5%HC1溶液浸泡4小时后用蒸懼水冲洗至pH为中性,再用质量百分比为5%Na0H溶液浸泡后后用蒸懼水冲洗至pH为中性，而后用质量百分比为95%的乙醇溶液浸满树脂，最后用蒸馏水充分淋洗洗掉乙醇溶液；
[0111]C3、树脂的吸 附
[0112]C3-1:将经预处理的树脂以湿法装入树脂柱中，用去离子水充分淋洗，然后用pH为5.5、浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液以3BV/h的流速进行淋洗，使树脂层析柱达到平衡状态；
[0113]C3-2:调节步骤Cl中制备的滤液的pH，使其与步骤C3-1中的磷酸盐缓冲液相等；
[0114]C3-3:将步骤C3-2中调好pH的滤液以2BV/h的流速通过步骤C3-1中达到平衡状态的树脂层析柱，当树脂层析柱吸附IOBV滤液后停止加液；
[0115]C4、微生物絮凝剂的洗脱收集
[0116]C4-1:用pH=5.5、浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液IBV以2BV/h的流速淋洗步骤C3-3中吸附滤液后的树脂层析柱；
[0117]C4-2:用pH=5.5的磷酸盐+氯化钠缓冲液以2BV/h的流速洗脱树脂层析柱上的絮凝剂，待流出液有絮凝剂出现时开始收集洗脱液，直到絮凝剂经检测被全部洗脱。
[0118]本实施例中絮凝剂产量为8.0g/ml,絮凝剂的收率为93%，絮凝活性为98%，絮凝剂的纯度为99%。
[0119]其余技术内容同实施例1。
[0120]实施例4
[0121]本实施例与实施例1的区别在于:
[0122]所述的步骤B中的发酵培养基由如下质量百分含量的组分组成:
[0123]淀粉18%，蔗糖6%，硫酸铵1.5%，磷酸氢二钾1.8%，三氯化铁0.05%,吐温-800.003%，酵母膏0.8%，余量为自来水，pH=7.5。
[0124]所述的步骤B中的培养条件是:
[0125]
O-12小时通风量1: O-2VVm 温度3rc;
13-18小时通风量1: 0.2vvm 30-37°C反复变温培养I小时；
19-26小时通风量1: 0.6vvm 温度3(TC;
27-42小时通风量1:0.4vvm 温度32V,流加吐温-80;
43-60小时通风量1: 0.3vvm 温度28°C;
[0126]种子培养基由如下质量百分含量的组分组成:[0127]淀粉0.8g,磷酸氢二钾0.8g,蛋白胨lg，酵母膏lg，硫酸铵0.lg，硫酸镁0.1g,蒸懼水1000ml,琼脂18g。
[0128]所述的步骤C中的大孔树脂选用S-8大孔吸附树脂。
[0129]采用大孔吸附树脂对含有微生物絮凝剂的发酵液进行后处理优选的技术方案是，所述的步骤C包括如下工艺步骤:
[0130]Cl、发酵液的固液分离:将步骤B中制备的含有微生物絮凝剂的发酵液进行固液分离；
[0131]C2、树脂的预处理:选用大孔吸附树脂，先用质量百分比为5%HC1溶液浸泡4小时后用蒸懼水冲洗至pH为中性,再用质量百分比为5%Na0H溶液浸泡后后用蒸懼水冲洗至pH为中性，而后用质量百分比为95%的乙醇溶液浸满树脂，最后用蒸馏水充分淋洗洗掉乙醇溶液；
[0132]C3、树脂的吸附
[0133]C3-1:将经预处理的树脂以湿法装入树脂柱中，用去离子水充分淋洗，然后用pH为6.5、浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液以3BV/h的流速进行淋洗，使树脂层析柱达到平衡状态；
[0134]C3-2:调节步骤 Cl中制备的滤液的pH，使其与步骤C3-1中的磷酸盐缓冲液相等；
[0135]C3-3:将步骤C3-2中调好pH的滤液以3BV/h的流速通过步骤C3_l中达到平衡状态的树脂层析柱，当树脂层析柱吸附IOBV滤液后停止加液；
[0136]C4、微生物絮凝剂的洗脱收集
[0137]C4-1:用pH=6.5、浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液IBV以3BV/h的流速淋洗步骤C3-3中吸附滤液后的树脂层析柱；
[0138]C4-2:用pH=6.5的磷酸盐+氯化钠缓冲液以3BV/h的流速洗脱树脂层析柱上的絮凝剂，待流出液有絮凝剂出现时开始收集洗脱液，直到絮凝剂经检测被全部洗脱。
[0139]本实施例中絮凝剂产量为7.8g/ml,絮凝剂的收率为92%，絮凝活性为95%，絮凝剂的纯度为99%。
[0140]其余技术内容同实施例1。
[0141]实施例5
[0142]本实施例同实施例1的区别在于:
[0143]所述的步骤B中的发酵培养基由如下质量百分含量的组分组成:
[0144]淀粉7%，蔗糖8%，硫酸铵0.8%，磷酸氢二钾1.4%，三氯化铁0.4%，吐温-800.008%,酵母膏2%，余量为自来水，pH=7.5。
[0145]所述的步骤B中的培养条件是:
[0146]O-12小时通风量1:0.2VVm 温度31°C;
13-18小时通风量1: 0.2vvm 30-37°C反复变温培养I小时；
19_26小时通风量1:0.6vvm 温度31°C;
27-42小时通风量l:0.4vvm 温度32°C,流加吐温-80;
43-60小时通风量1:0.3vvm 温度3(TC;
[0147]种子培养基由如下质量百分含量的组分组成:
[0148]淀粉4g,磷酸氢二钾4g,蛋白胨3g,酵母膏4g,硫酸铵0.4g,硫酸镁0.4g,蒸懼水 1000ml,琼脂 18g。
[0149]所述的步骤C中的大孔树脂选用S-8大孔吸附树脂。
[0150]采用大孔吸附树脂对含有微生物絮凝剂的发酵液进行后处理优选的技术方案是，所述的步骤C包括如下工艺步骤:
[0151]Cl、发酵液的固液分离:将步骤B中制备的含有微生物絮凝剂的发酵液进行固液分离；
[0152]C2、树脂的预处理:选用大孔吸附树脂，先用质量百分比为5%HC1溶液浸泡4小时后用蒸懼水冲洗至pH为中性,再用质量百分比为5%NaOH溶液浸泡后后用蒸懼水冲洗至pH为中性，而后用质量百分 比 为95%的乙醇溶液浸满树脂，最后用蒸馏水充分淋洗洗掉乙醇溶液；
[0153]C3、树脂的吸附
[0154]C3-1:将经预处理的树脂以湿法装入树脂柱中，用去离子水充分淋洗，然后用pH为6.0、浓度为0.015mol/L的磷酸盐缓冲液以4BV/h的流速进行淋洗，使树脂层析柱达到平衡状态；
[0155]C3-2:调节步骤Cl中制备的滤液的pH，使其与步骤C3-1中的磷酸盐缓冲液相等；
[0156]C3-3:将步骤C3-2中调好pH的滤液以4BV/h的流速通过步骤C3_l中达到平衡状态的树脂层析柱，当树脂层析柱吸附IOBV滤液后停止加液；
[0157]C4、微生物絮凝剂的洗脱收集
[0158]C4-1:用pH=6.0、浓度为0.015mol/L的磷酸盐缓冲液IBV以4BV/h的流速淋洗步骤C3-3中吸附滤液后的树脂层析柱；
[0159]C4-2:用pH=6.0的磷酸盐+氯化钠缓冲液以4BV/h的流速洗脱树脂层析柱上的絮凝剂，待流出液有絮凝剂出现时开始收集洗脱液，直到絮凝剂经检测被全部洗脱。
[0160]本实施例中絮凝剂产量为7.6g/ml,絮凝剂的收率为93%，絮凝活性为96%，絮凝剂的纯度为99%。
[0161]其余技术内容同实施例1。
【权利要求】
1.采用胶质类芽孢杆菌生产微生物絮凝剂的方法，其特征在于包括如下工艺步骤: A、采用热冲击方法对胶质类芽孢杆菌ACCC10013进行菌种驯化； B、在含有碳源、氮源和生长因子的无菌发酵培养基内通气培养步骤A中驯化后的胶质类芽孢杆菌ACCC10013，获得含有微生物絮凝剂的发酵液； C、采用大孔吸附树脂对步骤B中制备的含有微生物絮凝剂的发酵液进行分离，制成微生物絮凝剂。
2.根据权利要求1所述的采用胶质类芽孢杆菌生产微生物絮凝剂的方法，其特征在于所述的步骤A包括如下工艺步骤: Al、在无菌条件下将试管斜面中的菌种孢子加入无菌水，振荡洗下孢子制成孢子悬液； A2、将装有孢子悬液的无菌容器置于沸水中，均匀加热，1-10分钟后将无菌容器取出并迅速冷却。
3.根据权利要求2所述的采用胶质类芽孢杆菌生产微生物絮凝剂的方法，其特征在于所述的步骤Al中的试管斜面采用高产孢子斜面。
4.根据权利要求1所述的采用胶质类芽孢杆菌生产微生物絮凝剂的方法，其特征在于所述的步骤B中的发酵培养基由如下质量百分含量的组分组成: 淀粉5%-20%，蔗糖5%-10%，硫酸铵0.5%-2%，磷酸氢二钾1%_2%，三氯化铁0.01%-0.5%，吐温-800.001%-0.01%，酵母膏0.1%_3%，余量为自来水，pH=7.5。
5.根据权利要求1所述的采用胶质类芽孢杆菌生产微生物絮凝剂的方法，其特征在于所述的步骤B中的培养条件是: 0-12小时通风量1:0.2vvm 温度30-32°C; 13-18小时通风量1: 0.2vvm 30-37°C反复变温培养I小时； 19-26小时通风量1:0.6vvm 温度30-32°C; 27-42小时通风量1:0.4vvm 温度30-32°C,流加吐温-80; 43-60小时通风量1:0.3vvm 温度28-30°C; 接种量为菌种:无菌发酵培养基的质量比=4%-8%。
6.根据权利要求5所述的采用胶质类芽孢杆菌生产微生物絮凝剂的方法，其特征在于所述的步骤B中的反复变温培养I小时是指在培养进行至15-16小时，升温至35V -37V培养10分钟，再降温至30°C _32°C培养10分钟，变温培养过程往复循环I小时。
7.根据权利要求1所述的采用胶质类芽孢杆菌生产微生物絮凝剂的方法，其特征在于所述的步骤C中的大孔树脂选用S-8大孔吸附树脂。
8.根据权利要求1或7所述的采用胶质类芽孢杆菌生产微生物絮凝剂的方法，其特征在于所述的步骤C包括如下工艺步骤: Cl、发酵液的固液分离:将步骤B中制备的含有微生物絮凝剂的发酵液进行固液分离； C2、树脂的预处理:选用大孔吸附树脂，先用质量百分比为5%HC1溶液浸泡4小时后用蒸馏水冲洗至PH为中性，再用质量百分比为5%NaOH溶液浸泡后后用蒸馏水冲洗至pH为中性，而后用质量百分比为95%的乙醇溶液浸满树脂，最后用蒸馏水充分淋洗，洗掉乙醇溶液； C3、树脂的吸附 C3-1:将经预处理的树脂以湿法装入树脂柱中，用去离子水充分淋洗，然后用pH为5-7、浓度为0.005-0.02mol/L的磷酸盐缓冲液以2BV/h_5BV/h的流速进行淋洗，使树脂层析柱达到平衡状态； C3-2:调节步骤Cl中制备的滤液的pH，使其与步骤C3-1中的磷酸盐缓冲液相等； C3-3:将步骤C3-2中调好pH的滤液以lBV/h-4BV/h的流速通过步骤C3-1中达到平衡状态的树脂层析柱，当树脂层析柱吸附IOBV滤液后停止加液； C4、微生物絮凝剂的洗脱收集 C4-1:用pH=5-7、浓度为0.005-0.02mol/L的磷酸盐缓冲液IBV以lBV/h_4BV/h的流速淋洗步骤C3-3中吸附滤液后的树脂层析柱； C4-2:用pH=5-7的磷酸盐+氯化钠缓冲液以lBV/h-4BV/h的流速洗脱树脂层析柱上的絮凝剂，待流出液有絮凝剂出现时开始收集洗脱液，直到絮凝剂经检测被全部洗脱。
9.根据权利要求1所述的采用胶质类芽孢杆菌生产微生物絮凝剂的方法，其特征在于所述的步骤A、B之间还包括种子液的制备，其中种子培养基由如下质量百分含量的组分组成: 淀粉0.5-5g，磷酸氢二钾0.5-5g，蛋白胨0.5-5g，酵母膏0.5_5g，硫酸铵0.05_0.5g，硫酸镁0.05-0.5g，蒸馏水1000ml，琼脂18g ； 种子液的制备过程如下:将种子培养基配制完毕后分装克式瓶进行灭菌；将驯化后的菌种进行活化后接种至灭菌后的种子培养基，在温度28-32°C下培养36-60小时。
10.根据权利要求1所述的采用胶质类芽孢杆菌生产微生物絮凝剂的方法，其特征在于所述的种子液的制备中驯化后的菌种活化是在常温下进行，时间为4小时。
【文档编号】C12P19/04GK103642873SQ201310651488
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月5日 优先权日:2013年12月5日
【发明者】章淑艳, 王云鹏, 赵从波, 秦艳梅, 李宾, 李军, 韩韬, 罗同阳, 郑翔, 刘丽娜 申请人:河北省微生物研究所